CN112439004A - 一种丹参提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丹参提取物及其制备方法和应用，所述的丹参提取物是将丹参用亲水性溶剂与水的混合溶剂提取得到的粗提物浸膏混悬于水中后，先用石油醚萃取再用乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取部位即为所述丹参提取物，并且，所述丹参提取物中不含有丹参酮ⅡA和隐丹参酮。研究结果显示：本发明提供的丹参提取物在不抑制金黄色葡萄球菌生长的情况下，不仅能够抑制金黄色葡萄球菌的毒力，可降低其致病力，而且不易产生耐药，对金黄色葡萄球菌感染有显著治疗效果，可望作为活性组分用于制备抗金黄色葡萄球菌毒力的药物，为新型抗菌药物的研发奠定基础。

Description

一种丹参提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种丹参提取物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起人类化脓感染中最常见的病原菌，可直接导致局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染，严重危害人类生命健康。金黄色葡萄球菌的感染类型可分为医院获得性感染和社区获得性感染，后者的发现更增加了这种致病菌潜在的生物危害性和引起感染爆发的可能性。抗生素治疗是金黄色葡萄球菌感染的主要治疗手段，但是近年来由于金黄色葡萄球菌感染率的增加、产生耐药速度的加快，以及金黄色葡萄球菌从急性感染趋向慢性、持久性、复发性感染等特点，金黄色葡萄球菌导致的感染已逐渐成为人们关注的焦点，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染。2017年2月27日，世卫组织发布首份抗生素耐药“重点病原体”清单，耐药性金黄色葡萄球菌被列为重点病原菌(十分重要)，迫切需要发现新的药物作用靶点以及发展新的对抗耐药性金黄色葡萄菌的方法。
传统抗生素的治疗策略主要是杀死细菌或抑制细菌的生长，它们的作用主要包括：抑制细菌DNA的复制、蛋白质的合成及细胞壁的合成。基于此策略发现的抗生素，过度使用之后会对细菌产生选择性压力，从而导致耐药菌株的出现。近年来，先后有研究报道了一种抗细菌感染治疗的新模式—抗细菌毒力药物治疗，即用药物靶向遏制目标菌的毒性蛋白的表达、传递和黏附，进而靶向调节目标菌的毒力因子表达，有效预防和治疗多种感染性疾病。通过对患者施用针对病原菌毒性蛋白的药物来降低其致病性，使之无害而非将其杀灭，这样就能大大降低耐药菌株出现的几率。
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎，首载于《神农本草经》，具有活血祛瘀、调经止痛、养血安神、凉血消痈的功效，主治妇女月经不调、心腹疼痛、症瘕积聚、心烦失眠、痈疮肿毒等。丹参最主要的临床治疗适应症为心血管疾病。已报道的丹参中的化学成分主要分为两类：脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类成分。丹参有效成分的主要药理作用表现在多个方面，例如，丹参酮类化合物以改善血液循环、抗菌和抗炎作用为主，而丹酚酸类化合物则以抗氧化、抗凝血和细胞保护作用为主。
研究发现，丹参体外试验对金黄色葡萄球菌及其耐药菌株有一定的抑菌作用，其有效部位为脂溶性成分(总丹参酮)。另外用以总丹参酮为主要成分的片剂、油膏剂，治疗扁桃腺炎、耳疖、化脓性骨髓炎、痈疮、烧伤中的金黄色葡萄球菌感染以及其他由金黄色葡萄球菌引起的疾病具有一定的治疗效果。通过文献分析发现丹参中两个主要的脂溶性成分：丹参酮ⅡA和隐丹参酮，具有较强的抑菌活性；丹参的水溶性成分(丹酚酸类)无明显的抑菌作用。
目前报道的丹参提取物是通过抑制细菌的生长来实现抗菌作用，但还没有关于丹参提取物在用于制备抗金黄色葡萄球菌毒力药物方面的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种在不影响金黄色葡萄球菌生长的情况下可以抑制金黄色葡萄球菌毒力的丹参提取物及其制备方法和应用，以拓宽丹参的应用范围。
本发明所述的丹参提取物，是将丹参用亲水性溶剂与水的混合溶剂提取得到的粗提物浸膏混悬于水中后，先用石油醚萃取再用乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取部位即为所述丹参提取物，并且，所述丹参提取物中不含有丹参酮ⅡA和隐丹参酮。
进一步，本发明所述的丹参提取物，是将丹参用乙醇的水溶液提取得到的粗提物浸膏混悬于水中后，先用石油醚萃取再用乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取部位即为所述丹参提取物。
本发明所述丹参提取物的制备方法，包括如下具体步骤：
a)将丹参药材粉粹后，用亲水性溶剂与水的混合溶剂提取1～5次(优选2～3次)，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩，得丹参的粗提物浸膏；
b)将所得的丹参的粗提物浸膏混悬于水中，得到的混悬液用石油醚萃取1～5次(优选2～3次)后再用乙酸乙酯萃取1～5(优选2～3次)次，弃去石油醚萃取液，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，即得所述丹参提取物(简记为SM3-2)。
作为一种实施方案，步骤a)中，所述的亲水性溶剂包括但不限于乙醇、甲醇和丙酮，混合溶剂中亲水性溶剂的体积分数为70～90％(优选80％)，每次提取所加入的混合溶剂的重量是药材重量的2～20倍(优选10倍)，每次提取时间为0.5～3小时(优选1～2小时)。
作为优选方案，所述的混合溶剂为体积分数为70％～90％的乙醇。
作为一种实施方案，步骤a)中，提取方式为冷浸提取、渗漉提取、超声提取或回流提取，优选回流提取。
作为优选方案，步骤b)中，混悬液用等体积石油醚萃取1～5次。
本发明所述丹参提取物的应用，是指以丹参提取物为活性组分用于制备抗金黄色葡萄球菌毒力药物。
进一步，所述丹参提取物的应用，是指以丹参提取物为活性组分用于制备抗金黄色葡萄球菌毒力因子α-溶血素的药物。
本发明所述的药物可以各种给药途径给予患者，包括但不限于口服、透皮、肌肉、皮下和静脉注射。
本发明所述的药物的剂型不限，只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型都可以，包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等；优选口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。所述的口服剂型可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁；适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
本发明的研究结果显示：本发明提供的丹参提取物在不抑制金黄色葡萄球菌生长的情况下，不仅能够抑制金黄色葡萄球菌的毒力，可降低其致病力，而且不易产生耐药，对金黄色葡萄球菌感染有显著治疗效果，可望作为活性组分用于制备抗金黄色葡萄球菌毒力药物，为新型抗菌药物的研发奠定基础，具有明显的药用前景和临床应用价值。
附图说明
图1为丹参的粗提物浸膏在270nm下的UPLC色谱图；
图2为丹参的粗提物浸膏的石油醚萃取部位在270nm下的UPLC色谱图；
图3为丹参提取物SM3-2在270nm下的UPLC色谱图；
图4为丹参酮ⅡA在270nm下的UPLC色谱图；
图5为隐丹参酮在270nm下的UPLC色谱图；
图6为丹参提取物对金黄色葡萄球菌Newman菌株生长的影响；
图7为丹参提取物对金黄色葡萄球菌USA300 LAC菌株生长的影响；
图8为丹参提取物SM3-2对Newman菌株的溶血活性的影响；
图9为丹参提取物SM3-2对Newman菌株中Hla蛋白表达的影响；
图10为丹参提取物SM3-2对USA300 LAC菌株中Hla蛋白表达的影响；
图11为丹参提取物SM3-2的凝胶迁移实验结果；
图12为丹参提取物SM3-2对非致死剂量Newman菌株(MSSA)静脉感染小鼠的治疗效果；
图13为丹参提取物SM3-2对非致死剂量Newman菌株(MSSA)静脉感染小鼠治疗效果的统计结果；
图14为丹参提取物SM3-2对致死剂量USA300 LAC菌株(MRSA)静脉感染小鼠生存率的统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：丹参提取物的制备
a)将丹参药材(丹参饮片)粉粹成粗粉后，用10倍量的体积分数为80％的乙醇回流提取3次，每次提取1.5小时，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，得丹参的粗提物浸膏；
b)将所得的丹参的粗提物浸膏混悬于水中，得到的混悬液用等体积石油醚萃取3次后用乙酸乙酯萃取3次，弃去石油醚萃取液，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，即得所述丹参提取物(简记为SM3-2)。
经UPLC分析：所得丹参提取物SM3-2中不含有丹参酮ⅡA和隐丹参酮(参见图1至图5所示)。
实施例2：丹参提取物对金黄色葡萄球菌生长的影响实验
挑取金黄色葡萄球菌单克隆，加入胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)中，于37℃恒温摇床，以250rpm的转速培养过夜；菌液用新鲜TSB培养基稀释100倍后于37℃恒温摇床，以250rpm的转速培养约2.5小时至OD600到达0.2-0.3，分装，加入SM3-2(终浓度为400μg/mL)，对照组加入同体积DMSO，混匀后，取150μL菌液测0小时的OD600，剩余菌液于37℃恒温摇床继续培养12小时，期间每隔2小时取出150μL菌液测OD600，绘制菌株的生长曲线；实验结果如图6和图7所示。
图6为丹参提取物对金黄色葡萄球菌Newman菌株生长的影响；图7为丹参提取物对金黄色葡萄球菌USA300 LAC菌株生长的影响；由图6和图7可见，400μg/mL丹参提取物SM3-2不影响金黄色葡萄球菌Newman菌株(图6)和USA300 LAC菌株(图7)的正常生长；说明本发明的丹参提取物不抑制金黄色葡萄球菌的正常生长。
实施例3：丹参提取物对金黄色葡萄球菌溶血活性抑制实验
挑取金黄色葡萄球菌Newman菌株单克隆，加入TSB培养基中，于37℃恒温摇床，以250rpm的转速培养过夜；菌液用新鲜TSB培养基稀释100倍后于37℃恒温摇床，以250rpm的转速培养3小时，分装，加入不同浓度的药物，对照组加入同体积DMSO，于37℃恒温摇床继续培养3小时；然后将细菌培养物离心(5500×g，4℃，1分钟)，收集菌液上清；取1.5mL离心管，加入875μL磷酸缓冲盐溶液(PBS)，100μL菌液上清，25μL脱纤维绵羊血，混匀，于37℃孵育3小时后离心(5500×g，室温，1分钟)；然后取上清150μL，在543nm处测定光密度，实验结果如图8所示。
图8为丹参提取物SM3-2对Newman菌株的溶血活性的影响；由图8可见，丹参提取物SM3-2能够显著抑制金黄色葡萄球菌Newman菌株的溶血活性。
实施例4：蛋白免疫印迹实验
挑取金黄色葡萄球菌单克隆，加入TSB培养基中，于37℃恒温摇床，以250rpm的转速培养过夜；菌液用新鲜TSB培养基稀释100倍后于37℃恒温摇床，以250rpm的转速培养3小时，分装，加入不同浓度的药物，对照组加入同体积DMSO，于37℃恒温摇床继续培养3小时；然后将细菌培养物离心(10000×g，4℃，5分钟)，收集菌液上清；加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，99℃加热5分钟；该样本在12％SDS-PAGE胶上电泳分离；用25V电压，1A电流，转膜30分钟，将蛋白转到硝酸纤维素(NC)膜上；用TBST溶液洗膜并在室温下把膜封闭1.5小时；再次用TBST溶液洗膜，并孵育一抗液，在4℃孵育过夜。孵育完成后，在室温下把膜用TBST洗涤4次，每次10分钟；随后在室温下孵育二抗1.5小时，再次用TBST洗涤4次；采用化学发光法检测条带，实验结果如图9和图10所示。
图9为丹参提取物SM3-2对Newman菌株中Hla蛋白表达的影响；图10为丹参提取物SM3-2对USA300 LAC菌株中Hla蛋白表达的影响；由图9和图10可见，丹参提取物SM3-2能够显著抑制金黄色葡萄球菌Newman菌株(图9)和USA300 LAC菌株(图10)α-溶血素(即Hla)的表达，进而说明本发明的丹参提取物能显著抑制金黄色葡萄球菌外毒素的分泌，可用于制备抗金黄色葡萄球菌毒力因子α-溶血素的药物，可望用于制备抗金黄色葡萄球菌毒力药物。
实施例5：凝胶迁移实验
将2μL MgrA蛋白(0.46μg/mL)和2μL不同浓度的待测物及2μL hla的DNA promoter放在14μL结合缓冲溶液中孵育(10mM Tris-HCl[pH 7.4]，50mM KCl，5mM MgCl2，10％甘油)；在室温放置30分钟后，样品用经过预电泳的6.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(120V，40分钟)，电泳结束后，凝胶放入凝胶红染料中泡染30分钟，然后用荧光显影检测，实验结果如图11所示。
图11为丹参提取物SM3-2的凝胶迁移实验结果；图中，MDSA(5,5'-亚甲基双水杨酸)为阳性对照，由图11可见，丹参提取物SM3-2能够显著抑制MgrA蛋白与hla启动子的结合，进而其可能会抑制hla基因的转录，说明本发明所述的丹参提取物可望用于制备抗金黄色葡萄球菌毒力药物。
实施例6：小鼠非致死剂量静脉感染实验
挑选金黄色葡萄球菌菌种Newman于TSB培养基中，37℃摇床里过夜培养，用新鲜TSB培养基稀释20倍，于37℃摇床里培养3小时；离心收集菌体，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤两次，重悬于PBS中；调整菌液浓度至2×107菌落形成单位(CFU)；实验组和对照组BALB/c小鼠(6周龄)提前一天分别腹腔注射SM3-2(200mg/kg)和对应空白溶剂(20％PEG400)；次日给药后4小时，通过眼眶静脉注射200μL重悬菌；之后，每隔24小时给药一次，记录每天动物体重；在感染第五天，通过二氧化碳窒息处死实验动物，分别取动物心脏、肝脏、肾脏、脾脏组织于PBS中研磨，然后按10倍稀释成六个梯度，分别取10μL研磨后的稀释液滴于TSA琼脂培养基上；统计菌落个数进行数据分析，实验结果如图12和图13所示。
图12为丹参提取物SM3-2对非致死剂量Newman菌株(MSSA)静脉感染小鼠的治疗效果；图13为丹参提取物SM3-2对非致死剂量Newman菌株(MSSA)静脉感染小鼠治疗效果的统计结果；由图12和图13可见，200mg/kg丹参提取物SM3-2能够明显改善金黄色葡萄球菌Newman菌株静脉感染小鼠的感染情况，显著降低心脏、肝脏和肾脏的载菌量。
实施例7：小鼠致死剂量静脉感染实验
挑选金黄色葡萄球菌菌种USA300 LAC于TSB培养基中，37℃摇床里过夜培养，用新鲜TSB培养基稀释20倍，于37℃摇床里培养3小时；离心收集菌体，用PBS洗涤两次，重悬于PBS中，调整菌液浓度至1.2×108CFU，建立致死剂量感染动物模型；实验组和对照组BALB/c小鼠(6周龄)提前一天分别腹腔注射药物和对应空白溶剂；次日给药后4小时，通过眼眶静脉注射200μL重悬菌；之后，每隔24小时给药一次；观察记录模型组和给药组的小鼠生存状态和生存率，实验结果如图14所示。
图14为丹参提取物SM3-2对致死剂量USA300 LAC菌株(MRSA)静脉感染小鼠生存率的统计结果；由图14可见，200mg/kg丹参提取物SM3-2能够明显提高金黄色葡萄球菌USA300LAC菌株静脉感染小鼠的生存率。
综上所述可见：本发明所述的丹参提取物在不抑制金黄色葡萄球菌生长的情况下，不仅能够金黄色葡萄球菌的毒力，可降低其致病力，而且不易产生耐药，对金黄色葡萄球菌感染有显著治疗效果，可用于制备新型的用于治疗细菌(金黄色葡萄球菌)感染性疾病的药物：抗金黄色葡萄球菌毒力药物，为新型抗菌药物的研发奠定基础，具有明显的药用前景和临床应用价值。
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种丹参提取物，其特征在于：是将丹参用亲水性溶剂与水的混合溶剂提取得到的粗提物浸膏混悬于水中后，先用石油醚萃取再用乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取部位即为所述丹参提取物，并且，所述丹参提取物中不含有丹参酮ⅡA和隐丹参酮。
2.根据权利要求1所述的丹参提取物，其特征在于：是将丹参用乙醇的水溶液提取得到的粗提物浸膏混悬于水中后，先用石油醚萃取再用乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取部位即为所述丹参提取物。
3.一种制备权利要求1所述丹参提取物的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
a)将丹参药材粉粹后，用亲水性溶剂与水的混合溶剂提取1～5次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩，得丹参的粗提物浸膏；
b)将所得粗提物浸膏混悬于水中，得到的混悬液用石油醚萃取1～5次后再用乙酸乙酯萃取1～5次，弃去石油醚萃取液，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，即得所述丹参提取物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤a)中，所述的亲水性溶剂包括但不限于乙醇、甲醇和丙酮，混合溶剂中亲水性溶剂的体积分数为70～90％，每次提取所加入的混合溶剂的重量是药材重量的2～20倍，每次提取时间为0.5～3小时。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤a)中，提取方式为冷浸提取、渗漉提取、超声提取或回流提取。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤b)中，混悬液用等体积石油醚萃取1～5次。
7.一种权利要求1所述丹参提取物的应用，其特征在于：是指以丹参提取物为活性成分用于制备抗金黄色葡萄球菌毒力的药物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：是指以丹参提取物为活性成分用于制备抗金黄色葡萄球菌毒力因子α-溶血素的药物。
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