CN112461988A - 一种大麻二酚有关物质的hplc-pda检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大麻二酚有关物质的HPLC‑PDA检测方法，采用色谱条件如下：流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为水，流动相B为乙腈；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0～8分钟，流动相A与流动相B的体积比由90:10线性变化为32:68；8～17分钟，流动相A与流动相B的体积比由32:68线性变化为18:82；17～30分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为18:82；30～34分钟，流动相A与流动相B的体积比由18:82线性变化为0:100；34～44分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为0：100；44～46分钟，流动相A与流动相B的体积比线性变化为90:10，并维持该体积比至60分钟。采用本发明方法的条件，主峰与相邻杂质峰能完全分离，各主要降解杂质峰之间也能完全分离，且主峰纯度高，杂质检出率高。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法。
背景技术
大麻二酚最早于1940年从大麻(Cannabis sativa)中分离得到，其结构于1963年得以确证，为大麻中的非精神类成分，无致幻及成瘾性作用。大麻二酚(cannabidiol)作用广泛，具有镇痛、抗风湿性关节炎、抗癫痫、抗焦虑等药理活性，对任何认知系统不造成明显损害，同时，对老年痴呆、儿童自闭症、癌症、肝硬化等多种疾病的预防，均有显著的积极作用。同时，在保健品市场呈现多元化发展。
2018年6月25日美国FDA批准英国制药公司GWPharmaceuticals研制的口服液体制剂Epidiolex上市。该药用于辅助治疗两岁以上患儿Lennox-Gastaut综合征(LGS)和Dravet综合征(DS)相关的罕见癫痫。随着大麻二酚药用价值不断开发，急需开发一种实用，准确的大麻二酚原料药有关物质检测方法。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上发展起来的一种新的色谱技术。它具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、样品量少、应用范围广、自动化等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一。二极管阵列检测器(PDA)是一种用于液相色谱检测的光学多通道检测器，它具有色谱峰纯度鉴定、光谱检索功能，可得到任意时间的光谱与任意波长的色谱图，光谱的引入在一定程度上弥补了色谱定性能力不足的缺陷。
国内外文献资料显示，大麻二酚现有检测方法主要是含量检测，含量检测的方法用于有关物质检测时达不到杂质分离要求，且研究集中在唾液、血液、毛发等生物样品和食品中。目前大麻二酚原料药有关物质的检测技术尚未公布。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种从植物中分离的大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，该方法具有专属性、适用性与重复性。本发明的方法，主峰与相邻杂质峰能完全分离，各主要降解杂质峰之间也能完全分离，且主峰纯度高，杂质检出率高，并具有稳定性指导意义。
本发明采取的具体技术方案是：
一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，采用色谱条件如下：
流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为水，流动相B为乙腈；
采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0～8分钟，流动相A与流动相B的体积比由90:10线性变化为32:68；8～17分钟，流动相A与流动相B的体积比由32:68线性变化为18:82；17～30分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为18:82；30～34分钟，流动相A与流动相B的体积比由18:82线性变化为0:100；34～44分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为0：100；44～46分钟，流动相A与流动相B的体积比线性变化为90:10，并维持该体积比至60分钟。
优选地，上述检测方法中，流速为0.5-1.0ml/min，优选0.8ml/min。
优选地，上述检测方法中，检测波长为210-230nm。
优选地，上述检测方法中，色谱柱采用反相C18色谱柱，柱温为28-32℃。
优选地，上述检测方法中，进样量为10μl。
优选地，上述检测方法中，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
本发明还提供了一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，包括：
(1)色谱条件如下：
检测波长：220nm；
流速：0.5-1.0ml/min，优选0.8ml/min；
流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为水，流动相B为乙腈；
采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0～8分钟，流动相A与流动相B的体积比由90:10线性变化为32:68；8～17分钟，流动相A与流动相B的体积比由32:68线性变化为18:82；17～30分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为18:82；30～34分钟，流动相A与流动相B的体积比由18:82线性变化为0:100；34～44分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为0：100；44～46分钟，流动相A与流动相B的体积比线性变化为90:10，并维持该体积比至60分钟；
(2)供试品溶液的制备：取大麻二酚原料药20mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即可；
(3)对照溶液的制备：精密吸取2ml供试品溶液，置于100ml容量瓶中，用色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即可；
(4)测定方法：采用不加校正因子的自身对照法，色谱记录时间应大于主成分色谱峰保留时间的2倍；
(5)限度：杂质峰面积总和不得超过对照溶液主峰峰面积(2.0％)；
(6)系统适应性理论板数按大麻二酚峰计算≥10000，大麻二酚峰与相邻杂质峰的分离度≥1.5。
优选地，上述检测方法中，色谱柱采用反相C18色谱柱，柱温为30℃。
优选地，上述检测方法中，进样量为8-12μl。
优选地，上述检测方法中，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种大麻二酚原有关物质的HPLC-PDA检测方法，采用本发明方法的条件，主峰与相邻杂质峰能完全分离，各主要降解杂质峰之间也能完全分离，且主峰纯度高，杂质检出率高。
附图说明
图1-2为实施例1所述HPLC-PDA检测方法检测图谱；
图3为实施例2所述碱降解的HPLC-PDA检测方法检测图谱；
图4-5为实施例2所述酸降解的HPLC-PDA检测方法检测图谱；
图6-7为实施例2所述氧化降解的HPLC-PDA检测方法检测图谱；
图8-9为实施例2所述光照降解的HPLC-PDA检测方法检测图谱；
图10-11为实施例2所述高温降解的HPLC-PDA检测方法检测图谱；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
本发明实施例提供了一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，包括：
(1)高效液相色谱仪：Waters e2695 HPLC with 2998PDA；
(2)填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
(3)色谱柱：ChromCoreTM 120C18(4.6mm×150mm,3μm)；
(4)进样量：10μl；
(5)柱温：30℃；
(6)检测波长：220nm；
(7)流动相：水为流动相A，乙腈为流动相B；
(8)流速：0.8ml/min；
(9)梯度洗脱程序：0～8分钟，流动相A与流动相B的体积比由90:10线性变化为32:68；8～17分钟，流动相A与流动相B的体积比由32:68线性变化为18:82；17～30分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为18:82；30～34分钟，流动相A与流动相B的体积比由18:82线性变化为0:100；34～44分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为0：100；44～46分钟，流动相A与流动相B的体积比线性变化为90:10，并维持该体积比至60分钟。
(10)空白溶液：色谱甲醇。
(11)溶液的制备：取大麻二酚原料药20mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密吸取2ml供试品溶液，置于100ml容量瓶中，用色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(12)测定方法：采用不加校正因子的自身对照法，色谱记录时间应大于主成分色谱峰保留时间的2倍。
(13)限度：杂质峰面积总和不得超过对照溶液主峰峰面积(2％)。
(14)系统适应性理论塔板数按大麻二酚计算≥10000，大麻二酚峰与相邻杂质峰的分离度≥1.5。
下面以具体的实施例进行说明：
实施例1
一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，包括：
(1)高效液相色谱仪：Waters e2695 HPLC with 2998PDA；
(2)填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
(3)色谱柱：ChromCoreTM 120C18(4.6mm×150mm,3μm)；
(4)进样量：10μl；
(5)柱温：30℃；
(6)检测波长：220nm；
(7)流动相：水为流动相A，乙腈为流动相B；
(8)流速：0.8ml/min；
(9)梯度洗脱程序：0～8分钟，流动相A与流动相B的体积比由90:10线性变化为32:68；8～17分钟，流动相A与流动相B的体积比由32:68线性变化为18:82；17～30分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为18:82；30～34分钟，流动相A与流动相B的体积比由18:82线性变化为0:100；34～44分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为0：100；44～46分钟，流动相A与流动相B的体积比线性变化为90:10，并维持该体积比至60分钟。
(10)空白溶液：色谱甲醇，检测色谱图详见附图1。
(11)溶液的制备：取大麻二酚原料药20mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，检测色谱图详见附图2；精密吸取2ml供试品溶液，置于100ml容量瓶中，用色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(12)测定方法：采用不加校正因子的自身对照法，色谱记录时间应大于主成分色谱峰保留时间的2倍。
(13)限度：杂质峰面积总和不得超过对照溶液主峰峰面积(2％)。
(14)系统适应性理论塔板数按大麻二酚峰计算≥10000，大麻二酚峰与相邻杂质峰的分离度≥1.5。
本实施例色谱条件下的检测图谱详见附图1-2。由附图1-2对比可知，空白溶液对供试品溶液无干扰，且供试品溶液主峰与相邻的杂质峰完全分离，说明本发明的检测方法适用于CBD有关物质的检查。
本发明的检测方法为一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA方法，采用的是自身对照法，且不加校正因子。故方法验证时不做线性及准确性的验证，可用强光照射、高温、酸(碱)水解或氧化的方法进行加速破坏，以研究可能的降解产物和降解途径对杂质测定的影响。为证实方法准确可靠，专属性强、重复性好，进行实施例2-5所述方法来验证：
实施例2
本方法用于强制降解试验样品溶液的检测，检查方法的专属性。
1.强制降解结果汇总
备注：主峰％是指面积归一时主峰峰面积的百分占比。
主峰与相邻杂质峰分离度均≥1.5，符合检测标准。
2.碱降解条件
取1ml 10mg/ml的供试品甲醇溶液于50ml容量瓶中，加1mol/L的NaOH1ml剧烈震摇30s，室温避光静置1h，再加入酸溶液进行中和，用色谱甲醇定容至刻度，摇匀，即可。详见附图3。
3.酸降解条件
取1ml 10mg/ml的供试品甲醇溶液于50ml容量瓶中，加0.5ml 2mol/L的HCl溶液，再加1ml色谱纯甲醇助溶后，剧烈震摇，在室温下避光静置3h，再加入碱溶液进行中和，用色谱甲醇定容至刻度，摇匀，即可。详见附图4-5。
4.氧化降解条件
取1ml 10mg/ml的供试品甲醇溶液于50ml容量瓶中，加0.4ml 10％H2O2溶液，剧烈震摇后，在60℃恒温恒湿箱中放置24h，用色谱甲醇定容至刻度，摇匀，即可。详见附图6-7。
5.光照降解条件
取200μl的100mg/ml供试品溶液装于1.5ml的透明进样瓶中，于光照：4500±500Lux、紫外75±5μw/cm2恒温恒湿光照箱进行光照19天，再吸取100μl于50ml容量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度，摇匀，即可。详见附图8-9。
6.高温降解
取200μl的100mg/ml供试品溶液装于1.5ml的进样瓶中，于60℃恒温恒湿箱静置15天，再吸取100μl于50ml容量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度，摇匀，即可。详见附图10-11。
由附图3-11可知，破坏实验中，大麻二酚在经酸、碱、氧化、光照、高温加速降解后的供试品图谱，主峰与相邻的杂质峰完全分离。主峰的纯度角小于纯度阈值，峰纯度检查符合要求。说明本实施例提供的检测方法能够很好的检测出大麻二酚强制降解试验的降解产物。
证明本发明所述检测方法具有专属性。
实施例3
取同一批的供试品制备6份供试品溶液，分别进样测定并记录峰面积，如下表所示：
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD％ | |
| 面积 | 10029017 | 10069199 | 10053028 | 10079307 | 10062391 | 10072378 | 0.18 |
| 纯度％ | 99.61 | 99.6 | 99.44 | 99.41 | 99.41 | 99.68 | 0.12 |
备注：纯度结果是指面积归一时主峰峰面积的百分占比。
经计算其峰面积的相对标准偏差为0.18％。证明本发明所述检测方法重复性好。
实施例4
依法配制供试品溶液，在0、3、6、12、18、24h测定，记录峰面积及纯度结果，如下表所示：
| 0 | 3h | 6h | 12h | 18h | 24h | RSD％ | |
| 面积 | 10029017 | 10079307 | 10080968 | 10023679 | 10058344 | 10086086 | 0.27 |
| 纯度％ | 99.61 | 99.41 | 99.64 | 99.67 | 99.61 | 99.6 | 0.10 |
备注：纯度结果是指面积归一时主峰峰面积的百分占比。
经计算其峰面积的相对标准偏差为0.27％，纯度结果的相对标准偏差为0.10％，证明本发明供试品溶液在24h内稳定。
实施例5
依法配制供试品溶液，取1ml供试品溶液用色谱甲醇稀释2000倍，相当于样品浓度0.05％的样品，主峰信噪比结果为7.8，可保证样品中0.10％以上的有关物质可以定量检测；取1ml供试品溶液用色谱甲醇稀释4000倍，相当于样品浓度0.025％的样品，主峰信噪比结果为3.7，可保证样品中0.03％以上的有关物质可以被检测到，由此证明本发明的灵敏度高。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (10)
1.一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，采用色谱条件如下：
流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为水，流动相B为乙腈；
采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0～8分钟，流动相A与流动相B的体积比由90:10线性变化为32:68；8～17分钟，流动相A与流动相B的体积比由32:68线性变化为18:82；17～30分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为18:82；30～34分钟，流动相A与流动相B的体积比由18:82线性变化为0:100；34～44分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为0：100；44～46分钟，流动相A与流动相B的体积比线性变化为90:10，并维持该体积比至60分钟。
2.根据权利要求1所述一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，流速为0.5-1.0ml/min，优选0.8ml/min。
3.根据权利要求1所述一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，检测波长为210-230nm。
4.根据权利要求1-3任一项所述一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，色谱柱采用反相C18色谱柱，柱温为28-32℃。
5.根据权利要求1-3任一项所述一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，进样量为8-12μl。
6.根据权利要求1-3任一项所述一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
7.一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，包括：
(1)色谱条件如下：
检测波长：220nm；
流速：0.5-1.0ml/min，优选0.8ml/min；
流动相包括流动相A与流动相B，流动相A为水，流动相B为乙腈；
采用梯度洗脱，梯度洗脱程序按以下程序进行：0～8分钟，流动相A与流动相B的体积比由90:10线性变化为32:68；8～17分钟，流动相A与流动相B的体积比由32:68线性变化为18:82；17～30分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为18:82；30～34分钟，流动相A与流动相B的体积比由18:82线性变化为0:100；34～44分钟，流动相A与流动相B的体积比维持为0：100；44～46分钟，流动相A与流动相B的体积比线性变化为90:10，并维持该体积比至60分钟；
(2)供试品溶液的制备：取大麻二酚原料药20mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即可；
(3)对照溶液的制备：精密吸取2ml供试品溶液，置于100ml容量瓶中，用色谱甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即可；
(4)测定方法：采用不加校正因子的自身对照法，色谱记录时间应大于主成分色谱峰保留时间的2倍；
(5)限度：杂质峰面积总和不得超过对照溶液主峰峰面积2.0％；
(6)系统适应性理论板数按大麻二酚峰计算≥10000，大麻二酚峰与相邻杂质峰的分离度≥1.5。
8.根据权利要求7所述一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，色谱柱采用反相C18色谱柱，柱温为30℃。
9.根据权利要求7所述一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，进样量为10μl。
10.根据权利要求7所述一种大麻二酚有关物质的HPLC-PDA检测方法，其特征在于，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
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