CN112481308A - 新型性别决定基因hakai、其调控作用及其应用 - Google Patents

新型性别决定基因hakai、其调控作用及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明首次揭示了一种新型的性别调控相关基因――Hakai基因，其编码的蛋白能够通过调控或修饰Sex‑lethal(Sxl)的选择性剪接，控制动物性别决定。Hakai基因作为动物性别决定通路中一个新的成员，对该基因进行调控可以成为改变动物性别的新途径。发明还揭示了Hakai基因作为动物性别调控靶点的应用。

Description

新型性别决定基因HAKAI、其调控作用及其应用
技术领域
本发明属于动物学领域；更具体地，本发明涉及新型性别决定基因HAKAI、其调控作用及其应用。
背景技术
动物雌雄两性在形态、生殖、代谢、及行为等各方面都存在着显著的差异，因此研究性别决定对生殖与发育生物学、生理学和神经科学等都具有重要的意义。此外，性别研究在昆虫中还有着特别重要的应用价值。家蚕是我国重要的经济昆虫，目前我国丝绸行业的总产值高达二千亿元。雄蚕比雌蚕具有更高的抗病性，食桑量少，产丝量高且质量更好，因此专养雄蚕是蚕业生产上的一个重要追求目标。据估计，饲养雄蚕能够使产值提高15％以上。蚊虫是传播登革热、疟疾、和最近爆发的塞卡病毒的载体，因为只有雌蚊吸食血液而传播疾病，一个可能的控制蚊虫的策略是通过遗传改造将雌蚊转变为无害的雄蚊。在农业生产中，通过调控害虫的性别比例能够有效地控制害虫种群。这一切的实现都要求我们对昆虫性别决定的分子机制有着深入的认识。因此，发现新的性别决定基因不仅具有重要的科学意义，同样也具有重要的应用价值。
从摩尔根时代开始，果蝇一直以来都是研究性别决定的主要动物模型之一。与人类和哺乳动物类似，果蝇的性染色体组成为XY型，即雄性为XY而雌性为XX。Sxl是果蝇性别决定的主导基因，在雌性中XX染色体激活Sxl蛋白的表达，而在雄性中，Sxl不被表达。在雌蝇中，Sxl通过选择性剪接(alternative splicing)维持它自己的表达，同时控制下游基因Tra的选择性剪接；而Tra和Tra2一起控制Dsx的选择性剪接。Dsx编码性别特异性的转录因子分别调控雄性和雌性的生长发育。果蝇性别决定是极少数完全建立在选择性剪接级联机制上的信号通路，为我们了解这一重要调控机制提供了极佳的模型。虽然对果蝇性别决定的研究已有90多年的历史，但到目前为止只发现少数几个基因突变会出现改变果蝇性别的表型，说明这一信号通路具有高度的特异性。
申请人实验室前期利用二代转基因RNAi技术筛选并发现了两个果蝇性别决定基因Nito和Xio[Yan,D.等，(2014)A Regulatory Network of Drosophila Germline StemCell Self-Renewal.Developmental Cell,28:459-473]，实验表明Nito和Xio通过调控Sxl的选择性剪接来控制性别决定[Yan,D等(2015)，Spenito is required for sexdetermination in Drosophila melanogaster.PNAS,112(37):11606-11；Guo,J.等(2018)，Xio is a component of the Drosophila sex determination pathway and RNAN6-methyladenosine methyltransferase complex.PNAS,115(14):3674-3679]。
本领域中，还需在以上研究的基础上，以进一步地探索决定动物性别的新基因。
发明内容
本发明的目的在于提供新型性别决定基因HAKAI、其调控作用及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种调控动物性别或动物Sex-lethal(Sxl)基因的选择性剪接的方法，包括：下调动物的Hakai基因的表达或活性，从而增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化，或使Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式；其中所述的Hakai基因包括其同源物，所述Sex-lethal基因包括其同源物。
在一个优选例中，所述的方法中，下调Hakai基因包括：敲除或沉默Hakai的编码基因，或抑制Hakai的活性。
在另一优选例中，所述的方法包括：以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除Hakai的编码基因，以特异性干扰Hakai的编码基因表达的干扰分子来沉默Hakai或以同源重组的方法敲除Hakai编码基因。
在另一优选例中，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除Hakai基因；更佳地，以SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为sgRNA靶序列。
在另一优选例中，通过将SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物序列经退火、延伸、PCR产物回收纯化，再转录成所述的sgRNA。
在另一优选例中，通过采用特异性干扰Hakai基因表达的干扰分子来沉默Hakai基因，从而下调动物的Hakai基因的表达；较佳地，所述的干扰分子是以Hakai基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
在另一优选例中，所述Hakai基因通过调控或修饰Sex-lethal基因的选择性剪接，进而调控动物性别；较佳地，下调所述Hakai基因，使得Sex-lethal基因编码形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式，从而增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化。
在另一优选例中，下调动物的Hakai基因的表达或活性，减少Hakai编码蛋白对于Sex-lethal的mRNA的调控或修饰，从而使得Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式。
在另一优选例中，所述Hakai基因编码的蛋白选自：(a)如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQ ID NO:10所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有(a)多肽功能的多肽；或(d)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:10的片段(包括其短片段的亚型)。
在另一优选例中，所述的动物为昆虫。
在另一优选例中，所述昆虫包括有翅亚纲的昆虫；更佳地，所述昆虫包括双翅目或鳞翅目昆虫；更佳地，所述双翅目昆虫包括果蝇科或蚊科昆虫，所述鳞翅目昆虫包括蚕蛾科昆虫。
在另一优选例中，所述的动物为基因组中含有Hakai基因的动物；更佳地，所述动物基因组中还含有Sex-lethal基因。
在本发明的另一方面，提供Hakai基因的用途，用于作为调控动物性别或动物Sex-lethal基因的选择性剪接的靶向基因；其中所述的Hakai基因包括其同源物，所述Sex-lethal基因包括其同源物。
在本发明的另一方面，提供Hakai基因的下调剂的用途，用于调控动物性别或动物Sex-lethal基因的选择性剪接；较佳地，所述下调剂用于增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化，或使Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式；其中所述的Hakai基因包括其同源物，所述Sex-lethal基因包括其同源物。
在一个优选例中，Hakai下调剂包括但不限于：敲除或沉默Hakai的试剂，抑制Hakai活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰Hakai的编码基因表达的干扰分子，针对Hakai的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂。
在另一优选例中，所述的下调剂为sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸的用途，所述sgRNA靶向于Hakai基因中SEQ ID NO:1所示的靶位点。
在本发明的另一方面，提供一种sgRNA，其靶向于Hakai基因中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；较佳地，通过SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物序列经退火、延伸、PCR产物回收纯化，再转录成所述的sgRNA；所述sgRNA用于增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化，或使Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式。
在本发明的另一方面，提供一种组合物或试剂盒，其中包含所述的sgRNA；其用于增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化，或使Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式。
在本发明的另一方面，提供一种定向选择或鉴定动物性别的方法，包括：鉴定测试动物Hakai的表达或活性，或鉴定测试动物中Hakai对于Sex-lethal的调控或修饰作用：若是该测试动物的Hakai表达或活性低于该类动物的Hakai平均表达值或不表达，或若是该测试动物的Hakai对于Sex-lethal的调控或修饰作用减弱，Sex-lethal基因编码形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式，则其为雄性动物或雄性动物概率高(如高于90％)；其中，所述的Hakai基因包括其同源物。
在本发明的另一方面，提供一种筛选调节动物性别的调节剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到含有Hakai的体系中；较佳地，该体系含有Sex-lethal；(2)检测所述体系中，观测(1)的体系中Hakai的表达或活性；若所述候选物质下调Hakai的表达或活性，或抑制Hakai编码蛋白对于Sex-lethal mRNA的调节，使得Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式；则所述候选物质为增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化的物质；其中，所述的Hakai包括其同源物。
在另一优选例中，所述的动物为基因组中含有Hakai基因或其同源物的动物；较佳地，所述动物基因组中还含有Sex-lethal基因或其同源物；较佳地，所述的动物不包括人。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A Hakai基因结构。Hakai有4个转录本，主要产生长短两种蛋白亚型。sgRNA的位置和序列被标注出来。
图1B、Hakai1和Hakai4突变体中序列的缺失情况。基因组的靶标序列用下划线标记，粗体为PAM序列。下图为Hakai1和Hakai4杂合突变体的测序结果。
图2A、Sxl在雌性和雄性果蝇中有不同的剪接模式，雌性：外显子2-4；雄性，外显子2-3-4。外显子3上面含有终止密码子(stop codon)，箭头表示用于RT-PCR实验的引物。
图2B、从指定基因型的果蝇中提取RNA，通过RT-PCR分析Sxl的剪接情况。在Hakai4和Mettl14SK1突变体雌性中，出现了雄性特异性的剪接条带。其中Mettl14是过去已知的性别决定基因。
图3、在果蝇S2细胞中过表达Hakai-GFP和Nito-mRFP并进行活细胞成像，Hakai-GFP位于细胞核中并与Nito-mRFP共定位。
具体实施方式
本发明首次研究及揭示了一种新型的性别调控相关基因――Hakai基因，其编码的蛋白能够通过调控或修饰Sex-lethal(Sxl)的选择性剪接，控制动物性别决定。Hakai基因作为动物性别决定通路中一个新的成员，对该基因进行调控可以成为改变动物性别的新途径。发明还揭示了Hakai基因作为动物性别调控靶点的应用。
Hakai基因
Hakai编码一个RING结构域E3泛素连接酶，其首先在人类细胞中被鉴定出来，它与钙粘蛋白(E-cadherin)相互结合并导致其泛素化，从而促进E-cadherin的内吞和降解。由于E-cadherin在癌细胞转移，特别是间质转化(epithelial-mesenchymal transition)过程中的关键作用，过去对Hakai的研究主要集中在使用Hakai过表达的细胞系，但Hakai在体内的生物学功能却不清楚，因此具有非常重要的研究意义。
Hakai基因的结构如图1A，其有4个转录本，主要产生长短两种蛋白亚型，其中Hakai-PF(NP_001260593,473个氨基酸)和Hakai-PE(NP_788075，464个氨基酸)为长亚型，Hakai-PA(NP_609993，311个氨基酸)和Hakai-PC(NP_724217，302个氨基酸)为短亚型，Hakai-PF蛋白序列如下(SEQ ID NO:10)。本发明还包括具有与Hakai蛋白相同功能的序列变异形式。
所述的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的Hakai蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO:10所示的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有Hakai蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。
来源于果蝇以外其它物种的与上述Hakai基因或其编码的蛋白序列同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的Hakai的同源物也包括在本发明中。
本发明中，所述的Hakai包括其同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种果蝇的Hakai以及其与Sxl的调控或修饰作用，但是获自其它物种的与果蝇的Hakai高度同源(如具有60％以上，如70％，80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。例如在保守性含有Sxl或其同源物的动物中，若存在与本发明中Hakai具有同源性，特别是高度同源或结构域类似的基因，且也能对Sxl或其同源物产生调控或修饰，那么该基因也应被涵盖在本发明中。
调控方法
基于本发明人的新发现，本发明提供了一种调控动物性别的方法，所述方法包括：下调动物的Hakai基因或其同源物的表达，从而调节动物的性别。
本发明还提供了一种调节动物性别决定基因Sxl的方法，所述方法包括：调节动物的Hakai基因或其同源物的表达，藉由Hakai基因对Sex-lethal的mRNA的调节，调节Sex-lethal的剪接形式。
如本文所用，所述的“动物”是包含/表达Hakai基因或其同源物的动物；较佳地，所述“动物”还表达Sxl基因或其同源物。较佳地，所述的动物为昆虫；较佳地，所述昆虫包括有翅亚纲的昆虫；更佳地，所述昆虫包括双翅目或鳞翅目昆虫；更佳地，所述双翅目昆虫包括果蝇科或蚊科昆虫，所述鳞翅目昆虫包括蚕蛾科昆虫。
应理解，在得知了所述Hakai的功能及其对Sxl的调控或修饰作用后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述Hakai或调节Sxl对Sxl的调控或修饰作用。比如可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低Hakai的表达或使之缺失表达。
一方面，本发明提供了一种增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化或使Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式的方法，包括下调动物的Hakai基因的表达。
本发明中，所述的Hakai蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低Hakai蛋白的活性、降低Hakai蛋白或其编码基因的稳定性、下调Hakai蛋白的表达、减少Hakai蛋白有效作用时间、或抑制Hakai基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调Hakai有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰Hakai基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性编辑Hakai基因的基因编辑试剂，等等。
本发明提供了一种下调动物中Hakai的表达的方法，包括Hakai进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。作为一种更为优选的实施例方式，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除或下调Hakai基因。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，应设计并找到合适的靶位点。
在本发明的实施例中，使用CRISPR/Cas9技术构建了Hakai基因的突变体果蝇，并利用该突变体实现果蝇性别的转化，获得雌蝇向雄蝇转化的表型。一种更为具体的实施方式如下：(1)在Hakai基因的编码区域选择sgRNA的靶点：兼顾BLAST序列分析、基因脱靶效应的实验检测，确定了适合于靶向Hakai基因的靶向位点，最终选取位于Hakai基因编码区靠近编码起始区域的序列ACGTCCGCGCCCGCGAGCCCTGG作为sgRNA；(2)将sgRNA显微注射至nos-Cas9果蝇胚胎中；(3)获得子代Hakai无效突变体(null allele)；(4)分析Hakai突变体中Sxl选择性剪接的情况，证实该突变体出现雌性向雄性的转化。
作为本发明的另一种实施方式，提供了一种下调动物中Hakai的表达的方法，包括：(1)将干扰Hakai表达的干扰分子转入动物细胞、组织、器官，获得转化入所述干扰分子的动物细胞、组织、器官；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的动物细胞、组织、器官再生成动物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了Hakai的动物细胞、组织或器官。所述干扰分子包括但不限于miRNA，siRNA，shRNA等。
本发明的具体实施例中，还进一步研究Hakai的功能，构建了果蝇cDNA文库并克隆了Hakai基因全长，从而确定Hakai蛋白定位在细胞核中，并与以前发现的Nito蛋白共定位。
Hakai基因调控试剂
作为本发明的优选方式，敲除Hakai基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸转入动物中；其中，所述的sgRNA的靶序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。作为本发明的优选方式，通过将SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物序列经退火、延伸、PCR产物回收纯化，再转录成所述的sgRNA。
在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。作为一种选择，所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA。此外，可以体外转录获得携带有启动子的sgRNA。
本发明还提供了用于增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化，或使Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式的试剂盒，所述的试剂盒中包含针对于Hakai基因的、应用于进行C-CRISPR方法操作的sgRNA或能够在体内或体外形成该sgRNA的试剂，例如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物。
其它常用于进行转基因操作的试剂也可被包含在所述的试剂盒中，以方便本领域技术人员使用。此外，所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。
应用
本发明的技术方案可被应用于进行动物性别选择，获得更有经济价值的动物。可以通过下调动物的Hakai基因的表达，从而增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化。
对于与果蝇同属于双翅目昆虫的蚊子，可以通过调控其Hakai基因同源物的表达，有望实现将其改造为无害的雄蚊。
对于与果蝇同属于有翅亚目的蚕，可以通过调控其Hakai基因同源物的表达，有望实现将其改造为抗病性强、食桑量少，产丝量高且质量更好的雄蚕。
在得知了Hakai基因的功能及其对于Sxl的剪接形式的影响以后，可以通过这一调节机制或以Hakai基因为分子标记物，来进行动物性别的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控动物性别的物质或潜在物质。
以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。
经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于Hakai，或作用于Hakai与Sxl相互机制的、对动物性别有调控作用的潜在物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、Hakai基因结构分析及靶向分子的设计
本发明人分析了Hakai基因的结构，如图1A。Hakai有4个转录本，主要产生长短两种蛋白亚型，其中Hakai-PF(NP_001260593)和Hakai-PE(NP_788075)为长亚型，Hakai-PA(NP_609993)和Hakai-PC(NP_724217)为短亚型。
Hakai-RF(NP_001260593)蛋白序列如下(SEQ ID NO:10)：
MDTEEVKRGRGRGRGTRARGRGRGRGRGRGKKIDDSSIADAAALAASSCAALEDSPGRLDASEDSVMQELDKDGELETPGALEEPLPHGALGAVAASGNMTPATQQPQVLQQVPPPVMSQTTISLSLARAVDMEADISQLEAPTFTTLSRGPPEPMLRLKWNHKVSLIGEKVLNPMIHCCDQCDKPILVYGRMIPCKHVFCLKCARAEPIKSCPRCTDKVLRVEQSGLGTVFMCTHGGSRYGSSGCRRTYLSQRDLQAHINHRHVAPQPPPLQPQPQLSAMAEQPKMTDLGGVGLGLELHKQRKLSESSVPISVSASIASRPVLSRLPLTGGVGNIGSIGSIPPPGSAAAAQNAIHGGHSTLTLANLTRINNANAQECHQGKASLHHTLKKGTPHQSESVADASYYSSVLASFGSAAGNPGSGPPGGGATAAAQPANPSGSHSAVGPGALIGGSTDAPTGGSSGNWQQSQYYR
为了检测Hakai的功能，本发明人进行了深入研究，兼顾BLAST序列分析、基因脱靶效应的实验检测，确定了适合于靶向Hakai基因的靶向位点，其靶向性理想、脱靶效应低，请见图1A的箭头标示，具体sgRNA靶序列如下：
Figure BDA0002198972540000112
合成针对sgRNA靶序列的CRISPR引物，CRISPR_R的序列为：
AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC(SEQ ID NO:2)；
CRISPR_F的序列为：
GAAATTAATACGACTCACTATAG
Figure BDA0002198972540000111
GTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO:3)。
将上述引物进行退火并加入Phusion酶(New England Biolabs)，进行PCR延伸，产物通过QIAGEN的PCR purification试剂盒纯化。得到的双链DNA使用Megascript T7试剂盒(Ambion)进行体外转录，生成的sgRNA通过苯酚氯仿提取和异丙醇沉淀纯化。
实施例2、将sgRNA显微注射至nos-Cas9果蝇胚胎中
纯化过的sgRNA通过显微注射至nos-Cas9果蝇(Bloomington果蝇中心，54591)胚胎的尾部，注射过的幼虫转移至25℃的食物中继续培养至成虫。
实施例3、检测Hakai突变中序列变化的情况
将注射的果蝇与带CyO平衡子的果蝇进行杂交，通过Insect DNA Kit(Omega)提取子代果蝇的基因组DNA。
制备如下引物：
GCTAAACAAAAACCGAAAAACT(SEQ ID NO:4)；和
CATTCAATAGGGGAGGAGACTC(SEQ ID NO:5)。
采用上述引物进行扩增，产物通过QIAGEN的Gel purification试剂盒纯化。
使用GCTAAACAAAAACCGAAAAACT(SEQ ID NO:11)进行测序。
测序结果显示，多株果蝇出现Hakai基因突变。其中Hakai1和Hakai4的序列缺失导致该基因起始不久就出现移码突变。Hakai1和Hakai4突变体中序列的缺失情况如图1B中上图，基因组的靶标序列用下划线标记，粗体为PAM序列。
Hakai1和Hakai4杂合突变体的测序结果如图1B中下图。
上述结果提示，Hakai1和Hakai4为Hakai的无效突变体(null allele)，因此将基因突变株Hakai1和Hakai4保存下来，以用于后续功能分析。
实施例4、Hakai突变体中Sxl选择性剪接分析
使用TRIzol(ThermoFisher)提取基因突变株Hakai1和Hakai4和对照果蝇成虫总RNA，并通过RNeasy Mini Kit(QIAGEN)纯化。以已知果蝇Mettl14SK1雄性和雌性果蝇作为对照果蝇；yw雄性和雌性是野生型果蝇。
使用Hifair cDNA合成试剂盒(上海翊圣公司)从1μg纯化的RNA产生cDNA。常规PCR使用TaKaRa公司的Taq酶。
所使用的Sx1引物为：
GTGGTTATCCCCCATATGGC(SEQ ID NO:6)；和
GATGGCAGAGAATGGGAC(SEQ ID NO:7)。
如图2A，Sxl在雌性和雄性果蝇中有不同的剪接模式，雌性的剪接模式为外显子2-4；雄性的剪接模式为外显子2-3-4。外显子3上面含有终止密码子(stop codon)，箭头表示用于RT-PCR实验的引物。
从指定基因型的果蝇中提取RNA，通过RT-PCR分析Sxl的剪接情况。如图2B，在Hakai4和Mettl14SK1突变体雌性中，出现了雄性特异性的剪接条带。
这一结果说明，Hakai是控制果蝇性别决定的一个新的基因，Hakai的突变使得动物出现雌性向雄性的转化。
实施例5、克隆Hakai基因以及蛋白共定位研究
1、从cDNA文库中克隆全长Hakai基因
使用TRIzol(ThermoFisher)提取野生型果蝇成虫总RNA，通过TaKaRa公司的cDNAlibrary construction试剂盒构建cDNA文库。
使用Phusion酶(New England Biolabs)从中PCR得到Hakai基因全长，所使用的引物为：
ATGGACACCGAGGAAGTGAA(SEQ ID NO:8)；和
CTATCTGTAGTATTGCGACT(SEQ ID NO:9)。
2、蛋白共定位研究
利用克隆获得的全长Hakai基因序列，插入到pUAST载体中构建过表达Hakai-GFP的重组表达载体。同时，也克隆Nito基因序列(其序列见GeneBank NM_136495.3)，插入到pUAST载体中构建过表达Hakai-mRFP的重组表达载体。将上述获得的重组表达载体共转到果蝇S2细胞进行过表达。
在果蝇S2细胞中过表达Hakai-GFP和Nito-mRFP并进行活细胞成像，如图3，Hakai-GFP位于细胞核中并与Nito-mRFP共定位，暗示Hakai与Nito之间具有相互作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 新型性别决定基因HAKAI、其调控作用及其应用
<130> 195872
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> sgRNA靶序列(sgRNA target sequence)
<400> 1
acgtccgcgc ccgcgagccc tgg 23
<210> 2
<211> 80
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 2
aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt 60
gctatttcta gctctaaaac 80
<210> 3
<211> 64
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 3
gaaattaata cgactcacta taggacgtcc gcgcccgcga gcccgtttta gagctagaaa 60
tagc 64
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 4
gctaaacaaa aaccgaaaaa ct 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 5
cattcaatag gggaggagac tc 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 6
gtggttatcc cccatatggc 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 7
gatggcagag aatgggac 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 8
atggacaccg aggaagtgaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 9
ctatctgtag tattgcgact 20
<210> 10
<211> 473
<212> PRT
<213> 果蝇(Drosophila)
<400> 10
Met Asp Thr Glu Glu Val Lys Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Thr
1 5 10 15
Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Lys Lys
20 25 30
Ile Asp Asp Ser Ser Ile Ala Asp Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ser Ser
35 40 45
Cys Ala Ala Leu Glu Asp Ser Pro Gly Arg Leu Asp Ala Ser Glu Asp
50 55 60
Ser Val Met Gln Glu Leu Asp Lys Asp Gly Glu Leu Glu Thr Pro Gly
65 70 75 80
Ala Leu Glu Glu Pro Leu Pro His Gly Ala Leu Gly Ala Val Ala Ala
85 90 95
Ser Gly Asn Met Thr Pro Ala Thr Gln Gln Pro Gln Val Leu Gln Gln
100 105 110
Val Pro Pro Pro Val Met Ser Gln Thr Thr Ile Ser Leu Ser Leu Ala
115 120 125
Arg Ala Val Asp Met Glu Ala Asp Ile Ser Gln Leu Glu Ala Pro Thr
130 135 140
Phe Thr Thr Leu Ser Arg Gly Pro Pro Glu Pro Met Leu Arg Leu Lys
145 150 155 160
Trp Asn His Lys Val Ser Leu Ile Gly Glu Lys Val Leu Asn Pro Met
165 170 175
Ile His Cys Cys Asp Gln Cys Asp Lys Pro Ile Leu Val Tyr Gly Arg
180 185 190
Met Ile Pro Cys Lys His Val Phe Cys Leu Lys Cys Ala Arg Ala Glu
195 200 205
Pro Ile Lys Ser Cys Pro Arg Cys Thr Asp Lys Val Leu Arg Val Glu
210 215 220
Gln Ser Gly Leu Gly Thr Val Phe Met Cys Thr His Gly Gly Ser Arg
225 230 235 240
Tyr Gly Ser Ser Gly Cys Arg Arg Thr Tyr Leu Ser Gln Arg Asp Leu
245 250 255
Gln Ala His Ile Asn His Arg His Val Ala Pro Gln Pro Pro Pro Leu
260 265 270
Gln Pro Gln Pro Gln Leu Ser Ala Met Ala Glu Gln Pro Lys Met Thr
275 280 285
Asp Leu Gly Gly Val Gly Leu Gly Leu Glu Leu His Lys Gln Arg Lys
290 295 300
Leu Ser Glu Ser Ser Val Pro Ile Ser Val Ser Ala Ser Ile Ala Ser
305 310 315 320
Arg Pro Val Leu Ser Arg Leu Pro Leu Thr Gly Gly Val Gly Asn Ile
325 330 335
Gly Ser Ile Gly Ser Ile Pro Pro Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gln
340 345 350
Asn Ala Ile His Gly Gly His Ser Thr Leu Thr Leu Ala Asn Leu Thr
355 360 365
Arg Ile Asn Asn Ala Asn Ala Gln Glu Cys His Gln Gly Lys Ala Ser
370 375 380
Leu His His Thr Leu Lys Lys Gly Thr Pro His Gln Ser Glu Ser Val
385 390 395 400
Ala Asp Ala Ser Tyr Tyr Ser Ser Val Leu Ala Ser Phe Gly Ser Ala
405 410 415
Ala Gly Asn Pro Gly Ser Gly Pro Pro Gly Gly Gly Ala Thr Ala Ala
420 425 430
Ala Gln Pro Ala Asn Pro Ser Gly Ser His Ser Ala Val Gly Pro Gly
435 440 445
Ala Leu Ile Gly Gly Ser Thr Asp Ala Pro Thr Gly Gly Ser Ser Gly
450 455 460
Asn Trp Gln Gln Ser Gln Tyr Tyr Arg
465 470
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 11
gctaaacaaa aaccgaaaaa ct 22

Claims (15)

1.一种调控动物性别或动物Sex-lethal基因的选择性剪接的方法，其特征在于，所述方法包括：下调动物的Hakai基因的表达或活性，从而增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化，或使Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式；其中所述的Hakai基因包括其同源物，所述Sex-lethal基因包括其同源物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，下调Hakai基因包括：敲除或沉默Hakai的编码基因，或抑制Hakai的活性。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，包括：以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除Hakai的编码基因，以特异性干扰Hakai的编码基因表达的干扰分子来沉默Hakai或以同源重组的方法敲除Hakai编码基因。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除Hakai基因；更佳地，以SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为sgRNA靶序列。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过将SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物序列经退火、延伸、PCR产物回收纯化，再转录成所述的sgRNA。
6.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述Hakai基因通过调控或修饰Sex-lethal基因的选择性剪接，进而调控动物性别；较佳地，下调所述Hakai基因，使得Sex-lethal基因编码形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式，从而增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化。
7.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述Hakai基因编码的蛋白选自：(a)如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQ ID NO:10所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有80％以上相同性且具有(a)多肽功能的多肽；或(d)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:10的片段。
8.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述的动物为昆虫；较佳地，所述昆虫包括有翅亚纲的昆虫；更佳地，所述昆虫包括双翅目或鳞翅目昆虫；更佳地，所述双翅目昆虫包括果蝇科或蚊科昆虫，所述鳞翅目昆虫包括蚕蛾科昆虫；较佳地，所述的动物为基因组中含有Hakai基因的动物；更佳地，所述动物基因组中还含有Sex-lethal基因。
9.Hakai基因的用途，用于作为调控动物性别或动物Sex-lethal基因的选择性剪接的靶向基因；其中所述的Hakai基因包括其同源物，所述Sex-lethal基因包括其同源物。
10.Hakai基因的下调剂的用途，用于调控动物性别或动物Sex-lethal基因的选择性剪接；较佳地，所述下调剂用于增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化，或使Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式；其中所述的Hakai基因包括其同源物，所述Sex-lethal基因包括其同源物。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的下调剂为sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸的用途，所述sgRNA靶向于Hakai基因中SEQ ID NO:1所示的靶位点。
12.一种sgRNA，其靶向于Hakai基因中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；较佳地，通过SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物序列经退火、延伸、PCR产物回收纯化，再转录成所述的sgRNA；所述sgRNA用于增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化，或使Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式。
13.一种组合物或试剂盒，其中包含权利要求12所述的sgRNA；其用于增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化，或使Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式。
14.一种定向选择或鉴定动物性别的方法，其特征在于，所述方法包括：鉴定测试动物Hakai的表达或活性，或鉴定测试动物中Hakai对于Sex-lethal的调控或修饰作用：
若是该测试动物的Hakai表达或活性低于该类动物的Hakai平均表达值或不表达，或若是该测试动物的Hakai对于Sex-lethal的调控或修饰作用减弱，Sex-lethal基因编码形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式，则其为雄性动物或雄性动物概率高；其中，所述的Hakai基因包括其同源物。
15.一种筛选调节动物性别的调节剂的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将候选物质加入到含有Hakai的体系中；较佳地，该体系含有Sex-lethal；
(2)检测所述体系中，观测(1)的体系中Hakai的表达或活性；
若所述候选物质下调Hakai的表达或活性，或抑制Hakai编码蛋白对于Sex-lethalmRNA的调节，使得Sex-lethal形成外显子2-外显子3-外显子4的剪接模式；则所述候选物质为增加雄性动物的产生比例或促进动物雌性向雄性的转化的物质；
其中，所述的Hakai包括其同源物。
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GR01 Patent grant
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