CN112480224A - 一类融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体是一类融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白，以及该类融合蛋白的制备方法及其在抗氧化方面的应用。本发明通过重组克隆，将TAT‑PTD的基因编码序列与海洋来源抗氧化蛋白编码序列拼接，构建PTD‑海洋来源抗氧化蛋白原核重组表达载体，将重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，筛选得到表达PTD‑海洋来源抗氧化蛋白的重组菌株，诱导表达后利用亲和层析法纯化获得融合蛋白，方法简单，价格低廉。本发明涉及的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白具有高效的跨膜能力及显著的抗氧化活性，能有效解决蛋白多肽等生物大分子跨膜困难的问题，可应用于抗氧化药物、抗辐射药物、皮肤防护剂的开发。

Description

一类融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一类融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白，该类蛋白的制备方法及其在研制抗氧化、抗辐射等药剂中的应用。
背景技术
海洋是一个高渗、高压、高紫外辐射的特殊环境，其独特的生态环境赋予海洋生物更多高效的生物活性物质，包括抗菌肽、抗氧化蛋白等具有良好开发前景的新功能蛋白。海洋浮游生物生活于4-6米深的海水表层，长期生活在强烈的光辐射环境下。氧化损伤是紫外辐射造成机体损伤的重要机制之一，已有研究表明，浮游生物为避免或减少紫外辐射造成的损害，经过长期适应性选择，在其机体内产生了种类繁多、结构特异、活性强烈的抗氧化活性物质。发达的抗氧化体系在保护细胞和生物体免受紫外辐射损伤中起重要作用，能抵御强紫外线对生物体的辐射，清除辐射所致的自由基。
水母是一种非常典型的海洋浮游生物，我们前期通过发形霞水母触手cDNA文库筛选、重组表达和分离纯化等一系列基因工程技术，获得了一系列高纯度水母来源的抗氧化蛋白，包括发形霞水母硫氧还蛋白(CcTrx1)、发形霞水母过氧化物还原酶(CcPrx4)、发形霞水母超氧化物歧化酶(CcSOD1)。研究发现它们都具有显著的抗氧化活性。尽管如此，由于细胞膜的保护作用，蛋白多肽等生物大分子很难直接进入细胞发挥作用，而机体的氧化损伤主要在细胞内产生，这就极大地限制了海洋来源抗氧化蛋白在抗氧化、抗辐射等药物研制中的应用。
蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)，又称细胞穿膜肽，是一类含有5-30个氨基酸残基的短肽，富含碱性氨基酸，能有效引导与之连接的蛋白和多肽进入细胞，转导速度快，效率高，不影响蛋白和多肽本身的活性，且对细胞无毒性。细胞穿膜肽的低毒性和高穿膜效率，使其在辅助蛋白多肽等生物大分子进入细胞的过程中扮演重要角色，具有非常好的应用前景。
目前，国内外尚无对穿膜肽与海洋来源抗氧化蛋白融合表达的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白及其制备方法。
所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的制备方法：是根据穿膜肽的氨基酸序列，设计其基因编码序列；通过化学合成法获得融合表达穿膜肽与海洋来源抗氧化蛋白的基因编码序列，利用两个酶切位点将融合编码序列连接到pET24a载体上，构建原核重组表达载体；在大肠杆菌中诱导表达后利用亲和层析的方法进行纯化，得到高纯度融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白，即PTD-海洋来源抗氧化蛋白。该方法实施简单，成本低廉，能够使海洋来源抗氧化蛋白高效进入细胞内发挥抗氧化作用。活性检测发现，上述方法获得的融合蛋白具有高效的跨膜能力和显著的抗氧化活性。
本发明的另一目的在于提供一种上述融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白在抗氧化药物、抗辐射药物、皮肤防护剂等研制中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明选择的海洋来源抗氧化蛋白是由本课题组前期自行重组表达的发形霞水母硫氧还蛋白(CcTrx1)、过氧化物还原酶(CcPrx4)及超氧化物歧化酶(CcSOD1)，并已经进行抗氧化活性鉴定。(参考文献：Wang B,Liu G,Wang C,et al.Molecular cloning andfunctional characterization of a Cu/Zn superoxide dismutase from jellyfishCyanea capillata.International journal of biological macromolecules.2020；144:1-8；中国专利文献CN103255113A：一种发形霞水母过氧化物还原酶及其编码基因与应用；中国专利文献CN103232979A：一种发形霞水母硫氧还蛋白及其编码基因与应用)
(1)穿膜肽基因编码序列的设计：目前公开报道过主要有两类穿膜肽序列，其一是来源于人免疫缺陷病毒的TAT-PTD，它是一段含有11个氨基酸残基的短肽(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg，YGRKKRRQRRR)(SEQ ID NO:1)；其二是精氨酸穿膜肽(9R-PTD)；前期研究证明，TAT-PTD重组蛋白的穿膜效率、蛋白活性显著高于9R-PTD，因此本发明选择的是TAT-PTD。根据其氨基酸序列，设计出它的基因编码序列，该序列含有33个碱基：5’-TATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA-3’(SEQ ID NO:2)。
(2)原核重组表达载体的构建：本发明采用化学合成的方式将步骤(1)设计的穿膜肽基因编码序列(SEQ ID NO:2)与发形霞水母抗氧化蛋白编码序列(SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5)融合，序列两端带有特异性酶切位点(NdeI:5’-CATATG-3’，XhoI:5’-CTCGAG-3’)，利用两个酶切位点将融合编码序列连接到pET24a载体上，构建重组表达质粒，并进行测序鉴定。
(3)重组融合蛋白的诱导表达、分离纯化：将步骤(2)构建的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)获得重组工程菌，在最佳诱导表达条件下进行重组融合蛋白的可溶性表达，本发明中重组融合蛋白的分离纯化主要通过表达载体在其N端加上的6个组氨酸标签(His-tag)进行，重组大肠杆菌超声裂解液经镍离子亲和层析纯化后能够得到较为单一的目的条带，蛋白纯度在95％以上。
(4)重组融合蛋白的跨膜能力检测和抗氧化活性测定：本发明采用蛋白质免疫印迹试验(western-blot)以及细胞免疫荧光实验对步骤(3)所获蛋白进行跨膜能力检测，根据蛋白活性特点进行针对性抗氧化活性检测，结果显示该重组融合蛋白具有高效的跨膜能力及显著的抗氧化活性。
本发明涉及的一类融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白是我们首次提出并制备，且具有高效的跨膜能力及显著的抗氧化活性。该类融合蛋白在抗氧化、抗辐射药物研究中具有良好的应用前景。
基于以上目的和技术方案，本发明的第一方面，提供一类融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白，所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。
本发明的第二方面，提供一类如上所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的编码基因，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示。
本发明的第三方面，提供一类如上所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的表达载体或重组菌。
进一步的，所述的表达载体或重组菌为含有如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQID NO:11所示的核苷酸序列的重组表达载体或重组菌。
进一步的，所述的表达载体可采用原核表达载体，也可采用真核表达载体。优选为原核表达载体pET24a。
进一步的，所述的重组菌为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rosetta等。优选大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第四方面，提供一类如上所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(a)克隆如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
(b)构建含有如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的重组表达载体；
(c)用所述的重组表达载体转化大肠杆菌，在大肠杆菌中表达如SEQ ID NO:6、SEQID NO:7或SEQ ID NO:8所示的重组融合蛋白。
进一步的，所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的构建方法，包括以下步骤：
(A)采用化学合成的方式将穿膜肽基因编码序列(SEQ ID NO:2)与发形霞水母抗氧化蛋白编码序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5融合，序列两端带有特异性酶切位点NdeI:5’-CATATG-3’和XhoI:5’-CTCGAG-3’，利用两个酶切位点将融合编码序列连接到pET24a载体上，构建重组表达质粒；
(B)将步骤A构建的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)获得重组工程菌，在大肠杆菌中表达如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的重组融合蛋白。
本发明的第五方面，提供一类如上所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白在制备抗氧化药物、抗辐射药物、或皮肤紫外辐射防护剂中的应用。
本发明的第六方面，提供一类如上所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的编码基因在制备抗氧化药物、抗辐射药物、或皮肤紫外辐射防护剂中的应用。
本发明的第七方面，提供一类如上所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的表达载体或重组菌在制备抗氧化药物、抗辐射药物、或皮肤紫外辐射防护剂中的应用。
进一步的，所述的抗氧化药物为具有一定的抗氧化能力，能够保护机体免受氧化损伤的特定药物，常用的抗氧化类药物包括维生素E、维生素C等。
进一步的，所述的抗辐射药物又称辐射防护，在照射前或照射后早期应用，能减轻电离辐射对全身或局部的损伤，并有助于治疗和恢复损伤的药物
进一步的，所述的皮肤紫外辐射防护剂为以各种方式保护人体皮肤免受紫外辐射损伤的药物
进一步的，所述的应用中，所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白有明显的二硫键还原能力，氧自由基清除能力，过氧化物还原能力，能显著保护DNA抵抗氧化损伤。
射线照射，紫外辐射后会引起机体氧自由基增多，抗氧化物质减少，从而造成机体氧化损伤；而抗氧化能力主要包括：氧自由基清除能力，过氧化物还原能力，二硫键还原能力；本发明的海洋来源抗氧化物质能够提高机体的抗氧化能力，从而抵抗氧化损伤，进而可以预防和治疗射线照射、紫外辐射引起的机体损伤；因此可用于制备抗氧化药物、抗辐射药物、或皮肤紫外辐射防护剂。
本发明优点在于：
本发明选择的穿膜肽是最经典的一种来源于人免疫缺陷病毒的TAT-PTD，它的氨基酸序列为Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。本发明通过重组克隆，将TAT-PTD的基因编码序列与海洋来源抗氧化蛋白编码序列拼接，构建PTD-海洋来源抗氧化蛋白原核重组表达载体，将重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，筛选得到表达PTD-海洋来源抗氧化蛋白的重组菌株，诱导表达后利用亲和层析法纯化获得融合蛋白，方法简单，价格低廉，能够使海洋来源抗氧化蛋白高效进入细胞内发挥抗氧化作用。活性检测发现，本发明获得的融合蛋白具有高效的跨膜能力和显著的抗氧化活性，能有效解决蛋白多肽等生物大分子跨膜困难的问题，可应用于抗氧化药物、抗辐射药物、皮肤防护剂的开发。
附图说明
图1为化学合成的PTD-发形霞水母硫氧还蛋白的全长基因编码序列。其中下划线部分为NdeⅠ和XhoⅠ核酸内切酶序列，阴影部分为TAT-PTD基因编码序列，中间为发形霞水母硫氧还蛋白基因编码序列，序列全长357bp。
图2为本发明中化学合成的PTD-发形霞水母硫氧还蛋白全长基因的酶切结果。M：1kb的核酸分子量Marker；1：酶切产物。
图3为本发明中PTD-发形霞水母硫氧还蛋白诱导表达的SDS-PAGE电泳结果。M：蛋白分子量Marker；1：未诱导的PTD-发形霞水母硫氧还蛋白重组大肠杆菌；2：诱导前的PTD-发形霞水母硫氧还蛋白重组大肠杆菌；3：诱导后的PTD-发形霞水母硫氧还蛋白重组大肠杆菌；4：诱导后的PTD-发形霞水母硫氧还蛋白重组大肠杆菌超声裂解上清；5：诱导后的PTD-发形霞水母硫氧还蛋白重组大肠杆菌超声裂解沉淀。
图4为本发明中重组发形霞水母硫氧还蛋白分离纯化的SDS-PAGE电泳结果。1：诱导后的PTD-发形霞水母硫氧还蛋白重组大肠杆菌超声裂解上清；2：纯化重组蛋白时穿透峰；3：纯化重组蛋白时15％洗脱液下的洗脱峰；4：纯化重组蛋白时30％洗脱液下的洗脱峰。
图5为检测纯化PTD-发形霞水母硫氧还蛋白跨膜能力的western-blot显影图。1：PTD融合蛋白孵育15min；2：PTD融合蛋白孵育30min；3：PTD融合蛋白孵育60min；4：PTD融合蛋白孵育120min；5：无PTD重组蛋白孵育120min；6：PBS空白对照组。
图6为检测纯化PTD-发形霞水母硫氧还蛋白跨膜能力的细胞免疫荧光图。1：PTD融合蛋白孵育15min；2：PTD融合蛋白孵育30min；3：PTD融合蛋白孵育60min；4：PTD融合蛋白孵育120min；5：无PTD重组蛋白孵育120min；6：PBS空白对照组。
图7为图6中各组荧光强度值统计分析结果图。
图8为检测纯化PTD-发形霞水母硫氧还蛋白对胰岛素A、B链间二硫键还原作用能力的曲线图。
图9为检测纯化PTD-发形霞水母硫氧还蛋白对FeCl3造成的DNA氧化损伤保护能力的核酸电泳图。1：质粒，无FeCl3与DTT；2：质粒，仅有FeCl3；3：质粒，仅有DTT；4：质粒，FeCl3+DTT；5：质粒，FeCl3+DTT，1μM重组蛋白；6：质粒，FeCl3+DTT，2μM重组蛋白；7：质粒，FeCl3+DTT，4μM重组蛋白；8：质粒，FeCl3+DTT，6μM重组蛋白。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明(以硫氧还蛋白为例)。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中选用的海洋来源抗氧化蛋白是由本发明前期经过文库筛选鉴定，自行重组表达所获得的发形霞水母硫氧还蛋白(CcTrx1)。
实施例1：设计穿膜肽的基因编码序列
本发明采用来源于人免疫缺陷病毒的TAT-PTD，它是一个含有11个氨基酸残基的短肽，具体氨基酸序列为：
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(SEQ ID NO:1)，通过密码子分析，确定了TAT-PTD的基因编码序列，该序列为33bp长度的碱基序列：
5’-TATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA-3’(SEQ ID NO:2)。
实施例2：原核重组表达载体的构建
本发明采用化学合成的方式将穿膜肽基因编码序列(SEQ ID NO:2)与发形霞水母硫氧还蛋白编码序列(SEQ ID NO:3)融合，并在序列两端设计了特异性酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ，具体序列如SEQ ID NO:9所示(图1)。采用NEB公司(New England Biolabs)的NdeⅠ和XhoⅠ核酸内切酶对DNA合成产物与pET24a质粒分别进行酶切，核酸电泳显示DNA合成产物的酶切产物条带在正确位置(如图2)，约357bp。回收酶切产物，采用NEB公司的T4 DNA连接酶对DNA合成产物与pET24a质粒进行连接反应，将连接反应产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)后涂布于含卡那霉素(100μg/ml)的培养皿上培养15小时。挑取单菌落至含5ml具有(100μg/ml)卡那霉素的LB培养基摇菌培养12小时，经菌液PCR、质粒酶切验证等方法鉴定重组成功后，以T7 Terminator为测序引物对重组质粒进行双向测序，验证克隆的基因为目的基因，说明融合穿膜肽的发形霞水母硫氧还蛋白(以下简称PTD-发形霞水母硫氧还蛋白)重组表达质粒正确构建。
实施例3：PTD-发形霞水母硫氧还蛋白的表达
将测序正确的重组大肠杆菌BL21(DE3)菌液加入含(100μg/ml)卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，250rpm/min摇床培养至OD600为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导。经过诱导条件的摸索后确定重组蛋白的最佳表达条件为：37℃、0.2mM IPTG、150rpm/min下诱导18小时。诱导后离心收集菌体，经SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶电泳)可见在此诱导条件下重组蛋白主要以可溶形式表达，且表达量占总蛋白的50％以上，分子量与预测值(加上His标签后约14.3kDa)相符，如图3所示。
实施例4：PTD-发形霞水母硫氧还蛋白的纯化
本发明中重组蛋白的分离纯化主要通过表达载体在其N端加上的组氨酸标签进行。将诱导后的菌液离心(10 000×g，10min)收集菌体，然后使用结合缓冲液(NaH2PO420mM；NaCl 500mM；咪唑30mM；pH＝7.4)充分重悬菌体，进行超声裂菌，超声裂解液离心(10000×g，10min)后取上清进行纯化。经过纯化条件的摸索，最终采用镍离子亲和层析柱纯化得到高纯度的PTD-发形霞水母硫氧还蛋白。SDS-PAGE电泳(图4)可见目的条件带与预测位置相符，纯度在95％以上，使用的洗脱条件为：70％的结合缓冲液与30％的洗脱缓冲液(洗脱缓冲液配方：NaH2PO4 20mM；NaCl 500mM；咪唑500mM；pH＝7.4)。将获得的高纯度PTD-发形霞水母硫氧还蛋白溶液进一步透析24h，以彻底除去溶液中的盐离子，将透析产物冻干，最终获得单一组份的PTD-发形霞水母硫氧还蛋白冻干粉，储存于-80℃超低温冰箱。
实施例5：PTD-发形霞水母硫氧还蛋白跨细胞膜能力评价
本实施例选用人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞，该细胞能模拟人表皮细胞，具有很好的应用价值。
(1)蛋白免疫印迹实验(Western-blot)法检测跨膜能力
取对数生长期的HaCaT细胞接种至6孔板，培养24h-48h，待每孔细胞数达80％-90％时，在实验组各孔加入PTD-发形霞水母硫氧还蛋白，使其终浓度达4μM，依次孵育15min，30min，60min，120min，阴性对照组加入同样浓度的不含PTD的发形霞水母硫氧还蛋白，空白对照组加入同样体积的PBS(磷酸盐缓冲液)溶液，孵育120min，用预冷的PBS清洗各孔三遍，每次5分钟，保证将培养液和重组融合蛋白彻底洗净。在各孔中加入80μL细胞裂解液，4℃摇晃30min，用细胞刮将细胞彻底刮除收集至离心管，4℃、12 000×g离心15min，取离心后上清液制备western-blot上样液，进行western-blot实验，本实验选用的一抗为能与重组融合蛋白所带His标签结合的小鼠单克隆抗体，二抗为羊抗小鼠辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记抗体，显影后观察记录结果(图5)。结果显示，15min时，PTD重组融合蛋白能够高效地进入细胞，随着孵育时间延长，进入细胞的蛋白量逐渐增加，具有时间依赖性，而阴性对照组中不含PTD的重组蛋白则无法进入细胞。
(2)细胞免疫荧光实验法检测跨膜能力
取对数生长期的HaCaT细胞接种至含有无菌盖玻片的6孔板中，培养24h-48h，使细胞爬片，待盖玻片上细胞数达80％-90％时，在实验组各孔加入PTD-发形霞水母硫氧还蛋白，使其终浓度达4μM，依次孵育15min，30min，60min，120min，阴性对照组加入同样浓度的不含PTD的发形霞水母硫氧还蛋白，空白对照组加入同样体积的PBS溶液，孵育120min。用预冷的PBS清洗各孔三遍，每次5分钟，保证将培养液和重组融合蛋白彻底洗净；接下来各孔加入4％多聚甲醛室温下固定30min，PBS 5min×3次振荡洗涤；加入Triton X-100室温下作用10min使细胞膜通透，PBS 5min×3次振荡洗涤；使用3％BSA(牛血清白蛋白)对细胞进行封闭，时间60min，吸净不清洗；每孔玻片上滴加100μL小鼠His一抗(1：200稀释)，4℃过夜，PBS5min×3次振荡洗涤；加入FITC(异硫氰酸荧光素)荧光二抗(1：500稀释)，室温避光孵育60min，PBS 5min×3次洗涤；荧光显微镜下观察实验结果并拍照记录，并且对荧光强度值进行定量测定，统计分析(如图6、图7)。结果显示，15min时，采用PTD重组融合蛋白处理的细胞内已出现荧光，随着孵育时间延长，荧光强度逐渐增加，荧光强度值与不含PTD的重组蛋白之间有统计学差异，不同孵育时间的荧光强度值也有统计学差异，与上述蛋白免疫印迹实验(Western-blot)结果相一致。
上述两项实验明确了PTD-发形霞水母硫氧还蛋白高效的跨细胞膜能力。
实施例6：PTD-发形霞水母硫氧还蛋白抗氧化能力的检测
(1)二硫键还原能力
取PTD-发形霞水母硫氧还蛋白冻干粉溶于蒸馏水中制备重组融合蛋白溶液，采用胰岛素还原法实验对其二硫键还原能力进行检测。在DTT(二硫苏糖醇)存在的情况下，胰岛素A、B链间的二硫键可以被上述硫氧还蛋白还原而断裂，两链解离，因B链的溶解度较低使反应液变浑浊，在650nm处吸光值明显升高，且PTD-发形霞水母硫氧还蛋白的浓度越高，吸光值上升越快，说明其具有明显的二硫键还原能力。具体实验方法是：首先配制胰岛素反应工作液(1.25mg/ml的牛胰岛素，0.1M PBS，2mM EDTA)，取270μl反应工作液分别加入到96孔板的所有检测孔中，然后往空白对照组加入30μl蒸馏水，样品检测组加入30μl浓度依次为2.5μM、5μM、10μM的PTD-发形霞水母硫氧还蛋白溶液，混合均匀，最后加入终浓度为1mM的DTT溶液启动反应，立即开始每隔1min测定一次A650，根据光吸收值随时间的变化，制作反应曲线图(图8)。结果显示，空白对照组的A650曲线非常平缓，其值接近于零，而各样品检测曲线则有随时间增加而上升的趋势，且浓度越大上升越快，说明PTD-发形霞水母硫氧还蛋白有明显的二硫键还原能力。
(2)保护DNA抵抗氧化损伤能力
金属催化的氧化反应(metal-catalyzed oxidation，MCO)实验已被广泛用于检测抗氧化蛋白保护DNA对抗铁氧化损伤的效果，实验原理是：质粒有超螺旋结构和线性结构两种构象，超螺旋结构在核酸电泳中涌动速度快，而线性结构的质粒涌动速度慢，在受到氧化损伤后，质粒的超螺旋结构被破坏，变成线性结构，核酸电泳时会出现前后两种条带，根据前后条带的深浅就能判断氧化损伤的质粒所占比例，以此来评价抗氧化蛋白保护DNA抵抗铁氧化损伤的效果。具体实验方法是：将PTD-发形霞水母硫氧还蛋白冻干粉溶于蒸馏水中制备重组融合蛋白溶液，按照MCO实验反应体系依次加入。50μL反应体系包含50mM Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液)(pH 7.0)，35μM FeCl3，10mM DTT，1μg超螺旋状态的pET-24a质粒DNA以及不同浓度的PTD-发形霞水母硫氧还蛋白。各样品加入完毕后置于37℃环境孵育2小时，然后取出反应混合物进行DNA纯化，将纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据不同状态质粒的含量评价其对DNA氧化损伤的保护作用(图9)。结果显示，当仅有FeCl3或DTT存在时，pET-24a质粒DNA的超螺旋构象不会被破坏，FeCl3和DTT共同存在时，pET-24a质粒DNA的超螺旋构象完全破坏。随着反应体系中PTD-发形霞水母硫氧还蛋白浓度的增加，切开构象的DNA含量越来越少，直接证实了此重组融合蛋白能显著保护DNA抵抗氧化损伤。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军海军特色医学中心
<120> 一类融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白及其制备方法与应用
<130> /
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
tatggcagga agaagcggag acagcgacga aga 33
<210> 3
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
atggttagag aaattaaaac aaaggctgaa tttgatgaac ttttgaattc cacttcaaac 60
cttattgttg tggatttctt tgcaacatgg tgtggtcctt gcaaaatgat ttcaccaaaa 120
attgaggagt tttccaatac ctatggtgat gtggtttttg tgaaagttga tgtcgataac 180
aatactgaca catcagaagc ctgtggcatc tctgcaatgc caactttcca cttgtacaaa 240
ggtggtaaaa aggttgatga acttgtggga gcaagtgcag ccaagctgga agagttgatt 300
aagagtcata aa 312
<210> 4
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
aaagatgacg agtcttgcag aacatatgct ggaggccaag tttatccaca agagactaaa 60
gttggacttg atcatgcact tcattggagc aaagcactta tttcacagcc agcaccacat 120
tgggaaggaa aagcagttgt taatggggaa ttcaaagacc tgaagctttc tgatttcaaa 180
ggaaaatatc tggtgttttt cttctatcca ctggatttca cttttgtttg tccaactgaa 240
atcatagcat tcagtgacag aattgacgaa ttcaaaaaaa tcaatactga agttgtagca 300
tgctctgttg attctgtgtt cactcattta gcttggataa acacccctcg aaaacaggga 360
ggtcttggca agatgagaat tccacttctt gcagatttga caaaacaaat tgcaaaagac 420
tatggtgttc ttcttgagaa tgaaggcaac actctaagag gtctcttcat aatcgatgac 480
aaaggtgtac tgagacaaat cacgatgaat gatcttccag tgggtcgatc tgtcgacgaa 540
actctaagat tggtgcaagc attccaatac acagataaac atggcgaagt atgtcccgct 600
ggttggaagc caggagctga tacaatcgtt cctgatccaa aagaaaaact gaactacttc 660
cacaagcaga aggaagaaat g 681
<210> 5
<211> 462
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
atggctacat tgaaagcagt gtgtatcttg gttggtgaga aagtgaatgg cgtcgtcaag 60
cttgaacaga caggagatgg accagttcat gttaaaggtg aaataaaagg ccttgctaaa 120
gggcagcatg ggttccacat tcatgaattt ggtgattata ctactggatg tactggcaca 180
ggaagtcatt tcaatccatt caagaagaca catggtgctc ctgaggatga aaacagacat 240
gttggtgatc ttggcaatgt gacagcagat gacaatggag tggcactagt tgatatcact 300
gacagaatga tcaaattaaa tggcccacat tccatcattg ggagagcttt tgtggttcat 360
gctgatgttg atgatcttgg caaaggtggc catgagctca gtcttaccac agggaatgct 420
ggtgcacgtt tagcatgcgg tgtcgttgga atagccaatg cg 462
<210> 6
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Val Arg Glu Ile
1 5 10 15
Lys Thr Lys Ala Glu Phe Asp Glu Leu Leu Asn Ser Thr Ser Asn Leu
20 25 30
Ile Val Val Asp Phe Phe Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile
35 40 45
Ser Pro Lys Ile Glu Glu Phe Ser Asn Thr Tyr Gly Asp Val Val Phe
50 55 60
Val Lys Val Asp Val Asp Asn Asn Thr Asp Thr Ser Glu Ala Cys Gly
65 70 75 80
Ile Ser Ala Met Pro Thr Phe His Leu Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Val
85 90 95
Asp Glu Leu Val Gly Ala Ser Ala Ala Lys Leu Glu Glu Leu Ile Lys
100 105 110
Ser His Lys
115
<210> 7
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Ala Val Gln Val
1 5 10 15
Val Lys Leu Val Val Val Leu Leu Cys Phe Ser Val Val Phe Cys Lys
20 25 30
Asp Asp Glu Ser Cys Arg Thr Tyr Ala Gly Gly Gln Val Tyr Pro Gln
35 40 45
Glu Thr Lys Val Gly Leu Asp His Ala Leu His Trp Ser Lys Ala Leu
50 55 60
Ile Ser Gln Pro Ala Pro His Trp Glu Gly Lys Ala Val Val Asn Gly
65 70 75 80
Glu Phe Lys Asp Leu Lys Leu Ser Asp Phe Lys Gly Lys Tyr Leu Val
85 90 95
Phe Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile
100 105 110
Ile Ala Phe Ser Asp Arg Ile Asp Glu Phe Lys Lys Ile Asn Thr Glu
115 120 125
Val Val Ala Cys Ser Val Asp Ser Val Phe Thr His Leu Ala Trp Ile
130 135 140
Asn Thr Pro Arg Lys Gln Gly Gly Leu Gly Lys Met Arg Ile Pro Leu
145 150 155 160
Leu Ala Asp Leu Thr Lys Gln Ile Ala Lys Asp Tyr Gly Val Leu Leu
165 170 175
Glu Asn Glu Gly Asn Thr Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Asp Lys
180 185 190
Gly Val Leu Arg Gln Ile Thr Met Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser
195 200 205
Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu Val Gln Ala Phe Gln Tyr Thr Asp Lys
210 215 220
His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp Lys Pro Gly Ala Asp Thr Ile
225 230 235 240
Val Pro Asp Pro Lys Glu Lys Leu Asn Tyr Phe His Lys Gln Lys Glu
245 250 255
Glu Met
<210> 8
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Ala Thr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Val Cys Ile Leu Val Gly Glu Lys Val Asn Gly Val Val Lys Leu
20 25 30
Glu Gln Thr Gly Asp Gly Pro Val His Val Lys Gly Glu Ile Lys Gly
35 40 45
Leu Ala Lys Gly Gln His Gly Phe His Ile His Glu Phe Gly Asp Tyr
50 55 60
Thr Thr Gly Cys Thr Gly Thr Gly Ser His Phe Asn Pro Phe Lys Lys
65 70 75 80
Thr His Gly Ala Pro Glu Asp Glu Asn Arg His Val Gly Asp Leu Gly
85 90 95
Asn Val Thr Ala Asp Asp Asn Gly Val Ala Leu Val Asp Ile Thr Asp
100 105 110
Arg Met Ile Lys Leu Asn Gly Pro His Ser Ile Ile Gly Arg Ala Phe
115 120 125
Val Val His Ala Asp Val Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly His Glu Leu
130 135 140
Ser Leu Thr Thr Gly Asn Ala Gly Ala Arg Leu Ala Cys Gly Val Val
145 150 155 160
Gly Ile Ala Asn Ala
165
<210> 9
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
tatggcagga agaagcggag acagcgacga agaatggtta gagaaattaa aacaaaggct 60
gaatttgatg aacttttgaa ttccacttca aaccttattg ttgtggattt ctttgcaaca 120
tggtgtggtc cttgcaaaat gatttcacca aaaattgagg agttttccaa tacctatggt 180
gatgtggttt ttgtgaaagt tgatgtcgat aacaatactg acacatcaga agcctgtggc 240
atctctgcaa tgccaacttt ccacttgtac aaaggtggta aaaaggttga tgaacttgtg 300
ggagcaagtg cagccaagct ggaagagttg attaagagtc ataaa 345
<210> 10
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
tatggcagga agaagcggag acagcgacga agaaaagatg acgagtcttg cagaacatat 60
gctggaggcc aagtttatcc acaagagact aaagttggac ttgatcatgc acttcattgg 120
agcaaagcac ttatttcaca gccagcacca cattgggaag gaaaagcagt tgttaatggg 180
gaattcaaag acctgaagct ttctgatttc aaaggaaaat atctggtgtt tttcttctat 240
ccactggatt tcacttttgt ttgtccaact gaaatcatag cattcagtga cagaattgac 300
gaattcaaaa aaatcaatac tgaagttgta gcatgctctg ttgattctgt gttcactcat 360
ttagcttgga taaacacccc tcgaaaacag ggaggtcttg gcaagatgag aattccactt 420
cttgcagatt tgacaaaaca aattgcaaaa gactatggtg ttcttcttga gaatgaaggc 480
aacactctaa gaggtctctt cataatcgat gacaaaggtg tactgagaca aatcacgatg 540
aatgatcttc cagtgggtcg atctgtcgac gaaactctaa gattggtgca agcattccaa 600
tacacagata aacatggcga agtatgtccc gctggttgga agccaggagc tgatacaatc 660
gttcctgatc caaaagaaaa actgaactac ttccacaagc agaaggaaga aatg 714
<210> 11
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
tatggcagga agaagcggag acagcgacga agaatggcta cattgaaagc agtgtgtatc 60
ttggttggtg agaaagtgaa tggcgtcgtc aagcttgaac agacaggaga tggaccagtt 120
catgttaaag gtgaaataaa aggccttgct aaagggcagc atgggttcca cattcatgaa 180
tttggtgatt atactactgg atgtactggc acaggaagtc atttcaatcc attcaagaag 240
acacatggtg ctcctgagga tgaaaacaga catgttggtg atcttggcaa tgtgacagca 300
gatgacaatg gagtggcact agttgatatc actgacagaa tgatcaaatt aaatggccca 360
cattccatca ttgggagagc ttttgtggtt catgctgatg ttgatgatct tggcaaaggt 420
ggccatgagc tcagtcttac cacagggaat gctggtgcac gtttagcatg cggtgtcgtt 480
ggaatagcca atgcg 495

Claims (10)

1.一类融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白，其特征在于，所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。
2.一类如权利要求1所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示。
3.一类如权利要求1所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的表达载体或重组菌。
4.根据权利要求3所述的表达载体或重组菌，其特征在于，所述的表达载体或重组菌为含有如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的重组表达载体或重组菌。
5.根据权利要求3所述的表达载体或重组菌，其特征在于，所述的表达载体采用原核表达载体或真核表达载体。
6.根据权利要求3所述的表达载体或重组菌，其特征在于，所述的重组菌为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rosetta。
7.一类如权利要求1所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)克隆如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
(b)构建含有如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的重组表达载体；
(c)用所述的重组表达载体转化大肠杆菌，在大肠杆菌中表达如SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8所示的重组融合蛋白。
8.一类如权利要求1所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白在制备抗氧化药物、抗辐射药物、或皮肤紫外辐射防护剂中的应用。
9.一类如权利要求2所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的编码基因在制备抗氧化药物、抗辐射药物、或皮肤紫外辐射防护剂中的应用。
10.一类如权利要求3所述的融合表达穿膜肽的海洋来源抗氧化蛋白的表达载体或重组菌在制备抗氧化药物、抗辐射药物、或皮肤紫外辐射防护剂中的应用。
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黄韵洁等: "TAT介导PRDX5,6蛋白转导防止高糖视网膜周细胞毒性作用", 《国际眼科杂志》, vol. 12, no. 1, 8 January 2012 (2012-01-08), pages 75 - 76 *

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