CN112469474A - 出血和centhaquin引起的复苏后内皮素受体的变化 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于治疗或预防肾损伤或衰竭的方法和组合物，包括给予内皮素B(ET_B)受体激动剂和/或α₂肾上腺素能剂。

Description

出血和CENTHAQUIN引起的复苏后内皮素受体的变化

相关申请的交叉引用

本申请根据35USC§119(e)要求2018年5月3日提交的美国临时专利申请62/666,675号和2018年5月25日提交的印度申请201841019588号的优先权，其公开内容整体以引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及用于治疗或预防肾损伤或衰竭的方法和组合物，包括给予内皮素B(ET_B)受体激动剂和/或α₂肾上腺素能剂。

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背景技术

出血性休克常因迅速大量出血导致不充分的血液循环、灌注和氧合作用，引起多器官衰竭(Wu等.2009年)。随着出血的发作，可以启动多种补偿机制来保持氧合作用和组织血流。尽管使用静脉内液体进行复苏以恢复循环和氧气输送，但患者仍可能遭受不可逆的血液灌注损失、凝血病、体温过低、酸中毒、免疫抑制、全身性炎症、氧化应激、多器官衰竭和死亡(Acosta等，1998；Jacob和Kumar，2014)。出血性休克导致的死亡通常发生在很早的时候，大部分发生在入院的前6个小时内(Shackford等，1993)。

内皮素(ET)是一种内源性21个氨基酸的肽，大约在三十年前从猪主动脉内皮细胞中分离出来(Yanagisawa等，1988)。共有三种不同的异构肽：ET-1、ET-2和ET-3，它们存在于多种哺乳动物组织中，发挥着多种生理和病理作用，例如调节血压和灌注、凋亡以及细胞增殖和迁移(Ehrenreich等，2000；Inoue等，1989；Vidovic等，2008；Yanagisawa等，1988)。ET肽通过激活G蛋白偶联受体ET_A和ET_B产生生物学效应。(Arai等，1990)。但是，ET-1及其受体不限于血管系统。

发明内容

在一些方面，本公开内容涉及ET_B受体激动剂IRL-1620和肾上腺素能剂centhaquin在治疗急性肾衰竭中的用途。特别是，出乎意料地发现，ET_B受体的过表达或刺激显著增加了肾血液的灌注。

在进一步的方面，本公开内容涉及将ET_B受体的特异性激动剂单独或与centhaquin组合施用于需要其的个体。在一些实施方案中，单独或与centhaquin组合施用ET_B受体激动剂可预防或治疗急性肾损伤。

在一些方面，本公开内容提供了通过向有需要的个体施用治疗有效量的内皮素B(ET_B)受体激动剂来预防或治疗肾损伤或衰竭的方法。在一些实施方案中，ET_B受体激动剂选自由N-琥珀酰-[Glu⁹，Ala^11,15]内皮素1(IRL-1620)、BQ-3020、[Ala^1,3,11,15]-内皮素、角蝰毒素S6c和内皮素3组成的组。在另外的实施方案中，以约0.0001mg/kg至约0.5mg/kg的剂量施用ET_B受体激动剂。在一些实施方案中，该方法包括施用多个剂量的ET_B受体激动剂。在另外的实施方案中，所述施用包括单剂量的ET_B受体激动剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括向个体施用治疗有效量的centhaquin或其盐。

在一些实施方案中，肾损伤或衰竭是急性的。在进一步的实施方案中，肾衰竭是由暴露于放射造影剂、非甾体抗炎药(NSAID)、抗生素、化学治疗剂、利华单抗诱导的急性肉芽肿性肾小管间质性肾炎或肾毒性药物引起的。在一些实施方案中，急性肾衰竭是由严重疾病、心输出量减少、创伤、血液氧合减少、由于对另一器官的损伤的反应引起的全身毒性、由心肾综合征、心脏手术或急性失代偿性心力衰竭引起的全身性低血压、由于出血造成的循环体积降低、败血性休克、低血容量性休克、严重登革热、外科手术、横纹肌溶解、或肝肾综合征或肝移植引起的局部肾血流量减少、或腹泻、呕吐、利尿剂或出汗过多引起的脱水引起的循环量减少。

在一些实施方案中，个体的肾小球滤过率提高。在其他实施方案中，个体的血清肌酐水平降低。

在一些方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含(a)内皮素-B(ET_B)受体激动剂、(b)centhaquin或其盐、以及任选地(c)赋形剂。

在其他方面，本公开内容提供一种制品，其包括：(a)包装的组合物，其包含内皮素-B(ET_B)受体激动剂和centhaquin或其盐；(b)提供说明用于同时或相继施用ET_B受体激动剂及centhaquin或其盐以治疗患者的说明书；(c)用于(a)和(b)的容器。在一些实施方案中，内皮素-B(ET_B)受体激动剂是N-琥珀酰-[Glu⁹，Ala^11,15]内皮素1(IRL-1620)。

在一些方面，本公开内容提供了一种治疗患有急性肾功能下降的个体的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的包含centhaquin或其盐的组合物。在一些实施方案中，急性肾功能下降与急性肾衰竭相关。在一些实施方案中，肾功能急性下降的原因是由于流向肾的血流量减少而造成的肾前性，在肾内的组织被直接破坏的情况下的内在性，以及在尿流被阻塞时的肾后性。在一些实施方案中，急性肾衰竭由以下引起或与以下相关：由严重疾病、心输出量减少、创伤、血液氧合减少、由于对另一器官的损伤的反应引起的全身毒性、由心肾综合征、心脏手术或急性失代偿性心力衰竭引起的全身性低血压、由于出血造成的循环体积降低、败血性休克、低血容量性休克、严重登革热、外科手术、横纹肌溶解、或肝肾综合征或肝移植引起的局部肾血流量减少、由药物、放射性造影剂、非甾体抗炎药(NSAID)、抗生素或化学治疗剂引起的肾毒性、或腹泻、呕吐、利尿剂或出汗过多引起的脱水引起的循环量减少。

在一些方面，本公开内容提供了一种治疗患有肾损伤的个体的方法，该方法包括施用有效量的包含centhaquin或其盐的组合物。在一些实施方案中，肾损伤是由缺血事件或缺血再灌注事件引起的。在进一步的实施方案中，该盐是柠檬酸盐、丙酮酸盐或乳酸盐。在一些实施方案中，以大约0.0001mg/kg至大约1.0mg/kg的剂量施用centhaquin或其盐。在进一步的实施方案中，centhaquin或其盐以单剂量或多剂量施用。

附图说明

图1显示了出血对假对照和出血的大鼠的平均动脉压、心率、心输出量和全身血管阻力的影响。用高渗盐水或centhaquin使出血大鼠复苏。该值表示为平均值±SEM(n＝5)。*与基线相比p<0.05，^#与出血相比p<0.05，^x与载剂治疗组相比p<0.05。

图2描述了出血对假对照和出血大鼠中ET_A受体表达的影响。用高渗盐水或centhaquin使出血大鼠复苏。泳道1-假对照；泳道2–出血性休克；泳道3–高渗盐水(载剂)；泳道4–载剂+centhaquin(0.017mg/kg)；泳道5–载剂+centhaquin(0.05mg/kg)。该值表示为平均值±SEM(n＝4)。*与假对照相比p<0.05，^#与出血或高渗盐水相比p<0.05。

图3显示了出血对假对照和出血大鼠中ET_B受体表达的影响。用高渗盐水或centhaquin使出血大鼠复苏。泳道1-假对照；泳道2–出血性休克；泳道3–高渗盐水(载剂)；泳道4–载剂+centhaquin(0.017mg/kg)；泳道5–载剂+centhaquin(0.05mg/kg)。该值表示为平均值±SEM(n＝4)。*与假对照相比p<0.05，^#与出血或高渗盐水相比p<0.05。

图4显示了出血对假对照和出血大鼠的血浆TNF-α、IL-6和IL-10的影响。用高渗盐水或centhaquin使出血大鼠复苏。该值表示为平均值±SEM(n＝5)。*与假对照相比p<0.05，^#与出血相比p<0.05，@与高渗盐水相比p<0.05。

图5显示了出血对大量出血的雄性大鼠的肾血液灌注的影响。用载剂(盐水)或低剂量centhaquin(0.01mg/kg)或高剂量centhaquin(0.1mg/kg)使出血大鼠复苏。该值表示为平均值±SEM(n＝5)。*与出血相比p<0.05，#与载剂(盐水)相比p<0.05。

图6显示了出血对大量出血雌性大鼠的肾血液灌注的影响。用载剂(盐水)或低剂量centhaquin(0.01mg/kg)或高剂量centhaquin(0.1mg/kg)使出血大鼠复苏。该值表示为平均值±SEM(n＝5)。*与出血相比p<0.05，#与载剂(盐水)相比p<0.05。

图7显示了实验结果，其中使用氨基甲酸乙酯麻醉雄性大鼠，对股静脉进行插管以进行药物施用，对股动脉进行插管以测量平均动脉压(MAP)，并将激光多普勒血流探头置于肾髓质中测量血液灌注。通过抽血使MAP维持在35mmHg 30分钟来引发出血性休克。进行去甲肾上腺素输注以使MAP维持在70mmHg。在诱发休克前，休克(出血)后30分钟以及复苏后15、30、45、60、75和90分钟测量了centhaquin对心血管功能的影响。与复苏后的载剂对照相比，centhaquin改善了出血的雄性大鼠的肾血液灌注。去甲肾上腺素引起的血管收缩的不良反应可以被centhaquin减轻。

图8显示了实验结果，其中用氨基甲酸乙酯麻醉雌性大鼠，对股静脉进行插管以进行药物施用，对股动脉进行插管以测量平均动脉压(MAP)，并将激光多普勒血流探头置于肾髓质中测量血液灌注。通过抽血使MAP维持在35mmHg 30分钟来引发出血性休克。进行去甲肾上腺素输注以使MAP维持在70mmHg。在诱发休克前，休克(出血)后30分钟以及复苏后15、30、45、60、75和90分钟测量了centhaquin对心血管功能的影响。与复苏后的载剂对照相比，centhaquin改善了出血雌性大鼠的肾血液灌注，并且观察到实验结束前血液灌注得到改善。去甲肾上腺素引起的血管收缩的不良反应可以被centhaquin减轻。

图9显示了对因过度出血引起的低血容量性休克的作为复苏剂的centhaquin进行II期研究的结果，其中确定了患者在研究中入院时(基线)和出院时(研究结束)的收缩压和舒张压。中期分析显示，接受centhaquin治疗的患者的血压升高大于对照组的血压升高。这些结果表明，centhaquin是一种有效的复苏剂，可改善低血容量性休克患者的预后。

图10显示了由于过度出血引起的低血容量性休克的作为复苏剂的centhaquin的II期研究结果，其中所有受试者均接受了标准的护理以及标准的休克治疗。然后将患者随机分配到接受标准治疗和生理盐水治疗的对照组，或接受标准治疗和centhaquin联合治疗的centhaquin组。患者在研究中入院时(基线)和出院时(研究结束)确定血清肌酐水平。根据批准的方案进行的中期分析显示，对照组中的血清肌酐水平降低了25.35％，接受centhaquin治疗的患者中血清肌酐水平降低了42.61％。数据表明，与标准治疗相比，centhaquin使血清肌酐水平降低了17.26％。

图11显示了由于过度出血引起的低血容量性休克的作为复苏剂的centhaquin的II期研究结果，所有受试者均接受了标准的护理以及标准的休克治疗。然后将患者随机分配到接受标准治疗和生理盐水治疗的对照组，或接受标准治疗和centhaquin联合治疗的centhaquin组。患者在研究中入院时(基线)和出院时(研究结束)确定了血液尿素氮。根据批准的方案进行的中期分析显示，对照组和centhaquin治疗患者的血尿素氮相似。

图12显示了由于过度出血引起的低血容量性休克的作为复苏剂的centhaquin的II期研究结果，所有受试者均接受了标准的护理以及标准的休克治疗。然后将患者随机分配到接受标准治疗和生理盐水治疗的对照组，或接受标准治疗和centhaquin联合治疗的centhaquin组。患者在研究中入院时(基线)和出院时(研究结束)确定肾小球滤过率。根据批准的方案进行的中期分析显示，对照组中的肾小球滤过率提高了40.00％，接受centhaquin治疗的患者肾小球滤过率提高了81.52％。数据表明，与标准治疗相比，通过centhaquin使肾小球滤过率增加了41.52％。

具体实施方式

已经确定，低剂量的centhaquin(2-[2-(4-(3-(甲基苯基)-1-哌嗪基)]乙基-喹啉)柠檬酸盐可显著降低血乳酸，并增加出血性休克的平均动脉压(MAP)、脉搏血压(PP)和心输出量(CO)(Gulati等，2012；Gulati等，2013；Lavhale等，2013；Papapanagiotou等，2016)。在将centhaquin和现有复苏剂分为3个不同的类别之间进行了比较研究(见实施例2)：(a)液体，例如乳酸林格氏液，高渗盐水；(b)肾上腺素能药物，例如去甲肾上腺素，以及(c)新鲜血液。使用(i)恒压出血的大鼠模型，(ii)创伤失控的兔子模型以及(iii)大量出血的猪模型的结果表明，centhaquin在降低低血容量性休克后的死亡率方面非常有效(Gulati等，2012年；Gulati等，2013年；Lavhale等，2013年；Papapanagiotou等，2016年)。与其他复苏剂(升压药)不同，centhaquin通过增加中风体积(SV)和CO来增加MAP；并降低心率和全身血管阻力(SVR)。

出血性休克期间血浆ET-1水平升高以及流向肾和肺部的血流减少(Chang等，1993；Edwards等，1994)。出血性休克后肺和肾血流的减少，导致ET-1清除率降低，可能是循环血浆ET-1增加的原因，这在维持血管紧张度和组织血液灌注中起着重要作用(Chang等，1993)。出血性休克后循环中的ET-1可能通过作用于ET_A受体(作为血管收缩剂)和ET_B受体(作为血管扩张剂)维持血管张力从而调节心血管系统(Bourque等，2011；Cardillo等，2000；Helmy等，2001；Sandoo等，2010)。

Centhaquin目前在临床开发中正作为复苏剂用于出血性休克。不希望受到理论的束缚，所提出的机制是中心肽作用于静脉_α2B肾上腺素能受体产生收缩并增加静脉回流到心脏，并刺激中枢_α2A肾上腺素能受体引起SVR降低。然而，肾上腺素受体已经显示可被内皮素(ET)受体调节(Gulati，1992；Gulati和Srimal 1993；Lavhale等，2010；Sanchez等，2014)因此，ET受体可参与centhaquin在出血性休克中的作用机理。

肾损伤/衰竭

急性肾衰竭是肾在不损失电解质的情况下突然丧失过滤废物的能力。多数情况下，急性肾衰竭(也称为急性肾损伤或AKI)是由到肾的血液流量减少引起的(肾前性急性肾衰竭)，不过约20％的病例是由于感染或毒素直接影响肾引起的(内在性ARF)，并且约10％是由于肾下游的阻塞(肾后性阻塞)所致。重症监护患者的急性肾损伤(AKI)患病率很高。早期发现可能会阻止患者发展为慢性肾疾病，并需要进行肾置换治疗。在大多数住院患者中，急性肾衰竭是由缺血性和/或肾毒性损伤导致的急性肾小管坏死引起的。肾血流灌注不足是由低血容量性、心源性和败血性休克引起的，由施用血管收缩药或肾血管损伤引起的。肾毒素包括外源性毒素，例如造影剂和氨基糖苷，以及内源性毒素，例如肌红蛋白。研究表明，在大多数人类急性肾衰竭病例中，肾组织中的细胞凋亡是突出的，凋亡细胞死亡的主要部位是远端肾单位。在缺血性损伤的初始阶段，肌动蛋白细胞骨架的完整性丧失会导致上皮变平、刷状缘的丧失、局灶性细胞接触的丧失、以及随后细胞与下层基质的脱离。已经提出凋亡小管细胞死亡可能比坏死性细胞死亡更能预测功能改变(Komarov等，1999；Supavekin等，2003)。有发展缺血性急性肾衰竭风险的个体包括具有糖尿病、潜在的肾功能不全、肾病综合征、老年、动脉粥样硬化疾病、肾毒性药物接受者、败血症、低血压个体、低氧个体、手术前、肌红蛋白尿血尿、与妊娠相关的急性肾衰竭和肝病的个体。

急性肾损伤的特征在于选自由以下组成的组的至少一种病况：血清肌酐比基线增加至少50％，血清肌酐绝对增加超过基线至少0.3mg/dL，肾小球滤过率与基线相比减少至少为25％，和尿排出量减少至每小时每公斤体重0.5ml或更少并持续至少6小时。

社区获得性急性肾衰竭(ARF)的发生率仅为每百万人口约100例，死亡率为7％。已公布的ARF发病率占所有住院病人的1％至13％(美国为34×10⁶/年)，并且占所有ICU住院病人的20％至30％(在美国为4.4×10⁶/年)。大多数ARF病例是由于其他疾病或干预措施引起的并发症而在医院获得的。最常见的原因是败血症、血容量不足、手术、影像造影剂、化学疗法药物、NSAIDS和某些抗生素。

急性肾损伤可能涉及由以下引起的或与之相关的肾前性肾损害：导致流向肾的总血流量减少的心排血量减少，创伤，血液氧合减少，对另一器官损伤的反应引起的全身毒性，由心肾综合征或急性失代偿性心力衰竭引起的系统性低血压，出血引起的循环量减少，外科手术或肝肾综合征导致的局部肾血流量减少。

在一项研究中，急性肾损伤在整个人群中占52.6％(n＝8270)，在年轻成年人群(16-25岁)中占39.8％。对于年轻的成年年龄组，糖尿病、入院的手术原因、疾病的严重程度、低血压和某些药物(万古霉素和钙调神经磷酸酶活性剂)均与急性肾损伤独立相关。急性肾损伤是住院时间更长、重症监护病房死亡率和出院后死亡率的重要预测指标。因此，急性肾损伤是常见事件，与住院时间延长和高死亡风险相关(Fuhrman等，2018)。

使用2001年National Hospital Discharge Survey，Liangos等(2006)发现，所有医院出院的1.9％均显示了ARF代码，相当于美国的646,000的发生率。死亡率为21.3％。作者通过检查2001年从St.Elizabeth's(Boston)出院的所有13,237名患者来验证了这项研究。值得注意的是，有2.6％的患者有ARF代码，但实验室数据显示有12％的患者经历过ARF。因此，ARF代码仅在大约20％的发生率上出现(大概是最严重的情况)(Liangos等，2006)。

急性肾衰竭的治疗方法是在等待肾恢复的同时，给予补液以逆转血容量不足并清除毒素。在某些情况下，患者保留了过多的水，或他们的电解质平衡达到需要透析的程度。急性肾衰竭患者最常见的死亡原因是心力衰竭、败血症和呼吸衰竭。从急性肾衰竭中恢复的患者在接下来的5年和10年中死亡和慢性肾疾病的几率增加。在动物中表现出前景的数十种新疗法和药物已在急性肾衰竭患者中进行了临床测试，但在随机临床试验中均未显示出任何益处。测试的一些治疗方法包括增加尿液流量的利尿剂、多巴胺和增加肾血流量的心房利钠肽(ANP)、保护小管上皮细胞的许多细胞保护剂，例如自由基清除剂、热休克蛋白、血红素加氧酶、黄嘌呤氧化酶活性剂、前列腺素和钙通道阻滞剂，以及加快近端小管的恢复的几种生长因子(Allgren等，1997；Hirschberg等，1999)。

在以下情况后有急性肾损伤的报道：心脏手术；肝移植；严重登革热；败血性休克；低血容量性休克；肾毒性药物，例如静脉造影、万古霉素、哌拉西林-他唑巴坦联合万古霉素、粘菌素、尼古鲁单抗诱导的急性肉芽肿性肾小管间质性肾炎、抗癌药物、顺铂引起的急性肾损伤；重症实体瘤患者；黎石病引起的急性肾损伤；横纹肌溶解症。

进行了研究以确定centhaquin对肾髓质血流的影响，结果表明严重的出血产生肾髓质血流的减少和肾灌注的恶化，导致缺血和肾衰竭(Gulati等，2016a；Gulati等，2017)。众所周知，外侧肾髓质具有更高的代谢需求，并且大约33％的过滤后的氯化钠会被Henle环的厚上升支重新吸收(Cowley 2008)。因此，该区域在过度出血后极易发生缺氧或缺血性损伤。

内皮素

内皮素(ET)是一种内源性肽，可作用于两个不同的G蛋白偶联受体ET_A和ET_B，并在全身发挥多种功能(Arai等，1990；Goto等，1989)。先前已有报道，出血性休克期间血浆ET-1水平升高，以及流向肾和肺部的血流量减少(Chang等，1993；Edwards等，1994)。出血性休克后肺和肾血流的减少导致ET-1清除率降低，这可能是循环血浆ET-1增加的原因，这在维持血管紧张度和组织血液灌注中起着重要作用(Chang等，1993)。出血性休克后循环中的ET-1可能通过作用于ET_A受体(作为血管收缩剂)和ET_B受体(作为血管扩张剂)维持血管张力从而调节心血管系统(Bourque等，2011；Cardillo等，2000；Helmy等，2001；Sandoo等，2010)。因此，有趣的是研究出血性休克和复苏与centhaquin对各种组织中的ET_A和ET_B受体变化的影响。另外，众所周知的是出血性休克和复苏有助于增加全身性炎症反应的风险(Chaudry等，1990)并且ET-1在败血症和出血性休克后的炎症中其重要作用(Kowalczyk等，2015)。

内皮素B(ET_B)受体激动剂

本公开内容考虑了内皮素B(ET_B)受体激动剂在本文公开的组合物和方法中的用途。在各种实施方案中，ET_B受体激动剂选自由以下组成的组：N-琥珀酰-[Glu⁹,Ala^11,15]内皮素1(IRL-1620)、BQ-3020、[Ala^1,3,11,15]-内皮素、角蝰毒素S6c和内皮素3。

IRL-1620[N-琥珀酰-[Glu⁹,Ala^11,15]内皮素1]是ET-1的类似物，其氨基酸序列为Suc-Asp-Glu-Glu-Ala-Val-Tyr-Phe-Ala-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp(SEQ ID NO:1)，分子量为1821.9。IRL-1620是ET_B受体的强效特异性激动剂，其对ET_A和ET_B受体的Ki值分别为1.9μM和16pM，使其对ET_B的选择性比ET_A受体高约120,000倍。IRL-1620已用于许多研究中，以确定ET_B受体在肺、肝、肾、胃肠、皮肤和内分泌系统中的生物学作用。(Bauer等，2000；Fellner和Arendshorst 2007；Khan等，2006；Lawrence等，1995；Mathison和Israel 1998；Mazzoni等，1999)。

根据本公开，可以以0.0001至0.5mg/kg的剂量施用ET_B受体激动剂(例如，IRL-1620)。在进一步的实施方案中，以下述剂量施用内皮素B受体激动剂：约0.0001至约0.5mg/kg，或约0.0001至约0.4mg/kg，或约0.0001至约0.3mg/kg，或约0.0001至约0.2mg/kg，或约0.0001至约0.1mg/kg，或约0.001至约0.5mg/kg，或约0.001至约0.4mg/kg，或约0.001至约0.3mg/kg，或约0.001至约0.2mg/kg，或约0.001至约0.1mg/kg，或约0.01至约0.5mg/kg，或约0.01至约0.4mg/kg，或约0.01至约0.3mg/kg，或约0.01至约0.2mg/kg，或约0.01至约0.1mg/kg，或约0.0005至约0.5mg/kg，或约0.0005至约0.4mg/kg，或约0.0005至约0.3mg/kg，或约0.0005至约0.2mg/kg，或约0.0005至约0.1mg/kg。在另外的实施方案中，以下述剂量施用ET_B受体激动剂(例如，IRL-1620)：至少约0.0001mg/kg，或至少约0.0002mg/kg，或至少约0.0005mg/kg，或至少约0.001mg/kg，或至少约0.002mg/kg，或至少约0.005mg/kg，或至少约0.007mg/kg，或至少约0.01mg/kg，或至少约0.02mg/kg，或至少约0.03mg/kg，或至少约0.04mg/kg，或至少约0.05mg/kg，或至少约0.06mg/kg，或至少约0.07mg/kg，或至少约0.08mg/kg，或至少约0.09mg/kg，或至少约0.1mg/kg，或至少约0.2mg/kg，或至少约0.3mg/kg，或至少约0.4mg/kg。在另外的实施方案中，以下述剂量施用ET_B受体激动剂(例如，IRL-1620)：小于约0.0001mg/kg，或小于约0.0002mg/kg，或小于约0.0005mg/kg，或小于约0.001mg/kg，或小于约0.002mg/kg，或小于约0.005mg/kg，或小于约0.007mg/kg，或小于约0.01mg/kg，或小于约0.02mg/kg，或小于约0.03mg/kg，或小于约0.04mg/kg，或小于约0.05mg/kg，或小于约0.06mg/kg，或小于约0.07mg/kg，或小于约0.08mg/kg，或小于约0.09mg/kg，或小于约0.1mg/kg，或小于约0.2mg/kg，或小于约0.3mg/kg，或小于约0.4mg/kg，或小于约0.5mg/kg。在一些实施方案中，以下述剂量施用ET_B受体激动剂(例如，IRL-1620)：约0.1至约0.6μg/kg，或约0.1至约0.5μg/kg，或约0.1至约0.4μg/kg，或约0.1至约0.3μg/kg。在其他实施方案中，以下述剂量施用ET_B受体激动剂(例如，IRL-1620)：约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0μg/kg.。

在各种实施方案中，以1至6小时的间隔向患者重复施用ET_B受体激动剂(例如，IRL-1620)。在一些实施方案中，以每1至5小时，或每1至4小时，或每1至2小时，或每hour，或每2小时，或每3小时，或每4小时，或每5小时，或每6小时向患者施用ET_B受体激动剂(例如，IRL-1620)。在其他实施方案中，每两至五天，或每三至五天，或每两天，或每三天，或每四天，或每五天向患者施用ET_B受体激动剂(例如，IRL-1620)。在一些实施方案中，每天一次，两次，三次，四次或五次施用ET_B受体激动剂(例如，IRL-1620)。

Centhaquin

Centhaquin是一种α-2受体激动剂和心血管活性剂，已显示出产生正性肌力作用并增加了离体的灌注兔心脏的心室收缩(Bhatnagar等，1985)。centhaquin的直接或间接正性肌力作用可能导致心输出量(CO)升高。在针对出血性休克的猪模型进行的一项研究中，发现在液体复苏阶段施用的centhaquin(0.015mg/kg)可增加CO，降低全身血管阻力(SVR)，需要较小体积的液体进行复苏，与乳酸林格氏(LR)相比，存活率明显提高(Papalexopoulou等，2017；Papapanagiotou等，2016)。在另一项研究中，以出血量1/5施用centhaquin可使出血大鼠的平均动脉压(MAP)维持更长的时间，并提高了存活率(Gulati等，2013)。在出血性休克的大鼠模型中，centhaquin显著改善了CO，降低了血乳酸并改善了生存(Gulati等，2012；Lavhale等，2013)。Centhaquin的半衰期约为1小时，并且分布量大(Gulati等，2016；O'Donnell等，2016a；O'Donnell等，2016b)。成功的化学、制造和控制以及小鼠、大鼠和狗的毒理学研究导致成功完成了实验性centhaquin的人I期研究。这项研究是在24位人类受试者中进行的，发现centhaquin是安全的并且耐受性良好(Gulati等，2016)。目前，正在对患有出血性休克的人进行多中心II期研究(CTRI/2017/03/008184)。

可以预期的是，除了centhaquin，其它α₂肾上腺素能药在本公开的方法中有用。例如但不限于，本公开预期选自由以下组成的组的α₂肾上腺素能药的应用：centhaquin，可乐定，胍法辛，胍那苄，胍诺沙苄，胍乙啶，甲苯噻嗪，替扎尼定，甲基多巴，发朵米叮，阿米福林，双甲脒，山莨菪碱，阿普拉卡洛定，溴莫尼定，西拉唑啉，去甲替丁，右美托咪定，甲萘啶，麦角胺，麻黄碱，茚满定，洛美定，美托咪定，间苯二甲胺，异氰胺，甲氧明，米非诺尔，萘甲唑啉，去甲肾上腺素，去甲苯氟丁胺，章鱼胺，羟甲唑啉，苯丙醇胺，利曼替尼，罗米替丁，辛弗林，他利浦尔，其盐及其组合。

α₂肾上腺素能药的盐也可以在本发明组合物和方法中使用。合适的盐的例子包括但不限于与无机酸例如硝酸、硼酸、盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及有机酸例如草酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸和柠檬酸形成的酸加成盐。本发明α₂肾上腺素能药的盐的非限制性实例包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、2-羟基乙磺酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、双葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、抗坏血酸盐、羟乙基磺酸盐、水杨酸盐、甲磺酸盐、均三甲苯磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐、乙二磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。

优选的盐是有机酸的盐，例如柠檬酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、富马酸盐、马来酸盐、抗坏血酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐、二甘氨酸盐和天冬氨酸盐。更优选的盐是柠檬酸盐、乳酸盐或酒石酸盐。

相对于每千克被治疗个体的重量(mg/kg)，centhaquin作为游离碱的施用量可以为0.001至小于0.05mg，优选约0.003至约0.04mg/kg，更优选约0.005至约0.03mg/kg。更具体地讲，作为游离碱的centhaquin以mg/kg计的施用剂量为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.010、0.011、0.012、0.013、0.014、0.015、0.016、0.017、0.018、0.019、0.020、0.021、0.022、0.023、0.024、0.025、0.026、0.027、0.028、0.029、0.030、0.031、0.032、0.033、0.034、0.035、0.036、0.037、0.038、0.039、0.040、0.041、0.042、0.043、0.044、0.045、0.046、0.047、0.048、或0.049，以及其中的所有范围和子范围。

centhaquin也可以以盐的形式施用，例如centhaquin柠檬酸盐，以实现本发明方法的益处。centhaquin柠檬酸盐的施用量为约0.0001至大约1.5mg/kg，优选约0.0002至大约0.8mg/kg，并且更优选约0.0004至约0.5mg/kg。在一些实施方案中，centhaquin柠檬酸盐以约0.0001至约1.0mg/kg的量施用。更特别地，centhaquin柠檬酸盐的施用剂量以mg/kg计(centhaquin柠檬酸盐)可以为任何以下剂量：0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.010、0.011、0.012、0.013、0.014、0.015、0.016、0.017、0.018、0.019、0.020、0.021、0.022、0.023、0.024、0.025、0.026、0.027、0.028、0.029、0.030、0.031、0.032、0.033、0.034、0.035、0.036、0.037、0.038、0.039、0.040、0.041、0.042、0.043、0.044、0.045、0.046、0.047、0.048、0.049、0.05、0.051、0.052、0.053、0.054、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4，或1.5，以及其中的所有范围和子范围。

在一些实施方案中，α₂肾上腺素能剂(例如，centhaquin或其盐)与复苏液共施用。复苏液可以是胶体溶液、晶体溶液、血液、血液成分或血液替代物。胶体溶液和晶体溶液的非限制性实例是林格氏乳酸盐、盐水、高渗盐水、白蛋白溶液、葡聚糖溶液、羟乙基淀粉溶液、明胶溶液和淀粉溶液。血液成分的实例是血浆、红细胞、白细胞、血小板、凝血因子、蛋白质和激素。血液替代物可以是基于血红蛋白的血液替代物或基于全氟化烃的替代物。

复苏液的施用体积量最多是个体损失的液体(例如血液、血浆、水)体积量的三倍。在一些实施方案中，以小于和等于个体损失的流体的体积量的量来施用复苏液，例如损失流体的体积量的5％，优选10％或20％，并且至多为100％。

组合物/施用

在一些方面，本公开内容提供了用于治疗肾损伤或肾衰竭的组合物，其包含治疗有效量的ET_B受体激动剂(例如，IRL-1620)，其中治疗有效量为约0.0001mg/kg至约0.5mg/kg。在一些实施方案中，该组合物还包含治疗有效量的centhaquin或其盐，其中该治疗有效量的centhaquin或其盐以约0.0001mg/kg至约1.0mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，该centhaquin盐是centhaquin柠檬酸盐。

在一些方面，本公开内容提供了用于治疗急性肾功能下降或肾损伤的组合物，其包含治疗有效量的centhaquin或其盐，其中以约0.0001mg/kg至约1.0mg/kg的剂量施用治疗有效量的centhaquin或其盐。在一些实施方案中，该centhaquin盐是centhaquin柠檬酸盐。

本公开的药物组合物包括其中以有效量施用活性成分以实现其预期目的的那些。更具体地说，“治疗有效量”是指有效治疗或预防肾损伤或衰竭或治疗急性肾功能下降的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的具体实施方式。

“治疗有效剂量”是指导致达到所需效果的活性剂的量。所述活性剂的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序测定，例如，测定LD₅₀(对50％人群致死的剂量)和ED₅₀(对50％人群治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其表示为LD₅₀与ED₅₀之间的比率。高治疗指数是优选的。从这样的数据获得的数据可以用于制定用于人的剂量范围。活性剂的剂量优选地处于包含ED₅₀的循环浓度范围内，毒性很小或没有毒性。剂量可取决于所用剂型和所用施用途径在此范围内变化。

为了以本文公开的方法向人施用，对于普通的成年患者(70kg)，每天口服约0.01mg-约200mg的centhaquin，通常每天分为两至三剂。因此，对于典型的成年患者，单独的片剂或胶囊剂在合适的药学上可接受的载体或载体中包含约0.1至约200mg的centhaquin，以每天一次或多次的单剂量或多剂量给药。静脉、颊或舌下施用的剂量通常根据需要为每单剂量约0.1至约10mg/kg。在实践中，医生确定最适合于个体患者的实际给药方案，其可以随着特定患者的年龄、体重和反应而变化。上述剂量是平均情况的示例，但可以存在其中应为更高或更低剂量的个别情况，并且这些都在本公开的范围内。

如以上在本文中进一步详细讨论的，对于普通的成年患者，ET_B受体激动剂(例如，IRL-1620)的剂量为约0.1至约0.6μg/kg，通常每天给药一次、两次或三次。在一些实施方案中，ET_B受体激动剂(例如，IRL-1620)的剂量为约0.3μg/kg，每天施用一次、两次或三次。ET_B受体激动剂(例如IRL-1620)的剂量在合适的药学可接受的载剂或载体中。在实践中，医生确定最适合于个体患者的实际给药方案，其可以随着特定患者的年龄、体重和反应而变化。上述剂量是平均情况的示例，但可以存在其中应为更高或更低剂量的个别情况，并且这些都在本公开的范围内。

本公开的活性剂通常单独施用或与药物载体混合施用，所述药物载体是根据预期的施用途径和标准药学实践来选择的。根据本公开使用的药物组合物因此可以利用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包括有助于加工活性剂为制剂的赋形剂和/或助剂。

这些药物组合物可以通过例如常规的混合、溶解、粒化、制糖衣、乳化、包封、包覆或冻干方法制造。合适的制剂取决于所选的施用途径。当口服施用治疗有效量的活性剂时，组合物通常呈片剂、胶囊、粉末、溶液或酏剂的形式。当以片剂形式施用时，所述组合物另外可以含有固体载体，例如明胶或佐剂。片剂、胶囊剂和粉末含有约5％至约95％的本发明的活性剂，优选约25％至约90％的本发明的活性剂。当以液体形式施用时，可以加入液体载剂，如水、石油或动物或植物来源的油。液体形式的组合物可以进一步含有生理盐水溶液、右旋糖或其它糖溶液或二醇。当以液体形式施用时，按重量计，组合物含有约0.5％到约90％的活性剂，并且优选地约1％到约50％的活性剂。

当通过静脉内、皮肤或皮下注射施用治疗有效量的活性剂时，该组合物是无热原的肠胃外可接受的水溶液形式。在适当考虑pH、等渗性、稳定性等的情况下这类肠胃外可接受的溶液的制备在本领域的技术范围内。除本公开的化合物外，用于静脉内、皮肤或皮下注射的优选组合物通常还包含等渗载剂。

合适活性剂可以容易地与本领域熟知的药学上可接受的载体组合。这类载体使得活性剂能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以用于待治疗患者的口服。可以通过以下方式获得口服的药物制剂，在活性剂中加入固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并在需要时加入合适的助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。合适的赋形剂包含例如填充剂和纤维素制剂。如果期望，可以加入崩解剂。

活性剂可以调配用于通过注射，例如通过推注或连续输注进行肠胃外施用。用于注射的制剂可以以单位剂型存在于例如添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。该组合物可以采取诸如油性或水性载剂中的悬浮剂、溶液或乳剂的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外施用的药物组合物包含水溶形式的活性剂的水溶液。另外，活性剂的悬浮剂可以制备成适当的油性注射悬浮剂。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油或合成脂肪酸酯。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度，并且允许制备高浓度溶液的试剂。作为选择，本公开的组合物可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载剂(例如无菌无热原水)构建。

活性剂还可以调配成直肠组合物，如栓剂或保留灌肠剂，其例如含有常规栓剂基质。除了先前描述的制剂之外，活性剂还可以配制成长效制剂。这类长效配制物可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如，活性剂可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或作为难溶衍生物，例如，难溶盐。

特别地，活性剂可以以含有赋形剂(例如淀粉或乳糖)的片剂的形式、或者以胶囊或珠的形式(单独或与赋形剂混合)，或以含有调味剂或着色剂的酏剂或悬浮剂形式口服、颊或舌下施用。这类液体制剂可以用药学上可接受的添加剂，例如悬浮剂制备。活性剂也可以肠胃外注射，例如静脉内、肌肉内、皮下、鞘内、脑池内或冠状内注射。对于肠胃外施用，活性剂最好以无菌水溶液的形式使用，其可以含有其它物质，例如盐或单糖，例如甘露醇或葡萄糖，以使溶液与血液等渗。

对于兽医用途，根据正常兽医实践，将活性剂以适当可接受的制剂形式施用。兽医可以容易确定最适合特定动物的给药方案和施用途径。

实施例

以下实施例研究了出血性休克和centhaquin复苏对各种组织中的内皮素(ET_A和ET_B)受体的作用，以及出血性休克大鼠模型中血浆ET-1和炎性标志物的浓度。

内皮素-1(ET-1)作用于ET_A和ET_B受体，并涉及出血性休克(休克)。利用水(盐水)或centhaquin研究休克和复苏对高渗盐对ET_A和ET_B受体表达的影响。将大鼠麻醉，将压力导管置于左股动脉中；从右股动脉中抽出血液，在30分钟内使平均动脉压(MAP)达到35mmHg，进行复苏，并在90分钟后处死以收集样品用于生化评估。用centhaquin进行复苏可减少血乳酸并增加MAP。休克或复苏后，大脑、心脏、肺和肝脏中ET_A或ET_B受体的蛋白质水平未改变。在腹主动脉中，休克使ET_A的表达增加(140％)，并被生理盐水和centhaquin减弱；休克后，ET_B的表达未改变，但被centhaquin增加(79％)。在肾髓质中，休克后ET_A的表达未改变，但被centhaquin降低(-61％)；休克使ET_B表达下降(-34％)，但被centhaquin而不是生理盐水完全减弱。休克引起的主动脉和肾髓质中ET_A和ET_B受体的变化被centhaquin逆转，可能有助于其功效。

实施例1

方法

动物在使用之前，将Sprague-Dawley雄性大鼠(340至380g)(Envigo,Indianapolis,IN)在受控温度(23±1℃)、湿度(50±10％)和光照(6：00AM到6:00PM)饲养。食物和水不断供应。动物护理和用于实验程序的用途已获得Midwestern University机构动物保护和使用委员会的批准。所有麻醉和手术程序均符合动物保护委员会制定的指导原则。

药品和化学品在Pharmazz India Private Limited,Greater Noida,India合成了centhaquin柠檬酸盐(PMZ-2010)。使用氨基甲酸酯(氨基甲酸乙酯)(Sigma-Aldrich StLouis,MO,USA)，高渗盐水注射剂USP(Hospira,Inc,Lake forest IL,USA)，和肝素钠注射剂(APP Pharmaceuticals,LLC,Schaumburg,IL,USA)。内皮素-1酶免疫分析试剂盒(目录号900-020A，Assay Designs,Inc.,Ann Arbor,MI,USA)、IL-6ELISA试剂盒(目录号KRC0061，Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)、IL-10ELISA试剂盒(目录号KRC0101，InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)和TNFαELISA试剂盒(目录号ER3TNFA，Thermo Scientific,Rockford,IL)用于各种评估。

心血管反应的测定用溶于等渗盐水中的氨基甲酸酯麻醉动物。通过腹膜内注射以每千克体重1.5g的剂量施用氨基甲酸酯。选择氨基甲酸酯作为麻醉剂是因为它可产生持久的麻醉(8-10小时)，并且心血管和呼吸系统的压抑程度最小。它产生一定程度的外科麻醉，其特点是可以保护心血管反射(Maggi and Meli，1986)。简而言之，麻醉的大鼠是固定在配有可控加热垫的手术板上。血Po₂、Pco₂和pH值使用气管切开插管连接到啮齿动物呼吸机(Model 683,Harvard Apparatus Inc.,Holliston,MA)来维持。右颈动脉暴露以测量左心室的表现。手术缝合(Deknatel,Research Triangle Park,NC)固定在颈动脉近端周围，并且将超微型压力体积(PV)导管SPR-869(Millar Instruments，Houston，TX)通过靠近动脉近端的微小切口插入。导管的P-V端子通过PEC-4D和CEC-4B电缆连接到MPVS-300P-V单元，并进入左心室以获得P-V信号。使用MPVS-300P-V单元(AD Instruments,Mountain View,CA,USA)和PowerLab 16/30数据采集系统(AD Instruments)连续采集信号(1000S^–1)。通过使用压力导管SPR-320(Millar Instruments)对左股动脉进行插管来测量MAP和HR，并通过AEC-10C连接器连接到ML221桥式放大器(AD Instruments)，并使用PowerLab 16/30数据采集系统采集信号(1000S^–1)/30(Gulati等，2012；Pacher等，2008)。左股静脉插管使用PE 50管(Clay Adams，Parsipanny，NJ)插管并固定进行复苏。

动脉血气和碱缺乏的测定在诱发休克前、诱发休克后30分钟、以及在载剂或centhaquin复苏后30和60分钟监测基线动脉血pH值、Po₂、Pco₂、Na⁺、K⁺和乳酸。使用血气采样注射器(Innovative Medical Technologies,Inc.Leawood,KS)从动脉套管中抽取血样(0.15毫升)，然后使用pHOx Ultra分析仪(Nova Biomedical Corporation，Waltham，MA)进行分析。使用以下公式计算碱缺乏(Davis等，1998；Paladino等，2008)：

SBD＝0.9287×[HCO₃ ^--24.4+14.83×(pH-7.4)]

出血性休克的诱发通过以大约0.5到1mL/min的速度从股动脉中抽血直至MAP达到35mmHg来诱发出血。如有必要，可通过进一步抽血将该MAP维持30分钟。本研究中使用的出血性休克模型是建立良好的可处理压力性出血的啮齿动物模型(Buehler等，2000；Gulati等，1997a；Gulati和Sen，1998)。每只出血大鼠的量约为8.0ml，并且在各组中出血量相似，约占总血液的40％。在各组中测得的血细胞比容水平相似。抽血的时间约为15分钟。

实验设计为了确定出血性休克中centhaquin对心血管系统和血浆细胞因子的复苏作用，将大鼠随机分为五组，第1组：假对照组(无出血)(n＝5)，第2组：无复苏的出血(n＝5)；第3组：出血，然后用3％高渗盐水(载剂)进行复苏(n＝5)；第4组：出血，然后用载剂加centhaquin(0.017mg/kg)进行复苏(n＝5)；和第5组：出血，然后用载剂加centhaquin(0.05mg/kg)进行复苏(n＝5)。诱发出血性休克后30分钟使用输液泵(Harvard ApparatusInfusion/Withdrawal Pump,Millis,MA)通过股静脉静脉滴注(1mL/min)开始复苏。在复苏的30分钟时收集用于生化估计的血样，并监测心血管参数直至60分钟后处死动物。复苏溶液的体积保持等于出血的体积。虽然，这并不代表典型的人复苏，但选择此体积是为了最大程度地减少混杂因素，并允许更准确地确定centhaquin的复苏作用。

血浆中ET-1水平的测定为了分析出血后再进行centhaquin复苏后血浆ET-1的变化，在复苏后30分钟从各组大鼠收集血液样本，并将其收集到含抑肽酶(500KIU.mL^-1的血液)的冰冻的EDTA试管(1mg.ml^-1的血液)中。将血样在0℃下以1600xg离心15分钟，并使用酶免疫法评估血浆ET-1水平。简而言之，将血浆样品和标准品添加到涂有对ET-1特异的单克隆抗体的孔中。温育24小时后，洗涤板，然后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体。温育30分钟后，洗涤板并加入3,3’,5,5’四甲基联苯胺底物的溶液，其产生蓝色。加入盐酸(1N)以终止底物反应，并使用DTX 800多模检测器在450nm处读取所得的黄色，并使用多模检测软件(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Inc.,Harbor Boulevard,Fullerton,CA)分析数据。测得的光密度与ET-1的浓度成正比(Lavhale等.2010)。

ET_A和ET_B受体表达的估计使用蛋白质印迹技术(Briyal等.2015；Leonard和Gulati,2013)进行一些修改，确定ET_A和ET_B受体的表达。完成心血管实验后，处死动物，立即切出器官(大脑、心脏、肝脏、肺、肾和腹主动脉)，在干冰上速冻，并保存在-80℃进行进一步分析。该组织是用10x(w/v)RIPA裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5,120mM NaCl,1.0％TritonX-100,1.0％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，10％甘油，1mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，1mM乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸四钠盐(EGTA)，磷酸酶抑制剂和Complete Mini Protease抑制剂鸡尾酒片剂(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)进行匀浆。分离溶解形式的蛋白质，并通过Folin-Ciocalteu的酚试剂测量浓度(Lowry等，1951)。将溶解的蛋白质(60μg)在Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中变性，在10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离，然后转移至硝酸纤维素膜上，然后用在Tris缓冲盐水(TBS)中的

封闭缓冲液(ThermoFisher Scientific,Hanover Park,IL)封闭膜。将膜用1x TBS-Tween(TBST)洗涤3次，并与兔多抗ET_A受体(ab85163，Abcam，Cambridge，MA，1：1000)或抗ET_B受体(ab117529，Abcam，Cambridge，MA，1：1000)或小鼠单克隆抗β-actin(a1978，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)抗体一起孵育，然后是辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗山羊抗兔抗体(sc2004，SantaCruz Biotechnology，Dallas，TX，1：2000)或山羊抗小鼠抗体(ab98693,Abcam,Cambridge,MA,1:10,000)，并利用ChemiDoc^TMMP成像系统(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)通过

West Pico化学发光底物(ThermoFisher Scientific,Hanover Park,IL)可视化，然后使用ImageJ(NIH)软件进行分析。

测定血浆中IL-6、IL-10和TNF-α的水平使用市售的大鼠酶联免疫吸附测定试剂盒估计血浆IL-6、IL-10和TNF-α的水平：IL-6(Invitrogen Corporation，检测下限为5pg/ml；对大鼠IL-6高度特异性，与其他细胞因子无交叉反应)，IL-10(Invitrogen Corporation，检测下限为5pg/ml；对大鼠IL-10高度特异性，与其他细胞因子无交叉反应)，和ELISA试剂盒(Thermo Scientific，检测下限为15pg/ml；对大鼠TNF-α具有高度特异性，与其他细胞因子无交叉反应性)用于各种评估。根据制造商提供的方案，使用事先未解冻的血浆样品进行所有测定。

统计分析使用GraphPad Instat-2.00进行了功效分析。功效设置为80％(β＝0.8)，使用的显著性水平(α)为0.05。功效分析表明，当显著性水平α＝0.05时，每组5个心血管样本量和4个生化评估样本量足以达到80％的功效。数据表示为平均值±SEM。差异的显著性是通过对方差的单向分析，然后进行事后检验(Bonferroni方法)来估计。P值小于0.05被认为是显著的。统计分析使用GraphPad Prism 7.00(GraphPad，San Diego,CA,USA)进行。

结果

centhaquin对出血性大鼠的动脉血pH、pO₂、pCO₂、血细胞比容、血乳酸和碱缺乏的影响。出血后观察到大鼠的血pH值明显下降，高渗盐水施用后血pH值进一步下降。施用centhaquin(0.017和0.05mg/kg)可以显著防止出血大鼠的pH降低。出血使pCO₂显著降低，而pO₂升高，这不受高渗盐水或centhaquin复苏的影响(表1)。

在整个实验期间，对照组大鼠的血细胞比容百分比没有变化，而出血后血细胞比容显著降低(p<0.001)。出血大鼠在用高渗盐水或0.017和0.05mg/kg剂量的centhaquin复苏后，显示治疗后血细胞比容没有变化。

在整个实验期间，对照组大鼠的血液乳酸水平没有变化，而出血后乳酸水平显著增加(p<0.001)。与高渗盐水组相比，出血大鼠在用0.017和0.05mg/kg剂量的centhaquin复苏时，显示出血乳酸水平显著降低(p<0.001)(表1)。在实验期间，对照组大鼠的碱缺乏没有变化。诱发出血后，碱缺乏明显增加(p<0.001)，不受高渗盐水复苏的影响。另一方面，与高渗盐水(-16.3±1.3)相比，用0.017和0.05mg/kg剂量的centhaquin复苏的大鼠的碱缺乏显著降低(分别为-12.0±0.2和-11.6±0.5)(p<0.001)(表1)。未复苏的出血大鼠不能存活到到60分钟，因此在该时间点无法获得任何数据。

表1.centhaquin对出血大鼠的血细胞比容、动脉血pH、pCO₂、pO₂、乳酸和碱缺乏水平的影响。这些值表示为平均值±SEM，*与基线相比p<0.05；#与出血相比，p<0.05；Δ与载剂处理的组相比，P<0.05。

centhaquin对出血大鼠的平均动脉压和心率的影响。对照大鼠在实验期间未显示任何MAP变化。诱导出血后，所有治疗组的MAP均显著降低(p<0.001)。用高渗盐水复苏的出血大鼠在复苏后30或60分钟未显示MAP的任何改善。用centhaquin(0.017和0.05mg/kg)复苏的大鼠在复苏后至少60分钟内显示MAP显著增加(p<0.01)(图1)。出血前，所有组的基线HR约为345次/分钟。出血使HR略有增加(约372次/分钟)。在高渗盐水中复苏的大鼠中，在60分钟时HR下降至353±11次/分钟，而在以0.017和0.05mg/kg剂量的centhaquin复苏的大鼠中，HR分别为361±10和363±10(图1)。高渗盐水或centhaquin复苏后观察到HR无明显差异。

centhaquin对出血大鼠的心输出量和全身血管阻力的影响。所有组出血后CO均显著降低。用高渗盐水和centhaquin复苏的出血大鼠均会显著增加CO(图1)。与单独使用高渗盐水相比，在复苏后30分钟和60分钟时，使用Centhaquin复苏显著增加了CO。出血后SVR从148±5dyne*sec/cm⁵减少至77±3dyne*sec/cm⁵，并且在高渗盐水或centhaquin治疗复苏后的30分钟和60分钟后进一步降低(图1)。

centhaquin对出血大鼠的血浆ET-1水平的影响。基线血浆ET-1水平为13.6±0.87pg.ml^-1。出血后，ET-1水平显著增加至21.8±0.87pg.ml^-1(p<0.001)。在用高渗盐水治疗的大鼠中，ET-1水平为25.3±1.35pg.ml^-1，与未治疗的出血性休克组相比，无明显变化。但是，与以高渗盐水复苏的出血大鼠相比，接受centhaquin(0.017和0.05mg/kg)治疗的大鼠中ET-1水平显著增加(分别为37.9±3.03和38.3±2.7pg.ml^-1)。

centhaquin对出血大鼠的ET_A受体表达的影响。ET_A受体在脑、心脏、肝脏、肺和肾皮质中的表达没有变化(图2)。腹主动脉出血性休克后，观察到ET_A受体表达显著增加(p<0.0001)。与假对照组相比，出血大鼠腹主动脉中ET_A受体的表达增加了140％。在高渗盐水和高渗盐水+centhaquin(0.017和0.05mg/kg)治疗的出血大鼠中，与未经治疗的出血大鼠相比腹主动脉中观察到ET_A表达显著降低(分别为-48.8、-47.6和-49.2％)(图2)。大鼠出血性休克后在肾髓质中未观察到ET_A表达的变化。然而，与出血性休克相比，用centhaquin(0.017和0.05mg/kg)处理的大鼠显示出ET_A受体表达显著降低(分别为-61.3％和-70.5％)(图2)。

centhaquin对出血大鼠ET_B受体表达的影响。ET_B受体在脑、心脏、肝、肺和肾皮质中的表达没有变化(图3)。大鼠出血性休克后在腹主动脉中未观察到ET_B表达的变化。然而，与未经治疗的出血大鼠相比，接受centhaquin(0.017和0.05mg/kg)治疗的大鼠腹主动脉中ET_B受体的表达显著增加(分别为79.7％和57.4％)(图3)。与假对照组相比，肾髓质出血性休克后，观察到ET_B受体的表达显著降低(p<0.0001)(-34％)。与未经治疗的出血大鼠相比，在接受centhaquin(0.017和0.05mg/kg)治疗的出血大鼠中，在肾髓质中观察到ET_B表达显著增加(分别为76.6％和69.4％)(图3)。

centhaquin对出血大鼠的血浆IL-6、IL-10和TNF-α水平的影响。为了进一步评估centhaquin治疗是否会影响炎症反应，我们在大鼠血浆中测量了一组选择的细胞因子。总体而言，所有采用或没采用高渗盐水和centhaquin复苏的出血大鼠的血浆IL-6、IL-10和TNF-α均升高。出血性休克和高渗盐水复苏后的TNF-α和IL-6水平高于假对照组。与单独的高渗盐水相比，Centhaquin进一步增加(p<0.01)TNF-α和IL-6的水平。出血性休克和高渗盐水或centhaquin复苏后，大鼠之间的血浆IL-10差异无统计学意义(图4)。

讨论

centhaquin显著降低血液中的乳酸并恢复MAP并增强高渗盐水的复苏作用，从而证实了先前的发现(Gulati等，2012；Gulati等，2013；Lavhale等，2013；Papapanagiotou等，2016)。单独使用高渗盐水或与centhaquin配合使用，对出血性休克和复苏对不同组织中的ET_A和ET_B受体表达、血浆ET-1水平和炎性标志物的影响进行测定。发现腹主动脉和肾髓质中的ET_A和ET_B受体参与其复苏作用。出血性休克或高渗盐水或centhaquin复苏后，大脑、心脏、肺和肝脏的ET_A或ET_B受体水平未见变化。

血管ET_A受体已经被很好地确立为具有强大的血管收缩作用(Schneider等，2007)。出血导致腹主动脉中ET_A受体的表达增加。用高渗盐水和centhaquin进行复苏可明显逆转出血引起的腹主动脉ET_A受体表达增加。然而，出血性休克后ET_B受体未改变，但通过centhaquin治疗增加。出血性休克后，可能会在血管中出现血管收缩素ET_A受体的表达增加，以维持血管张力和MAP。然而，增加循环ET-1以及增加的血管ET_A受体可产生不希望的血管收缩和减少组织灌注。

另一方面，据报道出血性休克后血浆ET-1水平升高是维持血压的补偿机制(Chang等，1993；Edwards等，1994；Gulati等，1997b；Sharma等，2002)。还发现，ET-1的前体改善严重出血大鼠中基于血红蛋白的血液替代性联阿司匹灵交联的血红蛋白的复苏作用(Gulati等，1995)。在正常大鼠中，ET-1产生双阶段反应：最初的短暂下降，随后血压持续升高(Gardiner等，1994；Yanagisawa等，1988)但是，在出血的大鼠中，ET-1产生单阶段效应，其中仅观察到血压升高以及存活率提高(Jochem等，2003)。ET-1在出血大鼠中的复苏作用是通过ET_A受体介导的，因为它被特定的ET_A受体拮抗剂BQ123阻断(Jochem等，2003)。不希望受到理论的束缚，出血性休克后作为补偿机制的一部分，血管ET_A受体会增加，这种补偿机制在高渗盐水或centhaquin复苏后会逆转。出血性休克后，腹主动脉中的ET_B受体未改变，但通过centhaquin而不是高渗盐水复苏而增加。由于血管的ET_B受体会产生血管舒张(Arai等，1990；Cardillo等，2000；Yanagisawa等，1988年)因此，centhaquin诱导的血管ET_B受体表达的增加可能有助于组织血液灌注的增加，从而降低了出血大鼠的血乳酸水平。

ET受体相互之间以及与肾上腺素发生串扰。在存在ET_A受体阻滞的情况下揭示了ET_B受体脱敏的作用(Mickley等，1997)。另一方面，ET_B受体能够改变ET_A受体的药理学。研究表明，当ET_B受体被阻断时，静脉内的ET_A受体阻断作用在更大程度上抑制了ET-1诱导的收缩。(Thakali等，2008)。已证明ET_A和ET_B受体之间的串扰发生在啮齿动物的几种不同血管中(Lodge等，1995；Thakali等，2008)并且所有这些血管都具有可收缩的ET_A和ET_B受体，这表明药理性ET_A和ET_B受体相互作用需要存在可收缩的ET_B受体(Thakali等，2008)。研究表明，ET_A受体可以调节可乐定等肾上腺素能药物的心血管反应(Gulati，1992；Gulati和Srimal，1993；Lavhale等，2013年)。由于centhaquin作用于肾上腺素能受体，因此ET_A受体表达的变化可能是centhaquin对某些复苏作用的原因。

在此证明，在肾髓质中，出血性休克后ET_A受体水平未改变，但通过centhaquin降低，而在出血性休克后ET_B受体表达下降，其被centhaquin而不是高渗盐水完全减弱。在肾中，ET-1产生血管收缩并降低由ET_A受体介导的肾小球滤过率(Harris等，1991；Kon等，1989年)。通过centhaquin诱导的ET_A受体表达减少可能会降低ET-1在肾髓质中的血管收缩作用。肾外延髓是Henle的loop的粗大上升支使氯化钠大量重吸收的部位，使肾外延髓成为高代谢活动和需要更好血液灌注的部位(Cowley，2008)。因此，该区域在过度出血后极易发生缺氧或缺血性损伤。centhaquin可能通过降低ET_A受体的浓度来防止出血性休克后肾髓质区域受到缺血性损伤。另一方面，已发现ET_B受体刺激可增加通过血管扩张剂(例如NO，环加氧酶和细胞色素p-450代谢产物)介导的肾髓血流量(Hercule和Oyekan，2000；Vassileva等，2003年)。如本文所示，出血性休克降低了肾髓质ET_B受体表达，其不受盐水复苏的影响，但被centhaquin减弱。本文提供的结果表明，严重的出血会导致肾髓质中ET_B受体的表达降低，这可能导致肾髓质的血流量减少，从而导致缺血和肾衰竭。由于使用centhaquin进行复苏并不会使肾髓质ET_B受体的表达降低，因此centhaquin可能会减轻出血引起的肾髓质缺血的作用。因此，centhaquin诱导的ET_A和ET_B受体的变化均可能有助于防止出血性休克后肾髓质受到缺血性损伤。

肾髓质ET_B受体在钠和水排泄的控制中也起作用(Kohan等，2011；Schneider等，2007)。肾髓质收集管上皮中的ET_B受体主要负责抑制ET-1对钠和水重吸收的作用(Kitamura等，1989；Kohan等，2011)。发现对ET-1的利尿和利钠反应被ET_B受体拮抗剂减弱(Hoffman等，2000)。出血过多并伴有无尿或少尿的患者需要紧急医疗救助，因为急性肾衰竭是此类患者死亡的主要原因(Rossaint等，2006)。肾髓质ET_B受体表达的减少可能导致少尿，而少尿可被centhaquin减弱。可以推测，centhaquin可能是减少出血性休克介导的肾损伤的新药理学干预措施。这些发现是初步的，仅是提示性的，需要在动物研究中进行广泛研究。需要进行研究以研究centhaquin对肾血流的影响，以及这些变化是否可以被特定的ET_A和ET_B受体拮抗剂所拮抗。

在本研究中，发现出血增加了ET-1、TNF-α、IL-6和IL-10的血浆浓度。用高渗盐水复苏不会改变血浆ET-1、TNF-α、IL-6或IL-10。然而，centhaquin显著增加了血浆ET-1、TNF-α和IL-6，却不影响血浆IL-10的浓度。在杂种犬中进行的一项研究发现，出血后血浆ET-1水平升高，这与出血量相关(Chang等，1993)。ET-1增加超氧阴离子的产生和细胞因子的分泌(Kowalczyk等，2015；Virdis和Schiffrin 2003)以及转录因子(例如NF-κB)的激活和促炎性细胞因子(例如TNF-α、IL-1和IL-6)的表达。相应地，已经证明细胞因子可以调节ET-1的分泌(Breuiller-Fouche等，2005；Yeager等，2012)。

出血性休克损害了新陈代谢、细胞和炎症反应，可能导致多器官功能衰竭(Bonanno，2011；Gutierrez等，2004；Marik和Flemmer，2012)。该反应通常以出血性休克后立即出现的促炎性细胞因子如IL-6或TNF-α释放为特征(Mees等，2009)。随后是持续释放的抗炎细胞因子，例如IL-10，可能会导致免疫抑制(Oberholzer等，2000)。出血中IL-6和TNF-α产生过多生产的总体影响仍存在争议。目前的发现证实出血后血浆中TNF-α、IL-6和IL-10的水平升高。高渗盐水复苏并没有改变血浆TNF-α、IL-6或IL-10。然而，centhaquin显著增加了血浆TNF-α和IL-6，却不影响血浆IL-10浓度。先前的研究表明，ET_B受体表达的增加可能与某些促炎细胞因子的增加有关(Breuiller-Fouche等，2005；Pernow等，2000；White等，2000)。在本文中证明，centhaquin复苏增加了腹主动脉和肾髓质中的ET_B受体表达，同时升高了血浆TNF-α和IL-6的浓度。研究表明，强大的早期TNF-α反应与创伤患者的生存相关，血浆TNF-α的早期升高可用于限制器官损伤或诱导修复过程(Namas等，2009)。细胞因子IL-6似乎在炎症的全身反应中起重要作用。尽管有几项研究表明阻断IL-6在关节炎中具有有益作用(Peake等，2006)，多发性骨髓瘤(Gado等，2000)和克罗恩氏病(Atreya等，2000)，尚未发现抑制IL-6对出血性休克有益(Mees等，2009)。IL-6在对损伤的炎症反应中起双重作用，通常被分为局部促炎和全身性消炎。研究表明IL-6缺乏对热损伤，败血症和出血的实验范式具有有益作用(Fontanilla等，2000；Mommsen等，2011年；Yang等，2007年)。相反，其他研究表明，IL-6施用可预防出血引起的上皮细胞和心肌细胞凋亡(Alten等，2008；Moran等，2009)。出血性休克后全身输注IL-6可减轻肝脏和肺部的炎症和损伤(Meng等，2000)。研究还显示了TNF-α的有益作用。缺乏TNF受体的小鼠在缺血性脑损伤中有更大的梗塞(Bruce等，1996)。海马体中的TNF-α释放可能促进神经保护并激活脑微血管的修复过程以及介导神经元可塑性(Kim等，2014；Sriram和O'Callaghan 2007)。多项实验研究表明，两种细胞因子均在大脑中发挥保护作用(Bruce等，1996；Gadient等，1990；Hama等，1989；Kossmann等，1996)。尽管在本研究中，centhaquin确实增加了IL-6和TNF-α，但为了全面了解centhaquin对正常动物和出血动物的炎症影响，正在研究更多的炎症标志物，因为这些细胞因子具有执行功能具有抗炎和抗炎功能。

内皮素-1(ET-1)作用于ET_A和ET_B受体，并涉及出血性休克(休克)。本文利用高渗盐水(盐水)或centhaquin研究了休克和复苏对ET_A和ET_B受体表达的影响。将大鼠麻醉，将压力导管置于左股动脉中；从右股动脉中抽出血液，在30分钟内使平均动脉压(MAP)达到35mmHg，进行复苏，并在90分钟后处死以收集样品用于生化评估。用centhaquin进行复苏可减少血乳酸并增加MAP。休克或复苏后，大脑、心脏、肺和肝脏中ET_A或ET_B受体的蛋白质水平未改变。在腹主动脉中，休克使ET_A的表达增加(140％)，并被生理盐水和centhaquin减弱；休克后，ET_B的表达未改变，但被centhaquin增加(79％)。在肾髓质中，休克后ET_A的表达未改变，但被centhaquin降低(-61％)；休克使ET_B表达下降(-34％)，但被centhaquin而不是生理盐水完全减弱。休克引起的主动脉和肾髓质中ET_A和ET_B受体的变化被centhaquin逆转，可能有助于其功效。

总之，在出血性休克(HS)大鼠中，centhaquin显著改善了复苏。HS后施用centhaquin导致血管收缩剂ET_A受体表达减少，和血管扩张剂ET_B受体表达增加，这些改变的机制尚待确定。同样，出血性休克和使用centhaquin复苏后细胞因子升高的意义也被认为是这些变化可以改善组织血液的灌注。

在大鼠、家兔和猪模型中大量出血后，证明centhaquin具有明显的复苏作用。出血会降低ET_B受体的表达，可以预料的是，使用centhaquin进行复苏可通过增加ET_B受体的表达来减弱这种作用。具体而言，centhaquin诱导的肾髓质中ET_B受体表达的增加可能导致血管舒张作用并促进利尿和排钠尿，从而防止对肾髓质的伤害。

实施例2

下面的实施例确定了出血性休克时低剂量的centhaquin柠檬酸盐(2-[2-(4-(3-甲基苯基)-1-哌嗪基)]乙基-喹啉)柠檬酸盐明显降低血乳酸，并升高平均动脉压(MAP)、脉搏血压(PP)和心输出量(CO)(Gulati等，2012；Gulati等，2013；Lavhale等，2013；Papapanagiotou等，2016)。在centhaquin和现有复苏剂之间进行比较研究，复苏剂分为3个不同类别：(a)液体，如乳酸林格氏液，高渗盐水；(b)肾上腺素能药物，如去甲肾上腺素，以及(c)新鲜血液。我们使用(i)恒压出血的大鼠模型，(ii)未控制的创伤出血的兔模型和(iii)大量出血的猪模型的结果表明，centhaquin对降低低血容量性休克后的死亡率非常有效(Gulati等，2012；Gulati等，2013；Lavhale等，2013；Papapanagiotou等，2016)。与其他复苏剂(升压药)不同，centhaquin通过增加中风体积(SV)和CO来增加MAP；并降低心率和全身血管阻力(SVR)。Centhaquin目前正在临床开发中用作出血性休克的复苏剂。

出血性休克是外伤后发病和死亡的主要原因，尤其是在受伤初期(Wu等，2009)。出血性休克造成的大多数死亡发生在创伤后的最初6小时内(Shackford等，1993)，并且这些死亡中的大多数可以避免(Acosta等，1998)。休克伴有循环衰竭，这主要是造成死亡率和发病率的原因。当前推荐的使用大量乳酸林格(LR)溶液的液体疗法可有效恢复血液动力学参数，但存在逻辑和生理学限制(Vincenzi等，2009)。以大量晶体复苏与继发性腹腔室综合征、肺水肿、心脏功能障碍和麻痹性肠梗阻有关(Balogh等，2003)。出血性休克的循环衰竭的继发性后遗症是肾衰竭，大量液体复苏可能会加重肾衰竭。出血性休克后急性肾损伤和肾衰竭的发生率非常高，许多患者需要肾替代治疗。出血性休克中肾衰竭的病理生理是内脏和肾血管收缩的结果，其将血流引导至心脏和大脑，但可能导致肾缺血性损伤。在近端小管的笔直部分和亨利the的厚上升肢中，肾小管细胞的损伤最为突出，尤其是当其浸入相对缺氧的髓质时。近端肾小管细胞的变化是根尖泡和刷状缘膜的丧失，继而丧失极性和紧密连接的完整性。在细胞水平上，局部缺血会导致三磷酸腺苷(ATP)耗竭、胞质钙增加、自由基形成、膜磷脂代谢以及细胞体积调节异常。

方法

动物研究在使用之前，将Sprague-Dawley雄性大鼠(340至380g)(Envigo,Indianapolis,IN)在受控温度(23±1℃)、湿度(50±10％)和光照(6：00AM到6:00PM)饲养。食物和水不断供应。动物护理和用于实验程序的用途已获得Midwestern University机构动物保护和使用委员会的批准。所有麻醉和手术程序均符合动物保护委员会制定的指导原则。

药品和化学品在Pharmazz India Private Limited,Greater Noida,India合成了centhaquin柠檬酸盐(PMZ-2010)。使用氨基甲酸酯(氨基甲酸乙酯)(Sigma-Aldrich StLouis,MO,USA)，盐水注射剂，USP(Hospira,Inc,Lake forest IL,USA)和肝素钠注射剂USP(APP Pharmaceuticals,LLC,Schaumburg,IL,USA)。

心血管反应的测定用溶于等渗盐水中的氨基甲酸酯麻醉动物。通过腹膜内注射以每千克体重1.5g的剂量施用氨基甲酸酯。选择氨基甲酸酯作为麻醉剂是因为它可产生持久的麻醉(8-10小时)，并且心血管和呼吸系统的压抑程度最小。它产生一定程度的外科麻醉，其特点是可以保护心血管反射(Maggi和Meli1986)。简而言之，麻醉的大鼠是固定在配有可控加热垫的手术板上。使用气管切开插管连接到啮齿动物呼吸机(Model 683,HarvardApparatus Inc.,Holliston,MA)，维持血Po₂、Pco₂和pH值，。通过使用压力导管SPR-320(Millar Instruments)对左股动脉进行插管来测量MAP和HR，通过AEC-10C连接器连接到ML221桥式放大器(AD Instruments)，并使用PowerLab 16/30数据采集系统采集信号(1000S^–1)(Gulati等,2012；Pacher等,2008)。Perimed激光多普勒血流探头放置在肾髓质中以测量血液灌注，并在PowerLab 16/30数据采集系统上获得数据。左股静脉插管使用PE 50管(Clay Adams，Parsipanny，NJ)插管并固定进行复苏。

动脉血气和碱缺乏的测定在诱发休克前、诱发休克后30分钟、以及在载剂或centhaquin复苏后30和60分钟监测基线动脉血pH值、Po₂、Pco₂、Na⁺、K⁺和乳酸。使用血气采样注射器(Innovative Medical Technologies,Inc.Leawood,KS)从动脉套管中抽取血样(0.15毫升)，然后使用pHOx Ultra分析仪(Nova Biomedical Corporation，Waltham，MA)进行分析。使用下式计算碱缺乏(Davis等，1998；Paladino等，2008)：

SBD＝0.9287×[HCO₃ ^--24.4+14.83×(pH-7.4)]

出血性休克的诱发通过以大约0.5到1mL/min的速度从股动脉中抽血直至MAP达到35mmHg来诱发出血。如有必要，可通过进一步抽血将该MAP维持30分钟。本研究中使用的出血性休克模型是建立良好的可处理压力性出血的啮齿动物模型(Buehler等，2000；Gulati等，1997；Gulati和Sen，1998)。每只出血大鼠的量约为8.0ml，并且在各组中出血量相似，约占总血液的40％。在各组中测得的血细胞比容水平相似。抽血的时间约为15分钟。

实验设计为了确定出血性休克中centhaquin对心血管系统的复苏作用，将大鼠随机分为三组：在复苏的前10分钟内给出血的大鼠施用100％出血量的生理盐水(载剂)；100％出血量的生理盐水加centhaquin(0.01mg/kg)；或100％出血量的生理盐水加centhaquin(0.10mg/kg)。还进行了其他实验，以确定在正常生理盐水(NS)或centhaquin(0.01mg/kg)处理的大鼠(体积等于出血量)中将MAP维持在70mmHg时所需的去甲肾上腺素(复苏过程中非常常用的血管加压药)的量。

统计分析使用GraphPad Instat-2.00进行了功效分析。功效设置为80％(β＝0.8)，使用的显著性水平(α)为0.05。功效分析表明，当显著性水平α＝0.05时，每组5个心血管样本量和4个生化评估样本量足以达到80％的功效。数据表示为平均值±SEM。差异的显著性是通过对方差的单向分析，然后进行事后检验(Bonferroni方法)来估计。P值小于0.05被认为是显著的。统计分析使用GraphPad Prism 7.00(GraphPad，San Diego,CA,USA)进行。

结果

centhaquin对出血大鼠的动脉血pH、pO₂、pCO₂、血细胞比容、血乳酸和碱缺乏的影响。出血后大鼠的血pH值显著下降，而用生理盐水后又进一步下降。施用centhaquin(0.01和0.10mg/kg)可以显著防止出血大鼠的pH降低。出血使pCO₂显著降低，而pO₂升高，这不受盐水或centhaquin复苏的影响。

在整个实验期间，对照组大鼠的血细胞比容百分比没有变化，而出血后血细胞比容显著降低。用生理盐水或centhaquin复苏的出血大鼠在治疗后血细胞比容无变化。

在整个实验期间，对照大鼠的血乳酸水平没有变化，而出血后乳酸水平显著增加。与生理盐水组相比，用centhaquin复苏的出血大鼠的血乳酸水平降低。

centhaquin对出血大鼠的平均动脉压(MAP)的影响。对照大鼠在实验期间未显示任何MAP变化。诱导出血后，所有治疗组的MAP均显著降低。用盐水复苏的出血大鼠在复苏后仅显示MAP的短暂改善。用centhaquin(0.01和0.10mg/kg)复苏的大鼠在复苏后显示MAP显著增加(p<0.01)。

centhaquin对出血大鼠的肾血流灌注的影响。用载剂(盐水)或低剂量centhaquin(0.01mg/kg)或高剂量centhaquin(0.1mg/kg)使出血大鼠复苏。在诱发休克前，休克(出血)后30分钟，以及复苏后10、30、60、90和120分钟，测量了centhaquin对肾血液灌注的影响。与等量的生理盐水相比，低剂量的centhaquin显著改善出血的雄性大鼠的肾血液灌注。这种改善的肾髓质血液灌注提示使用centhaquin来预防或治疗肾损伤(图5)。与等体积的生理盐水相比，centhaquin显著改善了出血雌性大鼠的肾血液灌注(图6)。还发现低剂量的0.02mg/kg的centhaquin有效增加进行20分钟肾动脉闭塞的出血大鼠的肾血流量。0.2mg/kgcenthaquin的十倍高剂量在增加肾血流方面没有与低剂量0.02mg/kgc enthaquin相同的功效。因此，低剂量(0.02mg/kg)的centhaquin比高剂量(0.2mg/kg)的centhaquin在改善遭受20分钟肾动脉闭塞的出血大鼠的肾血流方面更有效。

雄性大鼠用氨基甲酸乙酯麻醉。将股静脉插管以进行药物施用，将股动脉插管以测量平均动脉压(MAP)，并且将激光多普勒血流探头置于肾髓质中以测量血液灌注。通过抽血使MAP维持在35mmHg 30分钟来引发出血性休克。进行去甲肾上腺素输注以使MAP维持在70mmHg。在诱发休克前，休克(出血)后30分钟以及复苏后15、30、45、60、75和90分钟测量了centhaquin对心血管功能的影响。与复苏后的载剂对照相比，centhaquin改善了出血的雄性大鼠的肾血液灌注。去甲肾上腺素引起的血管收缩的不良反应可以通过centhaquin减轻(图7)。同样，复苏后与载剂对照相比，centhaquin改善了出血雌性大鼠的肾血液灌注，并且直到实验结束时观察到血液灌注也有所改善(图8)。去甲肾上腺素引起的血管收缩的不良反应可以被centhaquin减轻。

实施例3

进行一项前瞻性的多中心随机双盲平行II期研究(CTRI/2017/03/008184)，以盐水为对照，PMZ-2010(centhaquin)作为出血过多引起的低血容量性休克的复苏剂。所有受试者均接受标准的休克治疗(登记机构将提供的治疗类型和护理)。将患者随机分配至接受标准治疗和生理盐水治疗的对照组(N＝7)，或接受标准治疗和PMZ-2010的PMZ-2010组(N＝12)。中期分析显示两组中患者的可比人口统计数据(表2)。

表2.一项中期分析显示了II期研究的两组中患者的可比人口统计数据。

研究用药物PMZ-2010达到了安全性的主要终点，并且未报告不良事件。在PMZ-2010中治疗所需的给药次数少于对照组(表3)。在总住院时间中，接受PMZ-2010治疗的患者在重症监护病房的时间仅为39.3％，而对照组为57.3％。PMZ-2010组患者在呼吸机上花费的时间仅为0.85±0.71天，而对照组患者则为5.09±3.14天。在复苏的前48小时内，接受PMZ-2010治疗的患者需要的总液体量减少了19.9％；类似地，与对照组相比，PMZ-2010治疗组在前48小时内施用的总血液制品减少了23.4％。对照组在复苏后48小时，收缩压较基线(入组时)增加了34.5％，而在PMZ-2010治疗组中则观察到增加45.2％(图9)。同样，复苏后48小时，对照组的舒张压升高了15.4％，而PMZ-2010治疗组的舒张压却升高了34.9％(图9)。复苏前48小时所需的血管加压药总量在对照组中为18.4±12.1mg，而在PMZ-2010治疗的患者中仅需要1.3±1.2mg。对照组的血液乳酸水平降低了47％，接受PMZ-2010治疗的患者中血液乳酸水平降低了63％。对少量患者的中期分析表明，PMZ-2010改善了许多参数，这些参数表明了其作为复苏剂的有效性。

表3.II期研究的患者被随机分配至：接受标准治疗并接受生理盐水治疗的对照组，或接受标准治疗和PMZ-2010治疗的患者。根据批准的方案进行的中期分析显示，治疗PMZ-2010所需的给药次数少于对照组。尽管在统计学上不显著，但有一种趋势表明复苏比标准治疗更有效，并且所需剂量减少了约25％。

患者在研究中入院时(基线)和出院时(研究结束)确定血清肌酐水平。根据批准的方案进行的中期分析显示，对照组中的血清肌酐水平降低了25.35％，在PMZ-2010治疗的患者中降低了42.61％。数据表明，PMZ-2010对血清肌酐水平的降低比标准治疗增加17.26％。参见图10。

患者在研究中入院时(基线)和出院时(研究结束)确定了血液尿素氮。根据批准的方案进行的中期分析显示，对照组和PMZ-2010治疗患者的血尿素氮相似。参见图11。

患者在研究中入院时(基线)和出院时(研究结束)确定肾小球滤过率。根据批准的方案进行的中期分析显示，对照组中的肾小球滤过率提高了40.00％，在PMZ-2010治疗的患者中提高了81.52％。数据表明，与标准治疗相比，PMZ-2010的肾小球滤过率增加了41.52％。参见图12。

讨论

急性肾功能衰竭的主要特征是肾小球滤过率(GFR)突然下降，导致含氮废物(尿素，肌酐)的滞留。在全世界，每年每百万人口中有170-200例严重的急性肾衰竭病例。迄今为止，尚无针对急性肾衰竭的特异性治疗方法。已发现几种药物可改善毒性和缺血性实验性急性肾衰竭，表现为较低的血清肌酐水平，减少的组织学损伤和不同动物模型中肾功能的更快恢复。这些包括抗氧化剂、钙通道阻滞剂、利尿剂、血管活性物质、生长因子、抗炎药等，但是，已经在临床试验中研究过的那些药物没有显示出任何益处，并且尚未批准将其在急性肾衰竭中的应用。前述实施例证明了centhaquin及其盐在预防和/或治疗急性肾衰竭的患者中的应用。

在大鼠、家兔和猪模型中大量出血后，证明centhaquin具有明显的复苏作用。在低血容量性休克患者中发现，centhaquin是一种有效的复苏剂，并且导致肾髓质血流量增加，并降低血清肌酐水平。此外，在低血容量性休克患者中，centhaquin增加肾小球滤过率。预期的是，centhaquin及其盐将导致血管舒张作用并促进利尿和排钠，并通过增加肾小球滤过率和降低血清肌酐水平来改善肾功能。

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Claims (22)

1.一种通过向有需要的个体施用治疗有效量的内皮素B(ET_B)受体激动剂来预防或治疗肾损伤或肾衰竭的方法。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述ET_B受体激动剂选自由N-琥珀酰-[Glu⁹,Ala^11,15]内皮素1(IRL-1620)、BQ-3020、[Ala^1,3,11,15]-内皮素、角蝰毒素S6c和内皮素3组成的组。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述ET_B受体激动剂以约0.0001mg/kg至约0.5mg/kg的剂量施用。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述方法包括施用多剂量的所述ET_B受体激动剂。

5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述施用包括单剂量的所述ET_B受体激动剂。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体施用治疗有效量的centhaquin或其盐。

7.如权利要求1到6中任一项所述的方法，其中，所述肾损伤或肾衰竭是急性的。

8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述肾衰竭是由暴露于放射造影剂、非类固醇抗炎药(NSAID)、抗生素、化学治疗剂、利华单抗引发的急性肉芽肿性肾小管间质性肾炎、或肾毒性药物引起的。

9.如权利要求7所述的方法，其中，所述急性肾衰竭由以下疾病引起的或与之相关：严重疾病、心输出量减少、创伤、血液氧合减少、由于对另一器官的损伤的反应引起的全身毒性、由心肾综合征、心脏手术或急性失代偿性心力衰竭引起的全身性低血压、由于出血造成的循环体积降低、败血性休克、低血容量性休克、严重登革热、外科手术、横纹肌溶解、或肝肾综合征或肝移植引起的局部肾血流量减少、或腹泻、呕吐、利尿剂或出汗过多引起的脱水引起的循环量减少。

10.如权利要求6至9中任一项所述的方法，其中，所述个体的肾小球滤过率提高。

11.如权利要求6至10中任一项所述的方法，其中，所述个体的血清肌酐水平降低。

12.一种组合物，其包含：(a)内皮素-B(ET_B)受体激动剂、(b)centhaquin或其盐、和任选地(c)赋形剂。

13.一种制品，其包括：

(a)经包装的组合物，其包含内皮素-B(ET_B)受体激动剂和centhaquin或其盐；

(b)提供说明用于同时或相继施用ET_B受体激动剂及centhaquin或其盐以治疗患者的说明书；和

(c)用于(a)和(b)的容器。

14.如权利要求13所述的制品，其中，所述内皮素-B受体激动剂是N-琥珀酰-[Glu⁹,Ala^11,15]内皮素1(IRL-1620)。

15.一种治疗患有急性肾功能下降的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的包含centhaquin或其盐的组合物。

16.如权利要求15所述的方法，其中，所述急性肾功能下降与急性肾衰竭相关。

17.如权利要求16所述的方法，其中，所述急性肾衰竭由以下疾病引起或与其相关：严重疾病、心输出量减少、创伤、血液氧合减少、由于对另一器官的损伤的反应引起的全身毒性、由心肾综合征、心脏手术或急性失代偿性心力衰竭引起的全身性低血压、由于出血造成的循环体积降低、败血性休克、低血容量性休克、严重登革热、外科手术、横纹肌溶解、或肝肾综合征或肝移植引起的局部肾血流量减少、由药物、放射性造影剂、非甾体抗炎药(NSAID)、抗生素或化学治疗剂引起的肾毒性、或腹泻、呕吐、利尿剂或出汗过多引起的脱水引起的循环量减少。

18.一种治疗患有肾损伤的个体的方法，其包括施用有效量的包含centhaquin或其盐的组合物。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述肾损伤由缺血事件或缺血再灌注事件引起。

20.如权利要求6至19中任一项所述的方法，其中，所述盐是柠檬酸盐、丙酮酸盐或乳酸盐。

21.如权利要求6至20中任一项所述的方法，其中，以约0.0001mg/kg至约1.0mg/kg的剂量施用centhaquin或其盐。

22.如权利要求21所述的方法，其中，centhaquin或其盐以单剂量或多剂量施用。

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