CN112473500B - 一种基于喷雾辅助的高通量液滴阵列快速制备装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物分析和微制造领域，公开了一种基于喷雾辅助的高通量液滴阵列快速制备装置，自上而下依次包括：气溶胶液滴发生装置，用于对液体进行雾化处理以形成气溶胶液滴，具体是由雾化器与底座衔接而成；气溶胶液滴约束沉降通道，用于约束所述气溶胶液滴的沉降和扩散区域，从而对所述液滴的沉降和收集区域进行控制；液滴收集界面，用于对沉降后得到的液滴进行承接，收集得到液滴阵列。并且可优选通过温差供给组件使液滴在空气中保存至少七天。本发明通过对装置内各组件的设置以及相应的配合工作方式等进行改进，能够有效解决液滴阵列制备、控制及进一步的保存问题，是种喷雾辅助的超高通量液滴阵列的超快形成装置。

Description

一种基于喷雾辅助的高通量液滴阵列快速制备装置

技术领域

本发明属于生物分析和微制造领域，更具体地，涉及一种基于喷雾辅助的高通量液滴阵列快速制备装置，使用该装置可实现高通量液滴阵列快速制备，能实现数秒内百万级液滴的超低成本产生，同时，通过掩膜能够实现空间可控的液滴的选择性制备，能在空气中保存长达十天以上，为形成高通量液滴微环境提供了一种新途径，能广泛应用于微生物培养和筛选、纳米粒子制作和组装、传感器制备以及生物化学检测等微型化高通量应用领域。

背景技术

近几十年来，微型化和高通量化的概念在生物及化学分析领域发展迅速。微型化分析过程不仅能够显著加速分析过程，减少实验样品的消耗，还能高通量化提高筛选的效率。自从20世纪90年代初Manz等人(Manz,A.,Graber,N.and Widmer,H.M.(1990)Miniaturized Total Chemical-Analysis Systems-a Novel Concept for ChemicalSensing.Sensor.Actuat.B-Chem.,1,244-248)首次提出了μTAS的概念以来，微流控芯片由于具有分析速度快、试剂消耗少、微型化、集成化和自动化的优点，已广泛应用于分析化学、合成化学、药物筛选、临床诊断、生物技术、环境检测等领域。其中，液滴技术(dropletsmicroarray)能够将目标物在皮升级液滴中进行高通量的分离、融合和筛选，在细胞筛选、粒子组装、传感器制备以及化学合成等微型化领域应用广泛。目前液滴技术主要根据水相和油相的不相容性，通过微流控通道能够形成油包水液滴，能够构建在单细胞水平上用于分离和检测的高性能微流体液滴平台。然而，液滴微流控技术也面临着一定的局限性：产生液滴的生物芯片加工系统昂贵；液滴存在油相中容易产生污染，操控缺乏灵活性；后续操作(液滴的加样和分选等)过程复杂，需要额外的辅助系统支持，而且难以长期保存，因而其应用范围存在一定的局限性。

近年来，基于浸润性图案化表面改性技术，液体在浸润性图案化表面能够发生非连续去浸润行为，形成较快的形成大量体积及形貌可控的微液滴阵列。液滴微阵列的形状可任意设计，尺寸可降至微米/纳米级别，并且整个过程不需要引入表面活性剂。该液滴微阵列摆脱了传统的水油界面束缚，能够阻止液滴间的物质迁移及融合，为构建高通量液滴和检测等应用提供了新思路。尽管液滴微阵列技术具有许多巨大的优点和应用，但浸润性图案化液滴微阵列装置及方法存在着一些共性的问题，主要包括制造液滴装置及方法过于复杂，界面材料特殊，成本较高；液滴的体积控制缺乏灵活性，加样过程控制复杂等；而浸润性图案化的微小微液滴蒸发显著，这大大阻碍了其广泛的应用。

发明内容

针对现有液滴技术的加工设备昂贵、加工难度大、产生方式复杂和成本高、难以大规模制备、加样和控制操作难和保存时间短等缺陷，本发明的目的在于提供一种基于喷雾辅助的高通量液滴阵列快速制备装置，其中通过对装置内各组件的设置以及相应的配合工作方式等进行改进，与现有技术相比能够有效解决液滴阵列制备、控制和进一步的保存问题，是种喷雾辅助的超高通量液滴阵列的超快形成装置。通过喷雾辅助方式快速生成百万级气溶胶液滴，并通过自由沉降方式在非亲水界面(接触角大于等于60°)上收集，能够快速制备百万级的液滴阵列。该装置及对应的使用该装置制备液滴阵列的方法，具有操作简单、制作简易、成本低廉、无需复杂操作和材料改性等，收集方便，无需用油相包裹液滴，保存时间长等等优势。同时，本发明可利用已商业化的超声雾化片，通过控制喷雾时间，实现对液滴颗粒大小的灵活操作和控制；通过设置沉降掩膜可以实现液滴的图案化分布；可优选通过温差供给组件的辅助，实现对制得液滴阵列的长时间保存(超过7天)。本发明可广泛应用于微生物液滴培养、筛选和微生态模拟、纳米粒子合成和组装、传感器制备、生化检测和化学合成等微型化高通量应用领域。

为实现上述目的，按照本发明，提供了一种基于喷雾辅助的液滴阵列制备装置，其特征在于，自上而下依次包括：

气溶胶液滴发生装置，用于对液体进行雾化处理以形成气溶胶液滴；该气溶胶液滴发生装置是由雾化器与固定底座衔接而成；所述底座上开设有出口，用于向下输出所述气溶胶液滴；

气溶胶液滴约束沉降通道，用于约束所述气溶胶液滴的沉降和扩散区域，并形成液滴扩散沉降通道，从而对所述液滴的沉降和收集区域进行控制；

液滴收集界面，用于对沉降后得到的液滴进行承接，收集得到液滴阵列。

作为本发明的进一步优选，所述雾化器优选选用超声雾化片，所述底座优选安装多个超声雾化片；

在所述气溶胶液滴约束沉降通道的末端还设置有带有预先设计图案的掩膜，该掩膜用于图案化所述液滴收集界面上液滴的收集。

作为本发明的进一步优选，所述掩膜为疏水性掩膜，并含有支撑脚，所述支撑脚用于支撑掩膜使掩膜悬于所述液滴收集界面之上；优选的，所述掩膜的支撑脚的高度不超过1mm。

作为本发明的进一步优选，所述超声雾化片保持水平，其喷雾方向垂直于水平线。

作为本发明的进一步优选，所述底座与所述液滴约束沉降通道通过螺口进行连接，以确保连接处的密封性；所述液滴约束沉降通道是采用透明通道，以便于观察；

优选的，所述底座与所述液滴约束沉降通道均采用塑料材料；

更优选的，所述底座与所述液滴约束沉降通道是由带有瓶盖的塑料瓶制作而成，其中，所述底座是将该塑料瓶的瓶盖开口制成，所述液滴约束沉降通道是将该塑料瓶的瓶体切割瓶底、形成开放通道制作而成。

作为本发明的进一步优选，所述液滴约束沉降通道的末端与所述液滴收集界面之间为无缝衔接，以避免所述气溶胶液滴外漏，影响液滴的粒径分布。

作为本发明的进一步优选，所述液滴约束沉降通道的总高度H不小于所述超声雾化片喷雾距离s的1.2倍，确保液滴在承接面上是自由随机沉降，从而形成粒径分布均匀的液滴阵列。

作为本发明的进一步优选，超声雾化片出雾孔径为5-9微米。

所述不同的液滴尺寸的控制，所述液滴收集界面为接触角不小于60°的光滑界面；

优选的，所述液滴收集界面为光滑透明界面。

作为本发明的进一步优选，所述液滴收集界面为培养皿内底面；所述液滴阵列制备装置还配合设置有温差供给组件，该温差供给组件用于对液滴收集完成后经过密封的培养皿的底面提供温差，使培养皿内底面的温度低于培养皿空腔的温度，从而抑制培养皿内液滴的热蒸发，便于培养皿内液滴的长期保存。

通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，利用自上而下依次设置的液滴发生装置、液滴约束沉降通道和液滴收集界面，通过喷雾发生装置大规模产生pL级的气溶胶液滴，通过自由沉降在收集界面上，并在沉降过程中通过碰撞和融合形成液滴阵列。该液滴阵列可以因为表面张力作用能维持液滴的稳定，从而收集得到液滴阵列。此外，通过镂空掩膜能够实现图案化液滴阵列。另外，可额外通过温差供给组件形成相对低温的液滴保存条件(保存时，对于密封形成的腔体，液滴位置的温度较密封腔中空腔体处的温度低约为2摄氏度)，能够实现液滴在无油相保护的情况下保存七天以上。

本发明中基于喷雾辅助的超高通量液滴阵列快速制备装置，同时也是一种超高通量液滴阵列快速制备和收集装置，用于实现超大规模、大小和组分可控和超低成本的液滴产生。本发明的超高通量液滴阵列制备和收集装置加工简单、成本低廉，摆脱了传统的液滴产生的成本高，保存困难，油相污染等问题，所用材料具有良好的可获得性，产生的液滴阵列具有超高通量，均匀性良好，其粒径大小、成分和空间分布可控性良好，收集和长期保存简单。

具体说来，本发明能够取得以下有益效果：

(1)以采用超声喷雾片为例，采用超声喷雾方式可获得百万级规模的皮升pL气溶胶液体，并将其通过沉降和融合可实现从皮升pL级到纳升级或微升级的液滴阵列的大规模和超快速的制备(使用商业化的超声雾化片，最小可实现皮升pL级；采用其他喷雾方式，如挤压喷雾、电喷雾，基于本发明装置，可以形成纳升级或微升级的液滴，进行较大液滴阵列的制备)；利用表面张力作用实现了液滴阵列在非超亲水界面的有效收集和保存；其制备时长1～2分钟；

(2)本发明可灵活调整出雾孔直径、扩沉降散距离、喷雾时间和沉积时间等系列参数，通过对出雾孔直径、扩沉降散距离、喷雾时间和沉积时间等一系列的优化，可显著改善承接界面上液滴均匀程度，液滴粒径呈现正态分布特点，符合随机碰撞形成机制。雾化片出雾孔径优选为5-9微米，以避免孔径过小情况下限制制备速度和粒径的大小，或孔径过大时喷雾速度过快、不利于液滴的形成和均匀度控制。

(3)基于本发明，通过时间继电器控制喷雾时间可以精准的控制液体喷雾体积；进而控制收集界面上的液滴大小。以喷雾4秒为例，按照10mg/s的喷雾速度，喷雾量在40mg。以超声雾化片出雾孔径为6微米、且液滴约束沉降通道的长度为23cm为例，据测算，加上沉降时间，该装置在90毫米的培养皿上，沉降2分钟内能制备粒径在30微米以上的直径的液滴数为400,000。该高通量液滴阵列的制备方法高于传统的超高通量的微流控油包水液滴(～330,000两分钟，Agresti et al.(2009))；通过增大液滴承接容器的面积，可以进一步扩大液滴生成的规模。

(4)可优选通过掩膜控制液滴选择性沉降，可实现液滴在承接容器上图案化分布。通过多次选择性喷雾能够实现不同的液滴组分的灵活控制。

(5)本发明中的液滴收集界面，其优选是接触角范围为大于60°的光滑界面，能够保持液滴的形状。本发明中的液滴收集界面，可以为光滑透明界面，如实验室常用的细胞培养皿，便于封装保存并能和显微镜联用用于微环境观察。

(6)可优选通过在沉降容器底部添加一个温度控制辅助组件(即，温差供给组件)，能够在室温环境中实现液滴阵列在空气中保存至少七天。例如，液滴产生装置产生的液滴在常用的培养皿等容器中用蜡膜密封后，可配合使用温差供给组件进行保存(当然，在液滴阵列制备过程中，也可将温差供给组件直接设置在液滴收集界面的下方，温差供给组件所提供的温差，对液滴阵列的形成几乎没有影响)。

本发明的百万级液滴阵列的制备装置克服了传统液滴技术的油相束缚和复杂的生产设备等限制，具有通量高、操作简单、易图案化、成本低、保存时间长等特点，为超高通量的液滴阵列的超快速和超低成本制备提供了一种新途径，在多组分生化反应、微环境制备和单细胞或者多细胞微生物高通量培养和功能筛选研究领域将具有广泛的应用前景。

高通量的液滴技术能够实现分析应用，既需要粒径可控，又需要能够稳定的保存。现有的微流控液滴能够实现可控制备，但是技术要求高，特别是需要油相对微液滴进行保护和操作,设备昂贵而且复杂。而喷雾液滴技术具有生产高通量气溶胶特点，常被用于农药喷施或者气溶胶给药，其应用特点都是气溶胶液滴最后逐渐粘连或者蒸发在目标物表面。但是少有用于形成稳定可操作的液滴分析方法，其主要技术难点是喷雾技术产生的气溶胶速度快、产量大，却难以实现气溶胶液滴稳定的收集和长期的保存，可控性较差。与自然界中雾滴在疏水叶片上形成液滴阵列机理相似，本发明采用了非亲水承接界面，不需要对表面做特殊处理，通过液滴的表面张力能够实现高通量的液滴在固体表面的收集；而且优选通过时间继电器能够以秒为单位精确的控制喷雾量(例如出雾孔径为6微米的超声雾化片喷雾1秒，能喷雾出10mg溶液，制备出粒径分布在10微米左右的大规模气溶胶液滴)，进而控制液滴尺寸的控制；而通过设置沉降通道，特别是优选采用较长的沉降通道(沉降通道是喷雾长度至少1.2倍)，使得液滴能够在沉降到承接界面上时通过随机自由落体运动过程形成的，这极大地改善了在沉降表面液滴粒径的均一性；进一步的，出于保存液滴的考虑，在固体表面上形成了液滴，如果不加以保护，在空气中数分钟内就会蒸发消失。传统抑制水汽蒸发的方法是采用油相将液滴进行包裹。这样的液滴虽然保存时间延长到1～2天。但是也极大地增加了液滴后续分析和筛选的操作复杂性和不确定性。本发明可以将液滴收集容器放在水槽上方、距离水面1至2cm。水分蒸发会带走热量，水体温度略低于空气温度，这使得收集容器界面上的液滴温度相比于空气低，从而形成稳定的相对低温梯度。因此，液滴在相对低温环境中，其水蒸气热蒸发极大地被抑制，实现了无油相的液滴在空气中长期保存。这些技术上的改进都将极其容易消失不可控的高通量气溶胶液滴变成了具有可操作性的液滴阵列方法，为实现液滴阵列技术的简化应用提拱了保证。属于微流体液滴操作和控制技术的进步。

总之，本发明装置能够快速产生液滴阵列，可用于实现超大规模液滴阵列的快速制备，为快速高通量地构建溶液微反应体系构建和目标物液滴包裹和阵列化提供一种新的途径，能广泛应用于微生物的分离和高通量功能筛选和生化反应混合和分析等研究领域。

附图说明

图1为本发明的雾化发生装置示意图。图1中的(a)和图1中的(b)均对应固定雾化装置的固定瓶盖，瓶盖中间为放置雾化片的中空孔；图1中的(c)为雾化发生装置，雾化装置优先的选择超声雾化片规格为16mm；图1中的(d)为将雾化片固定安装到开口瓶盖效果图。

图2为本发明的气溶胶约束通道示意图。图2中所示沉降通道的通道上部为螺丝口，与喷雾发生装置吻合，通道总长度H应为喷雾长度s的大于1.2倍。喷雾通道的尺寸(直径和高度)根据不同大小的液滴承接容器要求可以进行多次衔接匹配。

图3为液滴的沉积收集界面容器。容器内表面为接触角不小于60°的光滑界面，如常用的细胞培养皿。

图4为图案化的掩膜。

图5为喷雾发生装置、约束通道和收集培养皿组装示意图。

图6为液滴产生和沉降收集装置流程图。

图7为液滴形成效果图。

图8为液滴粒径分布和喷雾时间之间的关系图；其中，图8中的(a)对应喷雾时间为4s，图8中的(b)对应喷雾时间为10s。

图9为pL液滴添加和液滴组分控制结果图。图9自上而下依次是：一次喷雾、液滴失水、二次喷雾添加。

图10为图案化沉降图。

图11为收集液滴的长期保存水槽环境中的结构示意图和热成像图；其中，图11中的(a)对应结构示意图，图11中的(b)对应热成像图。收集腔室放置在流动水槽中，水汽蒸发使得水源形成稳定的相对低温，使得液滴阵列形成相对的低温，抑制液滴的水汽热蒸发，促进液滴的长期保存。

图12为收集液滴的长期保存在水冷源上方环境中的结构示意图和热成像图；其中，图12中的(a)对应结构示意图，图12中的(b)对应热成像图。带蒸发孔的水杯型容器通过蒸发孔不断的蒸发带走热量，使得收集腔和水杯中间形成一个冷源腔室，使得液滴相对温度低，其热蒸发被极大地抑制而得到保存。

图13为基于本发明得到的液滴列阵在水冷源上方的保存效果图，其中，图13中的(a)对应不同保存时间下的效果图；图13中的(b)对应不同保存时间下的液滴直径统计图，其中横轴对应保存时间(单位：天)，纵轴对应液滴直径(单位：微米)，图标中的三条线自上而下分别对应统计的液滴直径最大值、液滴直径平均值及液滴直径最小值。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

总的来说，本发明中高通量液滴阵列的快速制备装置，包括雾化发生装置、液滴约束通道和液滴收集界面。其中，所述雾化发生装置用于产生微小的气溶胶。液滴沉降约束通道用于约束气溶胶的沉降，防止液滴的蒸发。液滴阵列的收集界面为具有一定疏水性的光滑界面，通过表面张力能够保持液滴的形态稳定。

也就是说，本发明基于超声喷雾辅助的高通量液滴阵列快速制备装置，包括：雾化发生装置和固定台，用于产生气溶胶液滴；和气溶胶液滴约束沉降通道，用于液滴沉降的路径约束，延长沉降时间和保证气溶胶不外泄损失；以及沉降收集界面。可选的，根据实际需要，还可设置沉降掩膜片，用于图案化沉降。

具体的，将雾化发生装置嵌在带孔的塑料盖中，形成固定喷雾头装置。为了防止气溶胶液滴空气中快速地蒸发，构建了一个约束沉降通道将雾滴运动约束在通道内。当液滴喷出后，逐渐分散和沉降。其特征如下：液滴在沉降过程中，受空气阻力会出现喷雾柱形成扩散逐渐变粗，充满整个约束通道。

简易的约束通道优先的采用常见去除底部的500mL塑料瓶。将内嵌喷雾片塑料瓶盖通过螺纹连接沉降通道，即可形成一个完整的喷雾腔室。约束通道设置应该至少1.2倍长于喷雾的直线长度(沉降通道过短，喷雾直接就碰撞在收集界面上，快速融合成大液滴，不利于形成大范围的均匀液滴)，以保证液滴在底部承接容器的自由沉降，能显著地提高液滴粒径的均匀性。液滴的收集界面可采用实验室常用的90mm培养皿(接触角约为80°)，或者是其他的接触角大于60°的容器表面。随着喷雾量的增加，收集界面上液滴尺寸会不断地融合变大。因此，可以通过控制喷雾时间或者多次喷雾来完成液滴大小的控制或者溶液添加。液滴在沉降过程中自由下落，利用含镂空图案的掩膜能够选择性地控制液滴的沉降区域，进而实现液滴的图案化。液滴阵列沉降在收集界面后，将培养皿容器用蜡膜密封，放在水冷源上方或者水槽中保存。

作为示例，如图1所示的雾化片固定底座及本发明所使用的约束通道，可以按如下步骤进行制作：

(1)采用塑料瓶盖，确定圆心后，对塑料进行切割，形成比喷雾片大小略小的圆孔。通过喷雾片上橡胶套环的形变作用，将其嵌入圆孔中实现固定。雾化片安装需与水平面平行，这样其产生的喷雾就会喷出直线然后沉降，尽量减少附着在沉降通道内壁；

(2)约束通道结构的构建；通过水平方向喷雾的方式，确定喷雾的直线长度，按照1.2倍的长度确定约束通道的高度。

(3)确定喷雾和沉降距离后，选取适合高度和直径的约500ml塑料瓶，洗净；

(4)采用橡皮筋箍紧瓶底，沿橡皮筋划线确定要剪掉的瓶底的剪切线；裁剪后，后用细砂纸进行打磨，无明显残缺和突兀部分，能和承接面相切，无明显漏缝。

另外，本发明所使用的气溶胶液滴沉降掩膜，可以按如下步骤进行制作：

(1)采用厚度为1mm的PE塑料板材裁剪为小于承接容器圆片；在其内部区域裁剪出所要沉降的区域图形；

(2)制作约9mm²、厚度为1mm的绝缘胶布或者透明胶布，并将其分散贴在圆片的同侧，用作沉降掩膜的支撑脚。

以下为具体实施例：

实施例1

本实施例中，液滴发生和收集装置由雾化进样口、沉降通道、沉降图案掩膜(即，带有预先设计的沉降图案的掩膜)和收集界面(即，液滴收集界面)四部分组成。

如图1所示，雾化发生装置优先的采用超声雾化片，为了形成均匀而且快速的液滴阵列，选择喷雾出口孔径约为5～9微米较为合适。将其嵌入到在带螺口的瓶盖固定上，通过瓶盖上的螺口与沉降通道的固定和密封，防止喷雾液滴的外泄。本实施例中，沉降通道可以选择玻璃或者塑料的透明材料，以便气溶胶沉降过程观察。优先的选择常见的500ml塑料瓶改装，成本低，容易获得，易加工。将塑料瓶底部剪掉，磨成水平，与收集界面底部接近无缝承接，防止喷雾气溶胶液滴外泄。该沉降通道可以根据喷雾距离设置其长短。

本实施例中，雾化片直径选择为18mm,其出雾口孔径约为6μm，其喷雾直线长度约15cm。其中，喷雾长度，即从喷出口到气溶胶不能成股向前运动为止的长度，是雾化片自身的属性。此时的气溶胶成扩散分散状，让这些随机分散的气溶胶随机运动一段时间后，再在收集界面上进行沉降收集，这样就能够保证各个液滴均匀的长大，确保液滴的均匀性。为了保证形成的液滴阵列的均匀性，本实施例中可以采用至少23cm的沉降通道距离进行装置的组装。这样喷出来的气溶胶会经过一段自由沉降和混合扩散后，能随机碰撞和融合在承接界面上，有利于提高液滴均匀性。

液滴的收集容器采用界面接触角范围不小于60°的容器。实验室常用的塑料培养皿即接触角为约80°，可用于液滴的收集。此外，其他疏水材料表面，如蜡质封口膜(接触角约110°)或者是聚二甲基硅氧烷薄膜(PDMS，接触角约110°)也可。

液滴产生：首先由顶部加入一定体积的液体，覆盖在雾化片的进口处。接通电源，随即电流通过陶瓷片产生高频振动，引起溶液的振动，进而促使部分液滴表面的动能增加，摆脱液体表面张力作用，形成液滴连续喷出。喷出的气溶胶在约束通道中运动和沉降。在飞行过程中，除了垂直向下运动，沉降通道内也会出现局部乱流促使液滴在水平方向上发生扩散，进而在底部会逐渐均匀的分布。据测算，本实施例中液滴的出口为6μm，其形成的气溶胶液滴的最小粒径在6～10μm，其体积约为0.2pL。本实验中，测定雾化片喷雾流量速度为10mg/s。因此，该方法每秒钟可以产生约10⁷个气溶胶液滴。

喷雾结束后，需要等待约1～2min，待瓶内无明显雾气时说明气溶胶液滴基本沉降完成。液滴在接触疏水表面时，因为表面张力作用，液滴阵列会在疏水表面稳定保存。

根据实际需求，为了实现液滴的组分添加，可以采用多次喷雾实现。例如，可以通过一次喷雾先形成一定尺寸的液滴阵列，然后采用第二种溶液进行二次喷雾。该气溶胶液滴通过沉降融合即完成溶液组分的添加和控制。其中，在多次喷雾过程中，可采用沉降掩膜对所加液滴的区域沉降进行限制，这样就能简单的完成气溶胶液滴的图案化添加和控制。

作为示例，本实施例中高通量液滴阵列的制备和收集装置的具体制作工艺流程如下：

(1)雾化发生装置，优先的选择商用的超声雾化片，其出雾孔直径为6μm。雾化片固定安装制作，其流程参见图1，具体的制作过程为：

选取500ml的塑料瓶盖，将其瓶盖中央钻出圆孔，圆孔直径约为18毫米，并将雾化片嵌入瓶盖固定。雾化片跟雾化发生控制芯片相连，接通电源，即可进行喷雾。

(2)约束通道的设计和制作：设计喷雾通道目的是为了保证产生的气溶胶能够防止蒸发和顺着通道进行自由沉降。为了优化液滴的均匀性和适应不同承接容器，可以采用多级沉降塔(不同的沉降通道长度和直径)，对液滴在容器中的沉降间距进行控制。具体而言，其设计高度取决于喷雾片的喷雾长度。本实施例中，为了制作的方便，选取常见500ml塑料瓶，直径为80mm。将其底部切除并打磨平整即可。根据喷雾发生器的喷雾距离，适当调整约束通道的高度，可以提高液滴形成的均匀度。流程示意见图2。

(3)收集容器。为了保证沉降的液滴阵列的稳定性，承装液滴界面的接触角需要不小于60°。本实施例中优先的选择实验室常见的80mm细胞培养皿，其接触角约为80°。也可以在承接容器中采用其他疏水薄膜材料，如PDMS薄膜。喷雾通道底端略小于收集容器，防止喷雾液滴的外泄。容器示意图见图3。

(4)掩膜的制作。掩膜制作选取具有一定硬度的塑料板材，其直径小于收集容器。将所需要的图案化形状在塑料圆板上裁剪出来，并在其一侧添加6～8个、面积约1mm²均匀分布的支撑脚。支撑脚面积越小越好，其高度不宜过高，约1mm。支撑脚高度可根据实际情况灵活调整，当然过高会影响气溶胶液滴图案化沉降的边缘精确度。掩膜示意图见图4。

(5)系统的组装。将含喷雾片的瓶盖通过螺口拧在塑料沉降通道上。然后，将沉降通道放入含有图案化掩膜的培养皿中即可。雾化片通过导线链接电路控制器，喷雾时间控制采用外接的时间继电器。见图5。

(6)液滴的产生。用移液枪吸取一定量(如0.1ml)液体，覆盖在喷雾片的进样口处。接通电源，立即产生喷雾。见图6。

喷出的雾滴通过沉降通道，悬浮在收集板上空，逐渐沉积。观察沉降通道上无明显雾气时(约1min)，沉降完成。根据不同的喷雾体积，其沉降时间不同。液滴形成结果见图7。根据喷雾体积不同，能够形成明显的不同颗粒大小分布的液滴，见图8。据统计，一个80mm直径的培养皿，喷雾4s钟，能产生50万个直径不小于30μm的液滴颗粒。总之，本发明能够快速制备大规模制备液滴阵列。

(7)同时，通过不同溶液进行多次喷雾添加，可以完成pL级的溶液添加。本实施例中，采用浓度为5mg/ml的亚甲基蓝颜料对液滴添加试验进行指示。一次喷雾结束后，等液滴蒸发2分钟后，再次喷雾。结果发现，亚甲基蓝颜料1s喷雾后，粒径大于30微米的液滴中全部出现了明显的颜色变化。见图9。

(8)液滴的图案化。

喷雾过程中，通过控制镂空掩膜的放置位置，能够控制液滴的沉降区域，进而在不同区域得到粒径和组分可控的液滴。本实施例中，将含有长方形窗口的塑料掩膜放置在容器中，取0.1ml溶液加载到喷雾口进行喷雾，形成第一批液滴；然后，将掩膜旋转90°，进行下一轮的喷雾，即可以形成十字架图案的液滴阵列，见图10。通过调控喷雾溶液的组成，即可得到不同组分和粒径梯度的液滴阵列。

(9)液滴的长期保存。本实施例中，液滴长期保存装置由密封的液滴收集容器、水槽组件组成，如图11所示。水槽中的水，例如可以是室温下静置2小时后的水。将收集液滴的培养皿密封好后，放在水槽上方，室温条件下，即可实现长期保存。液滴长期保存主要两方面原因：1)封闭的培养皿，有效的减少水汽的流失；蜡膜密封两次为宜。密封腔室除了蜡质封口膜，也可以根据实验的具体需求选择其他方式，如螺纹密封方式，达到封口目的即可。2)收集腔室放置在水冷源上方，以水槽为例，水槽中的水不断的蒸发，使得水的温度一直低于室温，以保持温度差。收集腔室底部的液滴虽然不与冷源水槽直接接触，但由于热传导，仍然会使液滴温度处于相对低温，与培养皿腔体内的空气保持温度差(收集腔室上部分与环境空气接触，相对温度略高)。因此，液滴在培养皿中处于相对低温，极大地抑制了水蒸气的热蒸发流失过程，进一步有利于超高通量液滴的长期保存。当然，除了直接保存于室温条件下外，实际应用时，还可以配合使用恒温恒湿的培养箱等。

本实施例中采用红外相机对装置中涉及的温梯度进行了表征，结果表明，水槽温度与设置目标温度之间存在约1摄氏度温差，见图11和图12。证明了在培养皿腔室底部能够形成稳定的低温环境。采用显微镜和CCD来定量评价单个液滴的直径大小的变化特点，如图13所示。结果表明，粒径在大于10微米以上范围内液滴培养至少七天之内无显著性差异，在继续培养十天后仍然保存良好。该技术操作简单，成本低廉，极大地克服了微型化生化检测和微生物培养的液滴微阵列技术的液滴保存和长期培养限制，能广泛应用于长时程、高通量的生化检测和微生物功能筛选等研究领域。

上述实施例中对喷雾液滴系统的描述中所采用的具体尺寸或数据仅是实例性的，不构成对本发明的限定，其中的尺寸或数据根据实际需要可以进行具体选择或确认。如喷雾片出口孔径、雾气沉降通道长度和收集容器尺寸和表面接触角性质等。另外，如沉降通道长度、直径、喷雾器类型等均可以根据制备液滴的数量、效率和均匀度等具体需要调整和选择。

上述实施例仅以超声喷雾为例，除了超声喷雾外，还可以采用挤压喷雾或者电喷雾等方式发生器。液滴收集容器(该液滴收集容器含有液滴收集界面)还可以是能够进行密封的密闭容器，例如培养皿采用封口膜进行密封，或者采用其他方式对液滴进行密封保存，防止液滴的蒸发；可采用额外的薄膜承接气溶胶液滴后，再放入培养容器进行保存。用于液滴阵列收集的薄膜，其接触角不小于60°，该薄膜作为液滴收集界面。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种基于喷雾辅助的液滴阵列制备装置在微生物培养或生化反应中的应用，其特征在于，该装置自上而下依次包括：

气溶胶液滴发生装置，用于对液体进行雾化处理以形成气溶胶液滴；该气溶胶液滴发生装置是由雾化器与固定底座衔接而成；所述底座上开设有出口，用于向下输出所述气溶胶液滴；所述雾化器选用超声雾化片；

气溶胶液滴约束沉降通道，用于约束所述气溶胶液滴的沉降和扩散区域，并形成液滴扩散沉降通道，从而对所述液滴的沉降和收集区域进行控制；

液滴收集界面，用于对沉降后得到的液滴进行承接，收集得到液滴阵列；

其中，所述液滴约束沉降通道的末端与所述液滴收集界面之间为无缝衔接，以避免所述气溶胶液滴外漏，影响液滴的粒径分布；

所述液滴约束沉降通道的总高度H不小于所述超声雾化片喷雾距离s的1.2倍，确保液滴在承接面上是自由随机沉降，从而形成粒径分布均匀的液滴阵列；

所述液滴收集界面为培养皿内底面；所述液滴阵列制备装置还配合设置有温差供给组件，该温差供给组件用于对液滴收集完成后经过密封的培养皿的底面提供温差，使培养皿内底面的温度低于培养皿空腔的温度，从而抑制培养皿内液滴的热蒸发，便于培养皿内液滴的长期保存。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述底座安装多个超声雾化片；

在所述气溶胶液滴约束沉降通道的末端还设置有带有预先设计图案的掩膜，该掩膜用于图案化所述液滴收集界面上液滴的收集。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述掩膜为疏水性掩膜，并含有支撑脚，所述支撑脚用于支撑掩膜使掩膜悬于所述液滴收集界面之上。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述掩膜的支撑脚的高度不超过1mm。

5.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述超声雾化片保持水平，其喷雾方向垂直于水平线。

6.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述底座与所述液滴约束沉降通道通过螺口进行连接，以确保连接处的密封性；所述液滴约束沉降通道是采用透明通道，以便于观察。

7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述底座与所述液滴约束沉降通道均采用塑料材料。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述底座与所述液滴约束沉降通道是由带有瓶盖的塑料瓶制作而成，其中，所述底座是将该塑料瓶的瓶盖开口制成，所述液滴约束沉降通道是将该塑料瓶的瓶体切割瓶底、形成开放通道制作而成。

9.如权利要求1所述应用，其特征在于，超声雾化片出雾孔径为5-9微米。

10.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述液滴收集界面为接触角不小于60°的光滑界面。

11.如权利要求10所述应用，其特征在于，所述液滴收集界面为光滑透明界面。

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