CN112458186A - 一种定量检测弓形虫的引物组及试剂盒和应用 - Google Patents

一种定量检测弓形虫的引物组及试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于生物技术领域，提供了一种定量检测弓形虫的引物组及试剂盒和应用，该引物组包括正向扩增引物和反向扩增引物；所述正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1；所述反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2。本发明提供的定量检测弓形虫的引物组，是选取了针对性的弓形虫基因片段进行设计优化的，其设计严谨，操作简单快速，灵敏性高，特异性强，可应用于人感染弓形虫的血液或脑脊液样本中病原核酸检测问题，其结果判定准确客观。

Description

一种定量检测弓形虫的引物组及试剂盒和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种定量检测弓形虫的引物组及试剂盒和应用。
背景技术
弓形虫(Toxoplasma Gondii)是细胞内寄生虫，也叫三尸虫。寄生于细胞内，随血液流动，到达全身各部位，破坏大脑、心脏、眼底，致使人的免疫力下降，患各种疾病。它是专性细胞内寄生虫，球虫亚纲，真球虫目，等孢子球虫科、弓形体属。生活周期需要两个宿主，中间宿主包括爬虫类、鱼类、昆虫类、鸟类、哺乳类等动物和人，终宿主则有猫和猫科动物。研究发现大多数人都是弓形虫带虫者，形成带虫免疫，被感染后很难出现初次感染的症状。但在HIV患者中，由于机体免疫力下降，弓形虫可能爆发引发弓形虫脑炎，严重危害患者健康。
目前，弓形虫病常用的检测方法有病理组织检测，病原学检测和血清抗体检测。但由于病理组织检测容易造成患者的实质性损伤，难于实施；病原学检测培养时间长，染色检出率低；免疫低下患者血清中抗体水平普遍低下，易造成抗体检测的不准确等问题，使得目前对于临床患者的血液和脑脊液等样本的弓形虫病原检测十分困难。
荧光定量PCR检测技术具有快速。灵敏。特异等优点，目前，已经有很多采用PCR方法检测弓形虫病原的报道。然而，研究表明，临床标本如血清、全血、组织和脑脊液等样本中含有大量的未知成分，会造成PCR反应的抑制，核酸抽提过程中试剂的残留也会抑制PCR扩增，从而导致假阴性结果或定量值偏低。另一方面，核酸提取过程中的丢失，也会造成假阴性结果。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种定量检测弓形虫的引物组，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种定量检测弓形虫的引物组，其包括正向扩增引物和反向扩增引物；所述正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种定量检测弓形虫的试剂盒，包括PCR反应液以及上述的引物组。
作为本发明实施例的一种优选方案，所述正向扩增引物的浓度为5～15μmol/L。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述反向扩增引物的浓度为5～15μmol/L。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述PCR反应液包括dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)、荧光染料和Taq聚合酶。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述试剂盒还包括阳性对照物；所述阳性对照物为弓形虫L358基因的一段特异性片段克隆得到的质粒。
作为本发明实施例的另一种优选方案，弓形虫L358基因的一段特异性片段的序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的引物组在制备用定量检测弓形虫的试剂盒中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的引物组在制备用于荧光定量PCR检测弓形虫的试剂盒中的应用。
本发明实施例提供的一种定量检测弓形虫的引物组，是选取了针对性的弓形虫基因片段进行设计优化的，其设计严谨，操作简单快速，灵敏性高，特异性强，可应用于人感染弓形虫的血液或脑脊液样本中病原核酸检测问题，其结果判定准确客观，完成一次样本检测实际时间控制在2小时，同时也保证了约90％准确性。
附图说明
图1为实施例6测定的阴性对照组的PCR扩增曲线结果示意图。
图2为实施例6测定的阳性对照组的PCR扩增曲线结果示意图。
图3为实施例6测定的样本核酸提取物的电泳结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种定量检测弓形虫的引物组，其设计方法如下：
经经过多株弓形虫序列比对，发现弓形虫L358基因在63-82、338-354等区域，碱基保守性较好，因此针对这些区段设计引物。其中，弓形虫L358基因，选取此基因各个种所共有且种间变异最小的一段片段，序列中保守的部分，在NCBI中比对为多个弓形虫此片段共有，且同源性大于70％，符合属特异检测标准，其序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
设计时，尽量保证选定的区域GC含量在40％-60％之间，扩增长度在100bp-400bp之间，引物Tm值在50℃-65℃之间。用primer6和NCBI里primerBLA ST进行双重筛选，最终得到以下两对扩增引物。正向扩增引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，反向扩增引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
具体的，SEQ ID NO：1的序列为5‘-GAGAAAGCGAAACCTTCCTG-3’；
SEQ ID NO：2的序列为5‘-CGACACACTCGCATGCATG-3’。
实施例2
该实施例提供了一种定量检测弓形虫的试剂盒，其包括PCR反应液、引物组、阳性对照物和阴性对照物。
其中，PCR反应液可以采用市售的2*SYBR Green MIX，其包括dNTP、荧光染料、Taq聚合酶以及反应缓冲液。
引物组包括正向扩增引物和反向扩增引物，正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1，具体为5‘-GAGAAAGCGAAACCTTCCTG-3’；反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，具体为5‘-CGACACACTCGCATGCATG-3’；另外，正向扩增引物和反向扩增引物的浓度均为10μmol/L。
阴性对照物为去离子水；阳性对照物为弓形虫L358基因的一段特异性片段克隆得到的质粒。其中，弓形虫L358基因的一段特异性片段的序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
实施例3
该实施例提供了一种定量检测弓形虫的试剂盒，其包括PCR反应液、引物组、阳性对照物和阴性对照物。
其中，PCR反应液可以采用市售的2*SYBR Green MIX，其包括dNTP、荧光染料、Taq聚合酶以及反应缓冲液。
引物组包括正向扩增引物和反向扩增引物，正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1，具体为5‘-GAGAAAGCGAAACCTTCCTG-3’；反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，具体为5‘-CGACACACTCGCATGCATG-3’；另外，正向扩增引物和反向扩增引物的浓度均为12μmol/L。
阴性对照物为去离子水；阳性对照物为弓形虫L358基因的一段特异性片段克隆得到的质粒。其中，弓形虫L358基因的一段特异性片段的序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
实施例4
该实施例提供了一种定量检测弓形虫的试剂盒，其包括PCR反应液、引物组、阳性对照物和阴性对照物。
其中，PCR反应液可以采用市售的2*SYBR Green MIX，其包括dNTP、荧光染料、Taq聚合酶以及反应缓冲液。
引物组包括正向扩增引物和反向扩增引物，正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1，具体为5‘-GAGAAAGCGAAACCTTCCTG-3’；反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，具体为5‘-CGACACACTCGCATGCATG-3’；另外，正向扩增引物和反向扩增引物的浓度均为5μmol/L。
阴性对照物为去离子水；阳性对照物为弓形虫L358基因的一段特异性片段克隆得到的质粒。其中，弓形虫L358基因的一段特异性片段的序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
实施例5
该实施例提供了一种定量检测弓形虫的试剂盒，其包括PCR反应液、引物组、阳性对照物和阴性对照物。
其中，PCR反应液可以采用市售的2*SYBR Green MIX，其包括dNTP、荧光染料、Taq聚合酶以及反应缓冲液。
引物组包括正向扩增引物和反向扩增引物，正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1，具体为5‘-GAGAAAGCGAAACCTTCCTG-3’；反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，具体为5‘-CGACACACTCGCATGCATG-3’；另外，正向扩增引物和反向扩增引物的浓度均为15μmol/L。
阴性对照物为去离子水；阳性对照物为弓形虫L358基因的一段特异性片段克隆得到的质粒。其中，弓形虫L358基因的一段特异性片段的序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
实施例6
该实施例提供了一种荧光定量PCR检测弓形虫的方法，其包括以下步骤：
S1、样本核酸提取：人血液或脑脊液样本DNA提取，采用Qiagen公司销售的QIAampDNA Blood Mini Kit(商品号51106)对实施例样本进行样本总DNA的提取，得到样本核酸提取物。
S2、取上述实施例2提供的试剂盒，将10μL的PCR反应液、1μL的正向扩增引物、1μL的反向扩增引物、5μL的样本核酸提取物、3μL的的去离子无菌水进行混合，作为实验组反应体系；将10μL的PCR反应液、1μL的正向扩增引物、1μL的反向扩增引物、5μL的阳性对照物、3μL的的去离子无菌水进行混合，作为阳性对照组反应体系；将10μL的PCR反应液、1μL的正向扩增引物、1μL的反向扩增引物、5μL的阴性对照物、3μL的的去离子无菌水进行混合，作为阴性对照组反应体系。
S3、将上述得到的实验组反应体系、阳性对照组反应体系和阴性对照组反应体系分别按照表1所示的PCR反应程序进行PCR扩增反应。表1中，*位置为荧光采集阶段。
表1
Figure BDA0002829471960000071
S4、结果判定：(1)阴性对照应无Ct值，阳性对照有Ct值；(2)内对照应为阳性，但标本如果为强阳性，内对照可以出现阴性结果。其中样本阴性结果如图1所示，阳性结果如图2和图3所示。
实施例7
该实施例提供了一种荧光定量PCR检测弓形虫的方法，其包括以下步骤：
S1、样本核酸提取：人血液或肺泡灌洗液样本DNA提取，采用Qiagen公司销售的QIAamp DNA Blood Mini Kit(商品号51106)对实施例样本进行样本总DNA的提取，得到样本核酸提取物。
S2、取上述实施例3提供的试剂盒，将10μL的PCR反应液、1μL的正向扩增引物、1μL的反向扩增引物、5μL的样本核酸提取物、3μL的的去离子无菌水进行混合，作为实验组反应体系；将10μL的PCR反应液、1μL的正向扩增引物、1μL的反向扩增引物、5μL的阳性对照物、3μL的的去离子无菌水进行混合，作为阳性对照组反应体系；将10μL的PCR反应液、1μL的正向扩增引物、1μL的反向扩增引物、5μL的阴性对照物、3μL的的去离子无菌水进行混合，作为阴性对照组反应体系。
S3、将上述得到的实验组反应体系、阳性对照组反应体系和阴性对照组反应体系分别按照上表1所示的PCR反应程序进行PCR扩增反应。
S4、结果判定：(1)阴性对照应无Ct值，阳性对照有Ct值；(2)内对照应为阳性，但标本如果为强阳性，内对照可以出现阴性结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure BDA0002829471960000091
Figure BDA0002829471960000101
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种定量检测弓形虫的引物组及试剂盒和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagaaagcga aaccttcctg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgacacactc gcatgcatg 19
<210> 3
<211> 413
<212> DNA
<213> 弓形虫(Toxoplasma gondii)
<400> 3
aggcgtagcg caagtcgcag catgccgcga agaatggaat gttctcttcc tcgacatggg 60
cggagaaagc gaaaccttcc tgctgcgcgg tttccgtcgc tgtctcgtcg ctcgcttctc 120
tccccgcttc tccgtccgaa acgagtcgcg agagaggcgg caggcgaatg caggagaagc 180
tgatctctgc ctctctcctc gccttcttgt ctatcagcgg ggtggccgcg cgacattgca 240
gcgtcgacgc gcagccgagc gaaggaagcg gggaagacga agaggctccg ttcccccgac 300
aggacgcatc cgacaagccg aaggcagaaa gaggacatgc atgcgagtgt gtcgtccgga 360
agagcagaga ctcgcaccct tgcagggcca agacgcagca ctgcagccag agg 413

Claims (9)

1.一种定量检测弓形虫的引物组，其特征在于，包括正向扩增引物和反向扩增引物；所述正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1；所述反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2。
2.一种定量检测弓形虫的试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，还包括如权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的一种定量检测弓形虫的试剂盒，其特征在于，所述正向扩增引物的浓度为5~15μmol/L。
4.根据权利要求2所述的一种定量检测弓形虫的试剂盒，其特征在于，所述反向扩增引物的浓度为5~15μmol/L。
5.根据权利要求2所述的一种定量检测弓形虫的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括dNTP、荧光染料和Taq聚合酶。
6.根据权利要求2~5中任一项所述的一种定量检测弓形虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照物；所述阳性对照物为弓形虫L358基因一段特异性片段克隆得到的质粒。
7.根据权利要求6所述的一种定量检测弓形虫的试剂盒，其特征在于，弓形虫L358基因的一段特异性片段的序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
8.一种如权利要求1所述的引物组在制备用定量检测弓形虫的试剂盒中的应用。
9.一种如权利要求1所述的引物组在制备用于荧光定量PCR检测弓形虫的试剂盒中的应用。
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