CN1124656A - 协同多糖修饰的药用生物应答调节剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有医药应用价值的生物应答调节剂(BRMS)体外糖基化修饰。该修饰是用与BRMS有协同抗癌和(或)免疫增强作用的多糖或其衍生物同BRMS共价结合，使其药用价值获得如下改善：(1)抗癌及免疫调节效能增强；(2)适应症拓宽；(3)体内半衰期延长，免疫原性降低，抗蛋白水解酶水解能力提高。从而起到提高抗癌和免疫调节效能，减少用药量、降低毒副作用，简化治疗程式的作用。

Description

协同多糖修饰的药用生物应答调节剂

癌症是世界上仅次于心血管系统疾病的第二大死亡性疾病。据统计，1991年全世界癌症新发病人约900万，需要治疗的新老病人超过2000万，此数字还在逐年增加。在这些危难病人中，除少数可单纯采用手术或放疗这类局部治疗之外，绝大多数病人——包括全身性肿瘤的病人，抗癌药可以治愈的病人，手术或放疗不能控制复发和转移的病人等，都需要首选或辅以抗癌药进行全身或局部治疗。就大多数肿瘤来说，目前尚无有效根治的良药，因此抗癌新药的研制刻不容缓。

Oldham肿瘤生物学疗法认为，正常情况下肿瘤细胞与机体防御之间处于动态平衡之中，肿瘤的发生乃至增殖与播散完全是这种动态平衡失调所致，即肿瘤是一种免疫失调综合症。如果将已失调的状态人为地调到正常水平就可能控制肿瘤的生长并使其消退。近年来的各种研究证实，宿主抗肿瘤作用主要通过免疫活性细胞或其释放的免疫效应分子来实现。换言之，宿主对肿瘤的生物学反应主要是免疫反应。因此，生物学疗法主张通过从体外补充、诱导或活化体内本来固有的生物应答调节剂(Biological Response Modifiers，BRMS)系统的具有细胞毒活性的免疫活性细胞和(或)因子，来调整这种对抗肿瘤细胞的生物应答反应。

BRMS是一类能改变宿主、肿瘤或二者生物学过程的，其结果却改善了机体耐受或排斥细胞能力的高活性物质〔J Clin Pharm.1992，32(1)：2〕。具体讲，BRMS是一类具有下列某种或几种特性和用途的生物活性物质：

1、通过刺激作用来增强效应细胞的活性，或者提高其数量，或者提高可溶性介质的产生，如淋巴因子和(或)单核因子等来直接增强机体的抗肿瘤反应；

2、通过减少和(或)解除荷瘤宿主的免疫抑制来间接提高机体对抗肿瘤的免疫应答能力；

3、能使机体成为一种天然的和(或)合成的效应器或介体来提高机体的防御能力；

4、能通过细胞毒性的方式来提高机体耐受损害的能力，如增加骨髓白细胞前体；

5、能充分改变肿瘤细胞膜的特性以提高其免疫原性，改变其转移方式，以使其更易被免疫机制或细胞毒性药物所杀伤；

6、能阻止或逆转肿瘤细胞的恶变，或促进肿瘤细胞的分化和成熟，使其趋向正常化。

宿主对肿瘤的生物学反应主要是免疫反应，除此之外还涉及各种与肿瘤增殖相关的调控基因和因子等。传统的免疫疗法只是生物疗法中的一个重要组成部分。

BRMS在组成上主要分为两大类，一是能够刺激或改善机体抗肿瘤免疫防御系统机能的化学分子和生物分子；二是具有直接杀伤肿瘤细胞作用的细胞产物和免疫活性细胞。目前在BRMS中进展最活跃也是最重要的成员是各种细胞因子(Cytokines)。常见的有如：干扰素系列(IFN-α、β、γ)，白细胞介素系列(IL-1-13)，肿瘤坏死因子系列(TNF-α、β)，集落刺激因子(G、M、GM-CSF)，转化生长因子(TGF-α、β)、促红细胞生成素(EPO)等。由此而发展起来的细胞因子疗法(Cytokines Therapy)以输注(补充)或阻断(拮抗)细胞因子等为基本内容。

做为一种较理想的药物，高效、低毒是其两大基本要求，缺一不可。然而许多抗癌药物只注重了对肿瘤细胞的强力杀伤及抑制，却未能有效地减少毒付作用。应当指出的是，减少抗癌药物毒付作用对于肿瘤治疗来说具有尤为重要的意义，这是因为与有些病症患者相比，肿瘤患者的体质及耐受力都相当弱，一方面，体内恶性增殖的肿瘤细胞通常以有氧酵解方式耗能，这种低效供能方式造成机体能量的大量耗竭；另一方面，宿主又以糖异生和负氮平衡来补充这种高能耗，因此导致患者日渐消瘦、恶病质、免疫功能低下；另外再加上中晚期肿瘤出现的转移及各种并发症，患者已全身心衰竭，此时的治疗如果带有较大毒付作用则必将使已经严重衰竭的机体雪上加霜，此时既使药物能发挥一定的抗癌效果也常会因患者无力承受毒付作用而使治疗趋于失败。这也是毒付作用较大的放疗和化疗常趋于失败的主要原因。

通常，许多原型药物(Prototype Drug)都有各自的局限性，临床应用会有各种问题需要克服，BRMS也不例外。这些问题常见的有：疗效欠佳，适应症窄，半衰期短，免疫原性和严重毒付反应等。例如：在BRMS中占有重要地位的白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一种分子量约1.5万的小蛋白，由活化的T淋巴细胞产生，能够诱发细胞毒T细胞的成熟，诱生多种细胞因子，促进T、B细胞、NK细胞等的增殖、分化和补充，介导IFN-γ启动的NK细胞杀伤活性和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)活力，提高机体识别和杀伤肿瘤细胞的能力，在肿瘤的生物治疗中占居重要地位。1992年美国FDA正式批准基因重组IL-2(rIL-2)投放市场，用于癌症等疾病的治疗。

然而IL-2的临床使用并不理想，有不少问题需要克服，这些问题主要有：(1)IL-2单药使用有效率低，而且适应症较窄，如主要对肾细胞癌、恶性黑色素瘤和结肠癌有效。(2)毒付作用较大，主要原因是大剂量用药所致，而这又取决于IL-2血药半衰期太短(只有约3-6分钟)。为了维持IL-2在血液中的有效浓度和时间，临床只好推荐采用大剂量和长时间静脉滴注，这不仅把给药方式复杂化，而且亦往往造成严重的毒付反应，常见的如毛细血管漏出综合症(Capillary Leak Syndrome，CLS)，主要表现有体液潴留和向心性水肿，多器官功能失调等，相关死亡率较高〔N Engl J Med.(1987)316，889〕。(3)过敏反应：原核细胞表达生产的人IL-2未经糖基化修饰，其免疫原性明显高于天然的糖基化IL-2，长期使用易产生过敏反应，这种免疫原性增强的原因可能与相关糖基化位点的暴露有关。(4)由于IL-2疏水性强，水溶性较差，而且有一定免疫原性，致使IL-2给药方式通常采用静脉滴注，不宜采用较简单的肌肉或皮下(大剂量)注射。IL-2的这些缺憾也或多或少地存在于其它BRMS中，尤其是rDNA技术生产的治疗用细胞因子。

本发明旨在通过一种独特的糖基化修饰作用对那些有应用缺憾的BRMS进行改造，以提高疗效，拓宽适应症，降低毒付反应。

糖基化(Glycosylation)是蛋白质(天然)存在的一种普遍形式，即大多数蛋白质都是糖蛋白，当然蛋白类药物也不例外。糖蛋白中的糖基(链)通常具有如下功能：参与分子、细胞的识别与调控，增强蛋白分子的生物学和物理化学稳定性，提高蛋白质溶解性等。一般来说，同一种蛋白质糖基化的比未糖基化的要稳定〔Pazur，J.H，eta 1，Biochem.Biophys.Res，Commun.1970，40：110〕。rDNA技术生产的重组蛋白产物中，真核细胞(如酵母菌)表达的蛋白质是经糖基化修饰的糖蛋白，然而不同的表达宿主修饰的糖链可能不同，人体使用可能有潜在的免疫原性；原核细胞(如E.Coli)则缺乏糖基化机制，生产的重组蛋白是未经糖基化修饰的，因此造成某些蛋白质糖基依赖的生物活性的丢失，或者由于某些敏感位点缺乏糖链的防护而呈现免疫原性或易被蛋白水解酶降解。

需要指出的是糖蛋白的糖链通常只是较小的寡糖链，虽然它仍然有着丰富的生物活性，但对于蛋白质药学性质的贡献可能是非常有限的。例如：这种寡糖链不能较好地阻止蛋白水解酶对敏感部位的水解和阻断免疫原性及抗体对它的中和反应，也不能明显增加蛋白质的Stock’s流体半径，降低肾脏对小分子量蛋白质药物的排出速度。甚至有的糖链由于易被某些代谢器官俘获并降解而降低药效，因此，又需要进行脱糖基化(deglycosyhtion)或(再)糖基化〔(re)glycosylation〕。

迄今为止，多糖用于蛋白质体外修饰虽然已有部分成功报道，但与本发明有着明显不同。首先，前者采用的多糖主要发挥的是一种防护剂或载体作用，采用的多糖是没有显著相关协同治疗作用的“中性”分子，如临床上常用的血容量扩充剂右旋糖苷(Dextran)。而本发明则是在发挥多糖作为防护剂和(或)载体作用的同时，刻意发挥多糖的协同治疗作用，一改单一药剂的孤军奋战，具有多重协同促进的功效，这对于肿瘤生物治疗来说无论在战略上亦或战术上都其有重要意义；另外，目前尚没有具有协同抗癌作用的多糖用于BRMS，尤其是重组细胞因子的共价修饰；而且，本发明还涉及提供一种新型的协同多糖修饰的氧化型或还原型BRMS结合物，以及一种体外共价修饰后的氧化复性及还原的方法。

本发明的主要特征在于：(1)协同抗癌作用的多糖共价修饰BRMS，增强BRMS修饰物的抗癌效能；(2)拓宽适应症；(3)减少毒付作用；(4 )涉及一种协同多糖修饰的氧化型或还原型BRMS结合物；(5)涉及一种体外共价修饰后氧化复性或还原的方法。

具体来说协同多糖对BRMS共价修饰的意义在于：

1、协同调控机体的抗肿瘤反应：肿瘤是一种免疫失调综合症。肿瘤的发生与发展同机体的免疫机能状况直接相关，当免疫功能低下或障碍时机体缺乏对异已和恶变的肿瘤细胞的有效清除使其乘机滋生繁延。另外对于那些亟需治疗的中晚期肿瘤患者来说，肿瘤细胞分泌大量免疫抑制因子使机体的免疫监管(Immuno Surveillance)机能陷入恶性循环。临床研究表明，肿瘤患者体内主要的免疫活性细胞，如外周血淋巴细胞(PBL)、荷瘤组织区域淋巴结(PLNL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、LAK及NK细胞的活性明显降低，并与病程进展正相关〔LeFever AV.etal，Cancer Res.1991，51(15)：5596〕。在这种免疫抑制状态下单独使用多糖或BRMS的疗效是非常有限的。因此提高疗效首先应解除免疫抑制。这方面协同多糖效果显著。例如：香菇多糖(Lentinan，LNT)是一种有效的广谱免疫增强剂，能有效解除肿瘤患者的免疫抑制，提高淋巴细胞转化增殖率，恢复和提高机体非特异免疫机能。肿瘤患者血清中含有一种免疫抑制因子，是一种α-球旦白，可以抑制混合淋巴细胞反应、淋巴细胞转化及NK细胞活力。LNT能够抑制这种免疫抑制因子的产生，并诱发产生一种新的β-球旦白，对上述三种免疫指标均有活化刺激作用。

IL-2是一种内源性淋巴因子，在免疫调节网络中处于重要地位。其抗肿瘤作用主要表现在诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)、TIL及LAK的细胞毒活性。这些细胞活性的诱导不仅需要较高的IL-2浓度，还需要良好的机体免疫状态。在低下的免疫状态下既使高剂量IL-2也难以形成较高的细胞毒活性，但如果有LNT的协同作用，既使低浓度IL-2也能获得很高的杀伤活性。因此协同治疗能起到事半功倍的效果；不仅用药量相应减少，毒付反应减轻，而且疗效更佳。然而本发明又不同于简单的联合治疗或复方制剂，而是建立在糖基化共价修饰基础之上的，因此除了协同增强抗癌效能之外又赋予该修饰物许多优点。

2、拓宽适应症。在机体的抗肿瘤免疫机制中细胞免疫占主导地位。其中特异杀伤肿瘤细胞的主要是CTL(在肿瘤间质中是TIL)。CTL识别靶细胞过程需要肿瘤细胞同时提供两种表面信息，一种是肿瘤相关抗原(TAA)，另一种是主要组织相容性抗原复合体(MHC)，这即所谓的T淋巴细胞识别抗原的MHC约束性。然而，许多肿瘤(尤其是自发瘤)都没有或很少有TAA表达，有的甚至MHC复合物表达还有缺陷，因此能诱发机体特异性免疫反应的肿瘤细胞较少。所以IL-2的抗瘤谱较窄。

鉴于此，宿主的非特异性(天然)免疫机制在抗肿瘤反应中占有非常重要的地位。例如：NK细胞与T细胞不同，能对绝大多数肿瘤细胞显示细胞毒作用，无论其是否呈现免疫原性(TAA)，并且其识别及效应不受MHC的约束。另外，巨噬细胞(M_ )的活化，体液免疫的加强等也可介导多种抗肿瘤反应，例如：抗肿瘤抗体激活补体系统或发挥M_的抗体依赖介导的细胞毒(ADCC)效应溶解肿瘤细胞。充分活化的免疫系统分泌的多种细胞因子对肿瘤细胞亦有直接或间接杀伤作用。而且还能协同促进IL-2的治疗作用。LNT作为一种典型的广谱免疫增强剂能活化多种免疫活性细胞(如NK、M_)及补体的抗肿瘤反应。用于修饰可以提高机体的非特异免疫反应机能，对抗更多种肿瘤。

3、提高药效、降低毒付反应。本发明是一种独特的糖基化修饰，与BRMS共价结合的多糖除了发挥上述协同作用之外，还能起到“防护剂”(Protectants)的作用，即由于多糖的空间位阻关系使BRMS逃逸某些不利的识别反应，降低免疫原性，增强抗蛋白水解酶及抗体中和的能力；另外也可以发挥多糖的“载体”(Carriers)作用，增强BRMS分子的Stock’s流体半径，延缓肾脏对它的排出。因此可以延长BRMS的血药半衰期，提高药效、减少用药量，降低毒付作用，简化治疗程式，提高患者生存质量。

4、结合物的氧化复性及还原。蛋白质的氧化复性主要指分子内二硫键(-S-S-)的形成，二硫键是否形成以及配位是否准确对其活性有重要影响。正确的二硫键有助于形成正确的分子构象，因此活性就高；反之错误配位的复性活性就低甚至没有活性。例如：IL-2在还原态时有3个游离的巯基，分别位于第58、105、125位半胱氨酸侧链上，正确的氧化复性是第58和105位巯基形成二硫键。目前，许多rDNA技术生产的重组蛋白或多肽是以不溶性(无活性)的包涵体形式在宿主体内表达，因此这些产物的后处理均涉及包涵体的还原变性溶解及氧化复性的问题。变性溶解通常要加入还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇(β-Me)，还要加入高浓度变性剂如脲素、盐酸胍、SDS等。复性过程通常以低温、低浓度较为有利于正确复性，但低浓度由于体积稀释较大给生产制备带来许多问题和不便，因此提高正确复性时的浓度具有重要意义。本发明涉及的修饰作用能有效减弱BRMS分子间的相互作用，尤其对于疏水性较强的分子(如IL-2)能防止形成聚合体甚至凝集，为分子的正确折叠及复性创造了良好的环境，复性浓度可以提高到1mg/ml水平，可以简化工艺流程。

有的BRMS制品还原态仍然具有良好的生物活性(如IL-2)，当然这种还原态只是外在产品阶段，在使用过程中由于在体内或体外均有极大稀释，而且机体的内环境有利于二硫键的形成，因此使用中不可避免地会高效复性并呈现良好的生物活性。事实上，人体自己合成的IL-2开始也是还原态的，也是在体内完成氧化复性的。因此给患者使用二硫键构成并不复杂的还原型BRMS或其结合物是可行的。可以省略BRMS制备工艺中常规的氧化复性步骤。

本发明涉及的协同多糖修饰的BRMS结合物包括氧化型和还原型。由于巯基在低于PH6的情况下氧化极慢，因此还原型的该结合物通常应保持在PH6以下的弱酸性环境中。

本发明涉及的BRMS是BRMS武库中那些有必要及可能采用本发明提高治疗效能、降低毒付反应的部分。例如：细胞因子中的白细胞介素系列(IL-1～13)，干扰素系列(IFN-α、β、γ及其亚型)，肿瘤坏死因子系列(TNF-α、β)，集落刺激因子系列(G，M，GM-CSF)等。这些BRMS成员可以是原型药物(Prototype Drug)，亦可以是其类似物或衍生物。

对于蛋白质或多肽这类一级产物来说基因的突变、插入、删除、融合及杂交是获取其类似物或衍生物的常用方法。例如IL-2突变类似物基本上是基于原始IL-2的氨基酸(aa)顺序的变异得到的。所说的变异包括aa的加入，结构aa的缺失或被不同的aa取代。其衍生物包括IL-2与其它蛋白质或多肽的基因融合表达的杂交蛋白。

所说的aa加入包括至少加入一个aa。

结构aa的缺失包括至少缺失一个IL-2结构aa。

结构aa被不同的aa取代包括至少一个IL-2结构aa被至少一个不同的aa取代。

在加入了至少一个aa的IL-2变异蛋白质中，所说的至少一个aa不包括衍生于用于多然表达的起始密码子和信号肽的Met。

被加入的aa的数目也可以是一个，但只要不丧失IL-2的基本特性，也可以是任何数目。更可取的是这些aa包括蛋白质的某些或所有aa顺序。这些顺序与IL-2有同源性，并表现具有与IL-2的aa顺序相似的活性。

结构aa的缺失的数目，只要不丧失IL-2的基本特性，可以是任何数目。

取代前结构aa的例子包括CySH和Cys，但较好是CySH。另外，取代前的结构aa还包括Asp、Arg、Gly和Val。当取代前的结构aa为CySH时，以中性aa作为取代aa较好。中性aa包括Gly、Val、Ile、Tyr、Phe、His、Trp、Ser、Thr和Met。特别常用Ser、Thr和Ala，如CySH125＞Ser125，CySH125＞Thr125，和CySH125＞Ala125等。

当被取代的前结构aa为CySH以外的其它aa时，常选择其亲水性、疏水性和电荷不同于被取代aa的aa。例如取代前的aa为Asp时，取代aa常用Asn、Thr、Val、Phe、、Arg，尤其选择Asn和Arg。

用定点诱变方法产生突变蛋白的技术是已知的，如参见：R.F.Lather and J.p.lecoq.Genetic Engineering(1983)PP31-50，Academic Press；M.Smith and S.Gillam，Genetic Engineering：Principles and Methods(1981)3，PP1-32.Plenum Press。

本发明所谓“协同多糖”中的“协同”是指用于修饰的多糖对于被修饰的BRMS的治疗作用具有促进和(或)增强作用，它可以在发挥多糖自身的抗癌和(或)免疫调节作用的同时直接和(或)通过其效应间接刺激BRMS作用的发挥，可以为BRMS功效的发挥清除障碍。

本发明涉及的协同多糖(修饰剂)是一族具有抗癌和(或)免疫增强活性的多糖及其衍生物。所述多糖主要包括一些由同种单糖组成的同聚糖，如β/α-glucan(葡聚糖)或β/α-mannan(甘露聚糖)；由数种单糖组成的杂聚糖；以及含有这些成分和功能的糖肽或糖脂。

多糖的抗癌及免疫增强活性依赖于分子的高级结构〔Phytochemistry 1989.28(11)：2877〕。以β-(1，3)-glucan为例，β-构型有利于形成螺旋构象，具有较强的抗癌及免疫增强活性，而α-(1，3)-glucan的α-构型却有利于形成沿纤维轴伸展的带状构象，抗癌活性较弱，但仍有一定的免疫增强活性。在β-(1，3)或β-(1，6 )为主键的glucan中，前者通常比后者具有更强的抗癌活性；在β-(1，3)-glucan中常带有不同数量的β-(1，6)分枝，支链越多活性愈强。常见的以β-(1，3)为主键的glucan，如LNT，猪苓多糖(Grifolan，GRN)，裂褶多糖(Schizophyllan，SP)，酵母多糖(Zymosan)等；那些以β-(1，4)或(1，2)为主键的glucan，如茯苓多糖(Pachyman)，云芝多糖(Krestin，PSK)等。有证据表明，单核细胞(MNC)、巨噬细胞(M_)膜上有β-glucan受体〔J.Immunol.1985.134：2588；1989，142：959；1990，144：2712)。在一定剂量条件下β-glucan与受体的结合导致MNC.M_的活化增殖。所分泌的多种细胞因子如IL-1、TNF-α.IFN-α又可激活Th、NK等细胞从而放大出多种抗癌抗病毒等外来微生物的活性。

从粗略划分来看，真菌来源的多糖通常具有抗肿瘤及免疫增强活性；高等植物来源的多糖多呈现免疫增强活性；而从藻类分离出的多糖通常含有硫酸酯，是良好的抗凝剂。

多糖的抗肿瘤及免疫增强活性亦依赖于分子的大小(分子量)，因为这是形成一定高级结构(构象)的必要条件。在一定范围内分子量愈大活性愈强，但在达到一定限度之后这种关系就不够明显了。例如：对于LNT、SP、GRN来说，分子量小于10kd时分子愈小活性愈弱。当分子量在10-40kd水平时可基本保留原大分子的活性，分子量再增加抑瘤活性增强已不够明显了，但补体激活活性有所增强〔Gann，1976，67：191；Cancer Res.1978，37：379〕。大分子多糖(如500-1000kd)的水溶性往往较差，用做修饰剂时应设法改进其水溶性。

多糖的衍生化是增强其活性改进性能的重要手段，方法主要有水解、甲基化、羧(甲)基化、羟乙(丙)基化、硫酸化、硬脂酰化及磷酯酰化等。以LNT为例，水解法制备LNT中小分子衍生物可采用高温水解(如150℃)、甲酸水解，亦可以用强酸强碱水解，或用酶法水解(如葡萄糖苷酶)。通过控制反应的浓度、温度、时间来获得适宜大小的反应混合物。由于分子量愈大的多糖在乙醇溶液中溶解度愈小，因此通过控制乙醇的浓度即可将所需大小的多糖(衍生物)分级分离出来。当然亦可以用排阻层析法获得。有的衍生化还可以为交联反应提供适宜的反应基因。

本发明涉及的多糖或其衍生物修饰BRMS的方法有多种。首先，多糖或其衍生物用于修饰时均应具备或需引入一定数量的活性基团，该基团的选择视不同的交联机制或方法而异。蛋白质中常用于偶联反应的基团主要有游离的氨基、羧基和巯基等；相应地可以在多糖或其衍生物中引入适宜与蛋白多肽中待交联基团匹配的基团，如醛基、羧基、氨基等，或制备其活性中间体复合物。

活泼酯法是用于交联反应的重要方法之一。本发明可以采用活泼酯法实现多糖与BRMS的共价结合。首先应在LNTd分子中引入羧基(LNTd-COOH)，然后在二环己基碳二亚胺(DCC)作用下与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成活泼酯衍生物，其活泼酯键与BRMS中的氨基相遇可以转化形成稳定的酰胺键连接。

碳二亚胺(carbodiimide)是一类化学性质很活泼的脱水剂，可使羧基同氨基脱水缩合形成酰胺键，但要在有机溶剂中使用，因此应用受到一定限制。然而其水溶性衍生物，如1-乙基-3-〔3-(二甲胺基)丙基〕碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺对甲磺酸(CMC)等，较适宜于水溶性的生物大分子的修饰。例如：香菇多糖衍生物(LNTd)经引入羧基后(LNTd-COOH)，EDC在水溶液中能够与LNTd-COOH的羧基形成活性中间体复合物，然后该复合物再与IL-2分子中的氨基缩合形成酰胺键偶联的结合物。

多糖分子中如果含有一定量的邻二醇结构，可以采用高碘酸钠(NaIO4)或四醋酸铅〔Pb(Ac)4〕氧化法引入醛基。1分子IO4^-可将1个邻二醇结构氧化断裂成两个醛基，两分子IO4^-可将1个邻三醇结构氧化断裂成两个醛基和一个甲酸分子。Pb(Ac)4亦具有类似的氧化特性，但需要在有机溶剂中完成，而NaIO4则适于水溶液中。在多糖中引入的醛基可以同蛋白多肽分子中游离的氨基缩合形成不够稳定的西佛碱(Schiff’s Base)，再经还原剂(如NaBH4)还原即可形成稳定的C-N共价键。

本发明实现多糖或其衍生物与BRMS共价结合的方法涉及活泼酯法，碳二亚胺法，混合酸酐法，高碘酸(盐)或四醋酸铅(盐)氧化法，以及溴化氰、氯化氰尿、表氯醇、三氯三嗪法等。亦包括采用诸如N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)等同型或异型双功能偶联剂或其衍生物的方法实现偶联。

IL-2被LNTd修饰的程度(每分子IL-2结合LNTd的数目)，一方面取决于LNTd活化的程度(含活性基团的数目)，另一方面又取决于两者在反应中的分子比。以NaIO4氧化法在多糖中引入醛基来说，β-13-glucan具有的邻二醇结构比较有限，主要分布于末端葡萄糖单元上，因此所含的支链愈丰富邻二醇结构愈多。而β-(1，2)/(1，4)/(1，6)-glucan则在主链结构中即含有丰富的邻二醇结构，因此可能引入的醛基就愈多，但也不宜过度氧化，否则主链结构将受到严重破坏。因此活化程度要根据多糖的结构具体分析。总之其结果应既有利于偶联反应的进行，又能较好地保留其原结构及活性。

为了使结合物具有较好的治疗活性及药学性质，根据不同情况结合物中多糖与BRMS的摩尔比例可以有所不同。如果设计目的侧重于减弱BRMS较强的免疫原性，逃逸代谢器官对其不利的分子识别及降解，以及抑制物对它的灭活作用，多糖的分子量可以适当减小并相应增加每分子BRMS结合多糖的分子数；如果主要侧重于降低肾脏对BRMS的排泄速度，可以适当增加多糖的分子量并相应增加每分子多糖结合BRMS的个数。尽管以上设计时的侧重点有所差异但均应以不严重影响多糖或BRMS的活性为原则。修饰作用可能会使BRMS的活性(比活)有所降低，一般应把活性保留控制在50％以上；如果复性控制得好该糖基化还有可能不减或提高BRMS的比活。

本发明涉及的多糖或其衍生物平均聚合度主要介于20-10000范围；更优的选择通常介于40-1000范围，即分子量多处于约6-160kd区间。

本发明涉及的用途不限于肿瘤的治疗，利用其免疫调节作用还可以治疗许多疾病，例如感染、免疫缺陷、造血功能障碍等。另外，亦可用作细胞培养及活化的试剂。用于治疗时可以单独用药，也可以同其它药物一起联合治疗，或者用于辅助治疗。

当用于体内治疗时，给患者使用治疗有效量的协同多糖修饰的BRMS结合物(治疗有效量即消除或减少病人病症所需的量)。治疗途径通常是非肠道给药，如经静脉、肌肉、皮下、腹膜、胸膜给药，也可以病灶局部给药。剂量及疗程视病症的性质(如肿瘤的初期或转移性的)及其种类、药物的特征(如治疗指数)、病人及其病史而定。通常可以作为长效药物使用，如给药程式可能是2-4天一次，亦可能间隔更长时间。

非肠道使用的本发明修饰物可以辅以药学上可接受的非肠道赋形剂和(或)稳定剂而配制成单位剂量的注射剂(冻干粉、溶液、悬浮液、乳剂)。这类辅剂本身无毒无疗效，例子如水、盐水、Ringer’s溶液、葡萄糖、甘露糖(醇)、右旋糖酐、人血清白蛋白等。也可使用诸如不挥发油和油酸乙酯的非水性赋形剂，磷脂可用作载体。另外也可含有微量的诸如提高溶解度，增加等渗性和稳定性的添加物，如表面活性剂、缓冲剂和防腐剂等。

本发明所需的BRMS、多糖应为高度纯化的临床级制品，其生产和制备按有关文献进行。

下列实施例以香菇多糖共价修饰IL-2为例详细叙述了有关制备、分析及测定方法。制备中所用的水、试剂、原料及容器等均应达到必要的纯净及无热源要求。这些实例不限制本发明。

                    实施例1

               甲酸水解法制备LNTd

1gLNT同50ml80％甲酸混合、密封，置85℃水浴水解20分钟并不断激烈振荡。冷却至室温后减压除去甲酸，然后加入100mlH2O，沸煮5小时，以抽提可溶性多糖并除去水解产物上的甲酰基团。此混合物经离心收取上清，加入30％的乙醇划分，离心取上清再加入40％的乙醇划分，离心收集沉淀物，加入等体积的水将混悬液移入透析袋(10kd)中对水充分透析。离心弃不溶物，上清上水平衡的DEAE-Sephadex及CM-Sephadex(2.6×15cm)离子交换层析柱，流速0.7ml/min，收集流出的LNTd液，定量分装，冻干备用。

                   实施例2

                LNTd中引入羧基

300mgLNT溶于10ml 0.4N NaOH中，搅拌下加入1.0ml10％Br(CH2)5COOH，室温搅拌反应2小时，对水充分透析(10kd)至无Br^-检出。收集比羧化LNTd(LNTd-COOH)，定量、分装冻干待用。

                    实施例3

                 LNTd中引入醛基

300mgLNTd溶于10ml水中，搅拌下加入2ml 6％NaIO4/0.2MNaAc(PH4.0)，室温暗处搅拌反应2小时，加入过量乙二醇消耗剩余IO4^-1小时，然后经水平衡的Sephadex G-25柱(2.6×40cm)脱盐及小分子，收集醛化多糖(LNTd-CHO)，定量、分装冻干待用。

                 实施例4

            LNTd-rIL-2结合物制备

1、活泼酯法：

100mg LNTd-COOH干粉溶于5ml DMSO中，分别加入20mg NHS和35mg DCC，室温搅拌反应1小时，离心弃沉淀物，上清加1∶2无水乙醇(V/V)沉淀，然后将沉淀物用10ml DMSO溶解，反复同上洗涤数次，最后把沉淀物用于5mlDMSO溶解，按1∶2摩尔比同20mg/mlrIL-2/0.1M NaHCO3(PH9.5)混合，搅拌反应6小时(RT)，然后用HAC调PH5终止反应。

2、西佛碱(Schiff’s Base)法：

100mg NaIO4氧化法制备的醛化多糖(LNTd-CHO)与20mg/mlrIL-2/0.1M NaHCO3(PH9.5)按1∶2摩尔比混合，室温暗处搅拌反应24小时，然后加入50mg NaBH4，混匀避光反应1小时，再同上加入50mg NaBH4反应1小时即可。

                  实施例5

               氧化型结合物的纯化

交联反应混合液对50mMPB(PH6.8)/0.1％SDS透析平衡，离心弃不溶物，上清液进行SephacrylS200柱层析〔50mMPB(6.8)/0.1％SDS〕，380nm检测洗脱液的光吸收。待洗脱液体积超过V。后开始分管收集组分。结合物的洗脱位置因结合物的大小而异，但均先于rIL-2洗脱峰位出现。一般修饰度愈高结合物的分子量(流体半径)愈大，洗脱位置愈靠前。收集预期大小的结合物组分，经25mMPB(PH6.8)平衡的Sephadex G-25脱盐及SDS，-20℃冻存备用。必要时亦可辅以沉淀、离子交换、疏水亲和层析等方法纯化。

                实施例6

                 复性

如果被修饰的rIL-2是未经氧化复性的或有待修饰后复性的，则修饰反应后可将反应混合物充分还原，如对50mMPB(PH6.8)/10mMβ-Me/1mMEDTA/1％SDS平衡后，再进行SephacrylS-200〔50mMPB(PH6.8)/0.1％SDS)层析纯化，收集结合物组分，加入10μM CuSO4，置空气中自发氧化复性(4℃过夜)。次日加入1mMEDTA，混匀放置2小时，然后经50mMPB(PH6.3)平衡的SephadexG-25柱脱SDS及复性添加物。该纯化及复性的结合物可冻存或定量分析后分装。

                  实施例7

              还原型结合物的制备及纯化

待氧化复性的还原型rIL-2交联反应后对50mM NaAc(PH5.0)/10mMβ-Me/1mMEDTA透析平衡，然后上该缓冲液平衡的Sephacryl S200柱层析，OD280nm检测洗脱组分，收集所需大小的结合物组分，留小样分析测活，其余-20℃冻存备用。

               实施例8

            结合物分子量(大小)测定

(1)SDS-PAGE法：

采用2.5％浓缩胶和12.5％分离胶制板，样品溶解液为还原型(β -Me)。以3％考马斯亮兰R250染色。结合物的分子量以蛋白分子量标准标定。常规操作参见〔Nature，(1970)227，680〕。

(2)凝胶过滤法：

采用Sephacryl S-200或Superose-12(1.6×85cm)层析柱，平衡液为10mMPBS(PH7.0)。样品的有效分配系数 $\mathrm{Kav}=\frac{\mathrm{Ve}-\mathrm{Vo}}{\mathrm{Vt}-\mathrm{Vo}},$ 其中Ve为样品的洗脱体积，Vo为柱床外水体积，Vt为柱床体积。以标准蛋白样品(Gel Filtration kit，pharmacia)的Kav求得标准曲线，由此可以标定出结合物样品的分子量及Stock’s(流体)半径。有关常规操作参见〔张龙翔等编《生化实验方法和技术》，1981年，P124，高等教育出版社〕。多糖及其衍生物的分子量(大小)测定亦可采用此法，只是分子量标准应用Dextran standards T10-T2000(pharmacia)。

有关蛋白质及其结合物的测定可用紫外吸收法(280nm)，亦可用“Lowry”法〔J.Biol.Chem.(1951)193，265〕等。多糖及其衍生物的测定可采用“酚/硫酸”法〔Anal.chem.(1956)28.3〕或“蒽酮”法〔Anal.chem.(1953).25.1656〕等。结合物的修饰度(氨基参与的修饰)可采用三硝基苯磺酸(TNBS)法等测定游离的氨基数，以Gly为标准〔J.Biochem.(1960)47.654〕。IL-2及其结合物的生物学活性分析采用已知常规方法，如〔J.Immunol.(1978)120.2027〕。本专利涉及的其它生物应答调节剂及其修饰物的活性及特异测定以其未修饰的原型化合物为基础，方法可参阅有关文献。

该技术领域的内行将欣然认为本发明可以很好地执行上述目的，并得到结果及其利益。这里所述的化合物、方法、过程和技术是优选出的代表实例，只是例举而不是来限制本发明的范围。该技术领域人员所作出的改变及其它使用也包括本发明的精神中并被权利要求书所定义。

Claims (10)

1、一种结合物，其特征在于生物应答调节剂(BRMS)被具有抗癌和(或)免疫增强活性的多糖共价交联形成结合物。

2、根据权利要求1所述结合物，其中所述的BRMS部分包括其氧化态和还原态。

3、根据权利要求1所述结合物，其中所述的BRMS部分包括其类似物或衍生物。

4、根据权利要求1所述结合物，其特征在于其中所述的多糖部分具有抗癌和(或)免疫增强的活性。

5、根据权利要求1所述结合物，其特征在于其中所述多糖部分可以取自抗癌和(或)免疫增强活性的多糖或其衍生物，亦可以被具有上述活性的糖肽、糖脂或其衍生物所替代。

6、一种增强BRMS抗癌效能，拓宽适应症，减轻毒付作用并简化治疗程式的方法，其特征在于：(1)多糖与BRMS同时使用能协同促进和提高抗癌效能，拓宽适应症；(2)多槽对BRMS的共价修饰能减少代谢器官对BRMS的不利识别与消耗，降低排泄器官对它的排出速度，从而延长BRMS的循环半衰期，提高药效，减少用药量和毒付反应。

7、根据权利要求6所述方法，其中包括一种提高BRMS溶解性和稳定性的方法，其特征在于多糖对BRMS的共价结合减弱了疏水性较强的BRMS分子间的相互作用和聚集趋向，使其随多糖分子溶解并稳定分散于水相。

8、根据权利要求6所述方法，其特征亦包括结合物中BRMS的氧化复性在修饰反应之后，或保留其还原状态。

9、一种用于预防和治疗肿瘤、感染、免疫缺陷等疾病的用途，其特征在于它包括给需要使用和治疗的病人使用权利要求1所述结合物，亦包括用作细胞培养及活化的试剂。

10、根据权利要求7所述用途，其中包括给病人使用由权利要求1所述结合物进一步制成的药物制剂。