CN112430682B

CN112430682B - 与玉米脆性基因共分离的InDel分子标记及其应用

Info

Publication number: CN112430682B
Application number: CN202011344627.0A
Authority: CN
Inventors: 刘保申; 徐伟; 李晓林; 郑希明; 赵燕; 张永中; 王庆康; 张青荣; 张顺聪
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN112430682A

Abstract

本发明公开了一种与玉米脆性基因共分离的InDel分子标记及其应用。所述InDel分子标记包括：InDel‑cg1和InDel‑XL7233；其中：InDel‑cg1分子标记位于玉米第9号染色体第125271625 bp‑125271626 bp之间，插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；InDel‑XL7233分子标记位于玉米第9号染色体第125271994‑125271995之间，缺失序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的分子标记可以用于检测鉴定玉米茎秆脆性性状和鲜食玉米的皮渣率，通过琼脂糖凝胶电泳可以快速区分其基因型。本发明的InDel分子标记，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，本发明的分子标记可简便、快速、高通量地应用于育种实践。

Description

与玉米脆性基因共分离的InDel分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及一种与玉米脆性基因共分离的InDel分子标记及其应用。

背景技术

玉米(Zea mays)是世界上重要的粮食作物，也是我国的三大作物之一，在饲料、工业和能源原料方面也发挥着重要的作用。倒伏一直是影响玉米产量和品质的重要因素，据统计，我国每年因倒伏造成玉米的产量损失近100万吨(常宏莹，2017)。目前随着我国玉米栽培水平的不断提高，密植与倒伏矛盾日益突出，且由于很多不确定的自然因素发生，致使玉米倒伏引起产量损失呈现加剧的趋势。

倒伏也是玉米高产的重要限制因素之一，植株的抗倒伏性是由茎杆的性状决定的(薛军，2018)。玉米茎杆不仅担负着支撑植株地上部分的重要作用，而且在营养物质的储存和运输中也起着至关重要的作用，因此玉米茎秆的性状是影响玉米产量的一个重要因子，对于玉米抗倒伏能力以及高产品种的筛选都具有重要的意义(刘春来，2018)，为玉米抗倒伏分子设计育种提供理论基础。

脆性突变体茎秆适度变脆，有利于秸秆还田，玉米脆性突变体一般表现为细胞壁中纤维素和木质素的含量变化，常常会改变茎秆机械强度，进而影响玉米抗倒伏性和环境适应性。因此，鉴定茎秆适度变脆、农艺性状不受影响或影响较小的突变体，不仅有助于阐明细胞壁的生物合成机理，而且对选育“脆而不倒”的环保型玉米新品种具有重要的意义(汪晴焰，2019)。

随着人们饮食结构的不断变化，鲜食玉米以其独特的品质而越来越受到人们的喜欢(郝小琴2000；何晓鹏等2010)。鲜食玉米是近代玉米育种的产物，营养丰富，遗传附加值高，故被誉为“遗传增值型”玉米，通过加工或饲料试验从终端产品体现出其增加的价值。优良的鲜食玉米应具有良好的口感，包括皮薄渣少、粘软细腻、有适度的清香和甜味，同时含有丰富的营养物质，是当前新开发的十大高档蔬菜品种之一(刘鹏飞，2008)。皮渣率是鲜食玉米重要的品质性状，近年来，由于籽粒“皮厚渣多”造成的粗劣口感已成为我国鲜食玉米育种急需攻克的重要育种目标之一，因此通过筛选和鉴定籽粒“皮薄渣少”的种质资源迫在眉睫，含有脆性基因的材料会影响纤维素和木质素的合成，无疑是选育“皮薄渣少”种质资源的理想材料。

InDel分子标记基于PCR扩增技术可以检测近缘物种或同一物种不同个体之间基因组同一位点发生的不同大小核苷酸片段的插入或缺失，具有稳定性好、多态性高、分型系统简单等优点，近年来开始被广泛运用于群体遗传分析和分子辅助育种工作中。但是，目前玉米在InDel分子标记方面的研究相对滞后，与玉米茎秆脆性以及鲜食玉米的皮渣率相关的InDel分子标记更是未见有报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供与玉米脆性基因共分离的InDel分子标记。利用本发明的InDel分子标记可以检测鉴定玉米茎秆脆性和鲜食玉米的皮渣率，检测鉴定快速精准，不受环境影响，加速了玉米的育种进程，适于大规模的推广应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供与玉米脆性基因共分离的InDel分子标记，所述InDel分子标记包括：InDel-cg1和InDel-XL7233；其中：

InDel-cg1分子标记位于玉米第9号染色体第125271625bp-125271626bp之间，所述InDel-cg1分子标记的多态性为-/插入序列，所述插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体如下：

插入序列：GGAAAAAAATTTGTTGCAGCCGGGCTGCAACAAATTTTTTTCCATGT TCTA。(SEQ IDNO.1)

InDel-XL7233分子标记位于玉米第9号染色体第125271994-125271995之间，所述InDel-XL7233分子标记的多态性为-/缺失序列，所述缺失序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。具体如下：

缺失序列：GGTTTTTTTGCCAAGGATTCAACACTTGGGTTTT。(SEQ ID NO.2)

进一步的，所述InDel-cg1分子标记通过SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对扩增得到；具体如下：

正向引物序列：5′-GACAACGTCACCGAGGTCTT-3′；(SEQ ID NO.3)

反向引物序列：5′-GCCTCCATGAGAAAGTCGTT-3′。(SEQ ID NO.4)

通过上述引物对扩增的与玉米茎秆脆性相关的InDel分子标记特征条带为253bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；通过上述引物对扩增的与玉米茎秆非脆性相关的InDel分子标记特征条带为202bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步的，所述InDel-XL7233分子标记通过SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对扩增得到；具体如下：

正向引物序列：5′-TTTTGTTTTCCCGTCTCGTC-3′；(SEQ ID NO.7)

反向引物序列：5′-TGCTGATTCACGTTTTGCAT-3′。(SEQ ID NO.8)

本发明的第二方面，提供用于扩增上述InDel分子标记的引物对，所述引物对包括：引物对A和引物对B，所述引物对A的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述引物对B的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明的第三方面，提供含有上述引物对的试剂盒。

进一步的，所述试剂盒中还包括：dNTPs、DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

本发明的第四方面，提供上述InDel分子标记、引物对或试剂盒在如下1)-4)至少一项中的应用：

1)早期筛选或鉴定玉米种质资源的脆性；

2)区分纯合脆性玉米基因型、杂合非脆性玉米基因型和纯合非脆性玉米基因型；

3)早期筛选或鉴定鲜食玉米的皮渣率；

4)玉米分子标记辅助育种。

本发明的第五方面，提供一种早期筛选或鉴定玉米种质资源脆性的方法，所述方法包括：

(1)提取待测玉米种质资源的基因组DNA；

(2)采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对待测玉米种质资源的基因组DNA进行PCR扩增；若扩增出长度为253bp的扩增产物，则待测玉米种质资源为脆性玉米材料；若扩增出长度为202bp的扩增产物，则待测玉米种质资源为非脆性玉米材料；

或者，采用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对待测玉米种质资源的基因组DNA进行PCR扩增；若扩增出长度为166bp的扩增产物，则待测玉米种质资源为脆性玉米材料；若扩增出长度为200bp的扩增产物，则待测玉米种质资源为非脆性玉米材料。

优选的，步骤(2)中，PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

优选的，步骤(2)中，所述长度为253bp的扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述长度为202bp的扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第六方面，提供一种区分纯合脆性玉米基因型、杂合非脆性玉米基因型和纯合非脆性玉米基因型的方法，包括以下步骤：

利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对玉米基因组DNA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，若扩增出253bp一条带，则表明玉米为纯合脆性玉米基因型；若扩增出253bp和202bp两条条带，则表明玉米为杂合非脆性玉米基因型；若扩增出202bp一条带，则表明玉米为纯合非脆性玉米基因型；

或者，利用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对玉米基因组DNA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，若扩增出166bp一条带，则表明玉米为纯合脆性玉米基因型；若扩增出166bp和200bp两条条带，则表明玉米为杂合非脆性玉米基因型；若扩增出200bp一条带，则表明玉米为纯合非脆性玉米基因型。

优选的，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

本发明的第七方面，提供一种早期筛选或鉴定鲜食玉米皮渣率的方法，包括以下步骤：

利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对玉米基因组DNA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，扩增出253bp一条带的玉米材料的皮渣率低于扩增出253bp和202bp两条条带或扩增出202bp一条带的玉米材料的皮渣率；

或者，利用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对玉米基因组DNA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，扩增出166bp一条带的玉米材料的皮渣率低于扩增出166bp和200bp两条条带或扩增出200bp一条带的玉米材料的皮渣率。

本发明的有益效果：

(1)传统的玉米抗性育种，需要通过多代的回交和杂交的过程，时间周期较长，通过传统方法对玉米植株脆性表型的鉴定，对纯合非脆性和杂合非脆性的基因型是很难区分的，本发明的共分离的InDel分子标记为共显性，能够区分纯合脆性、杂合非脆性和纯合非脆性的基因型，省去了回交渗入过程中每代自交的步骤。通过传统方法对表型进行鉴定，需要对玉米植株的叶片或者茎秆进行折断试验，这不但会破坏植株的组织，而且会影响植株的正常生长，特别是在鲜食玉米皮渣率鉴定过程中，需要对鲜玉米籽粒进行研磨匀浆，这样会对所鉴定的材料造成不可逆的破坏，严重影响了所取样的玉米果穗的结实率和商品性，而通过此InDel标记避免了对植株造成不可逆的破坏，而且不需要等到授粉后进行鉴定，节省了大量的时间。通过此InDel标记可以利用玉米种子或者在玉米苗期对植株的基因型进行鉴定，在苗期就可以进行选择，对纯合脆性和杂合非脆植株进行选择性的间苗，这样既增加了选择的准确性也可以节省大部分的土地。

(2)本发明的InDel分子标记是利用在玉米脆性基因上的多态性开发的分子标记，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，本发明的分子标记可简便、快速、高通量地应用于育种实践。

(3)本发明开发的两种InDel分子标记分别来源于两个不同的种质材料，可以利用这两个供体材料的基因导入到父本群与母本群中，分别选择父本群中InDel-cg1杂合或InDel-XL7233杂合株系与母本群中InDel-XL7233杂合或InDel-cg1杂合株系，进行组配杂交种，这样可以将父本与母本分为两个杂种优势群，利于选出强优势组合。

附图说明

图1：分子标记InDel-cg1在多个非脆性自交系及脆性突变体的琼脂糖凝胶电泳效果，脆性突变体条带大小都为253bp，非脆性自交系条带大小都为202bp。

图2：分子标记InDel-cg1在脆性突变体与B73自交系构建的BC₁回交分离群体的琼脂糖凝胶电泳效果；图中B73为非脆性野生型，Mu为脆性突变体，M代表Marker。

图3：利用分子标记InDel-cg1对脆性突变体与B73自交系构建的BC₁回交分离群体中植株进行鉴定，并结合表型，对脆性材料和非脆性材料进行皮渣率测定。

图4：分子标记InDel-XL7233在非脆性自交系及脆性突变体的聚丙烯凝胶电泳效果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，目前玉米在InDel分子标记方面的研究相对滞后，与玉米茎秆脆性以及鲜食玉米的皮渣率相关的InDel分子标记更是未见有报道。

为此，本发明对玉米InDel分子标记进行了深入研究，发现了两个与玉米脆性基因共分离的InDel分子标记。利用该分子标记来检测鉴定玉米茎秆脆性性状和鲜食玉米的皮渣率，通过琼脂糖凝胶电泳可以快速区分其基因型，可以简便、快捷、高通量的用于育种实践。

本发明中的InDel-cg1分子标记发现自玉米脆性突变体J1628，是田间发现的自然突变体。以脆性突变体J1628为父本，自交系B73、黄早四、1145为母本，构建BC₁分离群体，对控制玉米脆性基因进行了精细定位。将所构建的BC₁分离群体在大田种植，在5叶期对分离群体进行表型鉴定，取脆性叶片提取植物总DNA，利用合成玉米IBM图谱上已有的以及自主开发的SSR标记对脆性突变体及亲本进行多态性筛选。并且通过已公布的玉米基因组进行SSR引物加密，最终将该脆性基因定位在Cbk12和XD116两个分子标记之间，物理距离为86kb。

Cbk12引物序列为Cbk12L:5’-AATCGGCTTCAACAGCGGTA-3’(SEQ ID NO.9)和Cbk12R:5’-GCGCACGTAGACTTATCGGA-3’(SEQ ID NO.10)；XD116引物序列为XD116L：5’-TGCCTAATTCTGCTTCACGACAACCTGA-3’(SEQ ID NO.11)和XD116R：5’-TTCAAAGCGAGGATGCCAGT-3’(SEQ ID NO.12)，通过已公布的玉米参考基因组对定位区间分析，发现在此区间内存在一个和脆性相关基因BK2。利用脆性突变体、B73野生型及分离群体单株对该候选基因进行基因测序分析，发现在从起始密码ATG开始1143处发现了一个51bp的插入(即玉米第9号染色体第125271625bp-125271626bp间插入51bp)，推断该候选基因即为控制玉米脆性的关键基因，所述的脆性突变体为BK2基因的一个新的等位突变。所述脆性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述非脆性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，二者之间存在51bp的插入突变。利用此插入突变，本发明开发了一个与玉米脆性基因共分离的InDel分子标记作为共分离标记，命名为InDel-cg1。所述InDel-cg1由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物扩增得到。

InDel-cg1在脆性突变体扩增的序列由253个核苷酸组成，如SEQ ID NO.5所示；InDel-cg1在非脆性亲本扩增得到的序列由202个核苷酸组成，如SEQ ID NO.6所示。经过多次重复鉴定及分子检测分析，脆性亲本均扩增出253bp大小的条带，而非脆性亲本均扩增出202bp大小的条带。通过回交群体分析，此标记与玉米脆性基因共分离，可简便、快速、高通量地应用于育种实践。

本发明中的InDel-XL7233分子标记发现自玉米脆性突变体XL7233，通过等位性测验，确定该突变体为J1862的等位突变。该突变体为缺失突变体，缺失34bp，所述分子标记位于玉米第9号染色体第125271994-125271995之间，根据缺失序列设计引物，命名InDel-XL7233，脆性材料扩增条带大小为166bp，非脆性材料扩增条带大小为200bp，可通过聚丙烯凝胶电泳快速区分其基因型(图4)。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：玉米脆性基因的获得

1.表型鉴定

用手指轻轻弯曲叶子中部主叶脉，脆性突变体植株叶片会立即发生断裂且断面整齐，并伴随着清脆的断裂声，而正常植株B73仅留下折痕并没有发生断裂，对突变体植株和B73植株所配的分离群体用上述方法进行脆性鉴定，得到同样结论。

2.遗传分析

本实验利用脆性突变体J1628与B73、黄早四、1145组配的BC₁分离群体，卡方适合度检测(χ² _0.05，1＝3.84)结果表明杂交后代的BC₁群体表现为野生型单株数：突变体单株数＝1：1的分离比(表1)，表明脆性突变性状受1对隐性核基因控制。

表1：脆性突变体遗传分析

3.脆性基因的初定位

(1)利用自交系B73与脆性突变体构建的BC₁分离群体在大田种植，在5叶期对分离群体进行表型鉴定，取脆性玉米叶片提取植物总DNA，玉米叶片DNA的提取方法如下：

①取约1g叶片装入2.5mL离心管，液氮速冻后研磨成粉末；

②加入约700μL SDS缓冲液，充分震荡混匀。

③放入60℃水浴锅中水浴30-40分钟，每隔10-15min震荡一次。

④取出离心管，加入Tris饱和酚350μL，氯仿350μL抽提，轻轻混匀后，8000rpm离心8min。

⑤取其上清液600μL于另一管，加异丙醇500μL，轻轻混匀，至有絮状DNA出现时静止。可放4℃静止30min,或-20℃静止1-2天。

⑥将离心管放入离心机，1200rpm离心6min,去上清液。用70％乙醇清洗2-3次。

⑦室温晾干后，溶于200μL1×TE，轻轻混匀，-20℃储存。

利用合成玉米IBM图谱上已有的以及自主开发的SSR标记对脆性突变体及亲本进行多态性筛选。采用混合群体分离分析法(BSA)对突变体进行基因定位，首先，利用平均分布在玉米全基因组上的435对公共的SSR引物(上述引物可以从MaizeGDB上下载)，对B73与脆性突变体进行多态性标记筛选，其中有142对引物存在亲本多态性差异。随机选取5株正常植株DNA及5株突变体植株DNA等量混合，构建正常DNA池和突变DNA池，将这142对引物进行初步的连锁性分析，最终筛选出12对可能与脆性性状紧密连锁的标记。随后，将这12对可能与目标基因连锁的分子标记对32个BC₁脆性植株进行PCR扩增并用凝胶电泳验证。

结果发现G1、G6、W2-1这3个标记与目标性状紧密连锁。用782个脆性突变植株对这3对引物进一步进行PCR扩增和电泳验证，找出标记间发生重组交换的单株，根据交换单株的个数和物理位置，将脆性基因初步定位于玉米9号染色体p-umc1522和G1标记之间，遗传距离分别为2cM和3.7cM，物理距离为41Mb。

4.脆性基因的精细定位

为了扩大群体，在山东泰安实验基地种植了B73、黄早四、1145与脆性突变体构建的BC₁分离群体，共种植了15400株，鉴定出7462株脆性植株，对脆性植株叶片提取植物总DNA。在初定的p-umc1522和G1标记之间，开发了300多对SSR分子标记，对B73、黄早四、1145与脆性突变体进行亲本多态性差异检测，利用有差异的标记继续进行精细定位，最终将脆性基因定位在Cbk12和XD116两个分子标记之间，物理距离为86kb，通过已公布的玉米参考基因组对定位区间分析，发现在此区间内存在一个和脆性相关基因BK2，利用脆性突变体、B73野生型及分离群体单株对该候选基因进行基因测序分析，发现在从起始密码ATG开始1143处发现了一个51bp的插入，推断该候选基因即为控制玉米脆性的关键基因。所述的脆性突变体为BK2基因的一个新的等位突变。

实施例2：基于玉米脆性基因的InDel标记的开发

本发明的玉米脆性基因是在一个自然突变体J1628中得到的，序列如SEQ IDNO.13所示；非脆性基因是在非脆性野生型中得到的，序列如SEQ ID NO.14所示，两者之间存在一个51bp的插入突变，根据此插入突变，本发明利用primer5引物设计软件在突变位点两侧设计正反引物。正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示，具体如下：

正向引物序列：5′-GACAACGTCACCGAGGTCTT-3′；(SEQ ID NO.3)

反向引物序列：5′-GCCTCCATGAGAAAGTCGTT-3′。(SEQ ID NO.4)

脆性材料的PCR扩增条带大小为253bp，非脆性材料的PCR扩增条带大小为202bp，通过琼脂糖凝胶电泳可以快速区分其基因型。

PCR扩增的体系为20μL，具体如下：

扩增条件为：

通过上述扩增即可获得脆性突变体及BC₁回交分离群体中脆性材料扩增片段，大小均为253bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；玉米非脆性野生型及BC₁回交分离群体中非脆性材料，扩增片段大小均为202bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

将上述扩增产物分别在1％琼脂糖凝胶电泳分离后，脆性突变体及BC₁分离群体中脆性材料条带大小为253bp，玉米非脆性野生型及BC₁分离群体中非脆性材料条带大小为202bp。

如图1所示，10份不同的非脆性野生型及脆性突变体电泳条带清晰稳定，用1％琼脂糖凝胶电泳可以显示出明显差异，且不同单株重复性较好。如图2所示，回交分离群体中脆性材料与非脆性材料及F₁电泳条带清晰稳定，用1％琼脂糖凝胶电泳可以明显的分出差异，其中，分离群体中的脆性材料为一条253bp的条带，分离群体中的非脆性材料为253bp和202bp两条条带，所以，此InDel标记可简便、快速、高通量地应用于育种实践，这将大大加速玉米脆性基因分子育种进程。

实施例3：脆材料与非脆性材料皮渣率测定

利用分子标记InDel-cg1对脆性突变体与B73自交系构建的BC₁回交分离群体中植株进行鉴定，并结合表型，对脆性玉米籽粒和非脆性玉米籽粒进行皮渣率测定，具体方法如下：

称取两份等质量授粉22天采收的鲜玉米籽粒60-100g，一份放入匀浆机中高速打磨4-5次，每次打磨30s，将分离的玉米浆和玉米渣全部转移到提前称好质量的(M1)60目分样筛中，用清水冲洗玉米皮渣，直到从分样筛中流出的水变清。将冲洗好的皮渣连同分样筛一起放入70℃鼓风烘箱中干燥至恒重，后取出放入干燥器冷却称重，质量为(M2)；另一份新鲜的籽粒放入70℃鼓风干燥箱中烘干直至质量恒定(M3)，3组重复(张凯迪，2008)。

皮渣率％＝(M2－M1)/M3×100％。

测定结果显示脆性玉米籽粒皮渣率平均为18％，非脆性玉米籽粒皮渣率平均为21％(图3)，脆性材料与非脆性材料皮渣率差异达到显著水平(P<0.05)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 与玉米脆性基因共分离的InDel分子标记及其应用

<130> 2020

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggaaaaaaat ttgttgcagc cgggctgcaa caaatttttt tccatgttct a 51

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtttttttg ccaaggattc aacacttggg tttt 34

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacaacgtca ccgaggtctt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcctccatga gaaagtcgtt 20

<210> 5

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacaacgtca ccgaggtctt cagcttccag tacaagccgc tgcaaccata cgggagcatc 60

agtgagtata atcatcgtca tctgatgaca tgacatgaca tgtacataat catcggtgtc 120

tcaaatatat atatgcaatt aatgcagatg acactggcat gttctaggaa aaaaatttgt 180

tgcagccggg ctgcaacaaa tttttttcca tgttctacgg gctcaagttc tacaacgact 240

ttctcatgga ggc 253

<210> 6

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gacaacgtca ccgaggtctt cagcttccag tacaagccgc tgcaaccata cgggagcatc 60

agtgagtata atcatcgtca tctgatgaca tgacatgaca tgtacataat catcggtgtc 120

tcaaatatat atatgcaatt aatgcagatg acactggcat gttctacggg ctcaagttct 180

acaacgactt tctcatggag gc 202

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttttgttttc ccgtctcgtc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgctgattca cgttttgcat 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aatcggcttc aacagcggta 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcgcacgtag acttatcgga 20

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgcctaattc tgcttcacga caacctga 28

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttcaaagcga ggatgccagt 20

<210> 13

<211> 2083

<212> DNA

<213> 脆性基因

<400> 13

attcgccctg cctctagctg ctgcttcttc caggatcggg gatcggagct tgtgctgcta 60

ctgctactat accagcgcta gctagcagca gccgccggcc ggctcgcgca agctaaggaa 120

gggtcgacat gacgatgggg ctccgcgtcc gcgactcctc cgcgctgctg gctctggccg 180

tcgcgctcgc ctgctgctcc gttgcagttc ggttaccata tttcattcat ctgaaaatgt 240

aaacagtgtc gatcggtcga tgggcgacgc tcacattctc tcctctcctg tcgccatggc 300

tggcggctgc tgcacacaca ctggcacttg cgcagtggtg gcctacgacc ccctggaccc 360

gaacggcaac atcaccatca agtgggacgt gatctcgtgg acgcccgacg ggtacgtggc 420

gatggtgacg atgagcaact accagatgta ccggcacatc atggcgcccg ggtggacgtt 480

ggggtggtcg tgggccaaga aggaggtgat ctggtccatc gtgggggcgc aggccacgga 540

gcagggggac tgctccaagt tcaagggcgg catcccgcac tgctgcaagc gcaccccggc 600

cgtggtggac ctcctcccgg gggtgcccta caaccagcag atcgccaact gctgcaaggc 660

cggcgtggtg tcggcgtacg ggcaggaccc ggcggggtcc gtctccgcgt tccaggtctc 720

cgtcggcctg gccggtacca ccaacaagac ggtgaagctg cccaggaact tcacgctcat 780

ggggcccggg ctgggctaca cctgcgggcc cgccgccgtg gtgccgtcca ccgtgtactg 840

gacgcccgac caccggcgcc ggacgcaggc gctcatgacg tggacggtga cctgcaccta 900

ctcgcagcag ctggcgtccc ggtacccgtc ctgctgcgtc tccttctcct ccttctacaa 960

cagcaccatc gtgccgtgcg cccggtgcgc gtgcggctgc ggcggccacg gcggccacgc 1020

gggtccgggc ggctgcatcg agggggactc caagcgcgcg ctgtcggccg gggtgaacac 1080

gccgcgcaag gacggccagg cgctgctgca gtgcacgccg cacatgtgcc ccatccgggt 1140

gcactggcac gtcaagctca actacaagga ctactggcgc gccaagatcg ccatcaccaa 1200

ctacaactac aggatgaact acacgcagtg gacgctggtg gcgcagcacc ccaacctgga 1260

caacgtcacc gaggtcttca gcttccagta caagccgctg caaccatacg ggagcatcag 1320

tgagtataat catcgtcatc tgatgacatg acatgacatg tacataatca tcggtgtctc 1380

aaatatatat atgcaattaa tgcagatgac actggcatgt tctaggaaaa aaatttgttg 1440

cagccgggct gcaacaaatt tttttccatg ttctacgggc tcaagttcta caacgacttt 1500

ctcatggagg ccggcccgtt cggcaacgtg cagtcggagg tgctcatgcg caaggacgca 1560

aggaccttca ccttcagcat gggctgggcg ttcccgcgca agatctactt caacggcgac 1620

gagtgcaaga tgccgccgcc ggactcctac ccctacctgc ccaacgccgc gcccgtcgtc 1680

gcctcgcagc tggtcctgtc cgccgccgcc tcggcgttcc tactgttgct gctcctggtg 1740

gcatgaccgt gaccgaacca agggcaaggc ctccgttttg ttttcccgtc tcgtcccgtg 1800

ggcagggagc agacttcagt aggcagggca ttttatttgg tttttttgcc aaggattcaa 1860

cacttgggtt ttcgtcagag gaaaactgtc gtgtatgtag tgtgagttgc aggtcgtcgg 1920

atccccacgt acaagacaat ctttggatct agaatatgca aaacgtgaat cagcacgcca 1980

ggatcatcgt ctcctacaag attggcagaa aaaaaatctc atgatgagtg atgtgtcaac 2040

agacctatat atatgtgata atcactggtt tcaacggttg cct 2083

<210> 14

<211> 2032

<212> DNA

<213> 非脆性基因

<400> 14

attcgccctg cctctagctg ctgcttcttc caggatcggg gatcggagct tgtgctgcta 60

ctgctactat accagcgcta gctagcagca gccgccggcc ggctcgcgca agctaaggaa 120

gggtcgacat gacgatgggg ctccgcgtcc gcgactcctc cgcgctgctg gctctggccg 180

tcgcgctcgc ctgctgctcc gttgcagttc ggttaccata tttcattcat ctgaaaatgt 240

aaacagtgtc gatcggtcga tgggcgacgc tcacattctc tcctctcctg tcgccatggc 300

tggcggctgc tgcacacaca ctggcacttg cgcagtggtg gcctacgacc ccctggaccc 360

gaacggcaac atcaccatca agtgggacgt gatctcgtgg acgcccgacg ggtacgtggc 420

gatggtgacg atgagcaact accagatgta ccggcacatc atggcgcccg ggtggacgtt 480

ggggtggtcg tgggccaaga aggaggtgat ctggtccatc gtgggggcgc aggccacgga 540

gcagggggac tgctccaagt tcaagggcgg catcccgcac tgctgcaagc gcaccccggc 600

cgtggtggac ctcctcccgg gggtgcccta caaccagcag atcgccaact gctgcaaggc 660

cggcgtggtg tcggcgtacg ggcaggaccc ggcggggtcc gtctccgcgt tccaggtctc 720

cgtcggcctg gccggtacca ccaacaagac ggtgaagctg cccaggaact tcacgctcat 780

ggggcccggg ctgggctaca cctgcgggcc cgccgccgtg gtgccgtcca ccgtgtactg 840

gacgcccgac caccggcgcc ggacgcaggc gctcatgacg tggacggtga cctgcaccta 900

ctcgcagcag ctggcgtccc ggtacccgtc ctgctgcgtc tccttctcct ccttctacaa 960

cagcaccatc gtgccgtgcg cccggtgcgc gtgcggctgc ggcggccacg gcggccacgc 1020

gggtccgggc ggctgcatcg agggggactc caagcgcgcg ctgtcggccg gggtgaacac 1080

gccgcgcaag gacggccagg cgctgctgca gtgcacgccg cacatgtgcc ccatccgggt 1140

gcactggcac gtcaagctca actacaagga ctactggcgc gccaagatcg ccatcaccaa 1200

ctacaactac aggatgaact acacgcagtg gacgctggtg gcgcagcacc ccaacctgga 1260

caacgtcacc gaggtcttca gcttccagta caagccgctg caaccatacg ggagcatcag 1320

tgagtataat catcgtcatc tgatgacatg acatgacatg tacataatca tcggtgtctc 1380

aaatatatat atgcaattaa tgcagatgac actggcatgt tctacgggct caagttctac 1440

aacgactttc tcatggaggc cggcccgttc ggcaacgtgc agtcggaggt gctcatgcgc 1500

aaggacgcaa ggaccttcac cttcagcatg ggctgggcgt tcccgcgcaa gatctacttc 1560

aacggcgacg agtgcaagat gccgccgccg gactcctacc cctacctgcc caacgccgcg 1620

cccgtcgtcg cctcgcagct ggtcctgtcc gccgccgcct cggcgttcct actgttgctg 1680

ctcctggtgg catgaccgtg accgaaccaa gggcaaggcc tccgttttgt tttcccgtct 1740

cgtcccgtgg gcagggagca gacttcagta ggcagggcat tttatttggt ttttttgcca 1800

aggattcaac acttgggttt tcgtcagagg aaaactgtcg tgtatgtagt gtgagttgca 1860

ggtcgtcgga tccccacgta caagacaatc tttggatcta gaatatgcaa aacgtgaatc 1920

agcacgccag gatcatcgtc tcctacaaga ttggcagaaa aaaaatctca tgatgagtga 1980

tgtgtcaaca gacctatata tatgtgataa tcactggttt caacggttgc ct 2032

Claims

1.与玉米脆性基因共分离的InDel分子标记，所述InDel分子标记为InDel-cg1分子标记；

InDel-cg1分子标记位于玉米第9号染色体第125271625 bp - 125271626 bp之间，所述InDel-cg1分子标记的多态性为-/插入序列，所述插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel-cg1分子标记通过SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对扩增得到；通过所述引物对扩增的与玉米茎秆脆性相关的InDel分子标记特征条带为253bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；通过所述引物对扩增的与玉米茎秆非脆性相关的InDel分子标记特征条带为202bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.权利要求1或2所述的InDel分子标记在如下1）-4）至少一项中的应用：

1）早期筛选或鉴定玉米种质资源的脆性；

2）区分纯合脆性玉米基因型、杂合非脆性玉米基因型和纯合非脆性玉米基因型；

3）早期筛选或鉴定鲜食玉米的皮渣率；

4）玉米分子标记辅助育种。

4.一种早期筛选或鉴定玉米种质资源脆性的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）提取待测玉米种质资源的基因组DNA；

（2）采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对待测玉米种质资源的基因组DNA进行PCR扩增；若扩增出长度为253bp的扩增产物，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，则待测玉米种质资源为脆性玉米材料；若扩增出长度为202bp的扩增产物，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示则待测玉米种质资源为非脆性玉米材料。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增的条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min。

6.一种区分纯合脆性玉米基因型、杂合非脆性玉米基因型和纯合非脆性玉米基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对玉米基因组DNA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，若扩增出SEQ ID NO.5所示的长度为253bp一条带，则表明玉米为纯合脆性玉米基因型；若扩增出SEQ ID NO.5所示的长度为253bp和SEQ ID NO.6所示的长度为202bp两条条带，则表明玉米为杂合非脆性玉米基因型；若扩增出SEQ ID NO.6所示的长度为202bp一条带，则表明玉米为纯合非脆性玉米基因型；

所述PCR扩增的条件为： 94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10 min。

7.一种早期筛选或鉴定鲜食玉米皮渣率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对玉米基因组DNA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，扩增出SEQ ID NO.5所示的长度为253bp一条带的玉米材料的皮渣率低于扩增出SEQ ID NO.5所示的长度为253bp和SEQ ID NO.6所示的长度为202bp两条条带或扩增出SEQ ID NO.6所示的长度为202bp一条带的玉米材料的皮渣率。