CN112430627B - 通过周期性拉伸促进阳离子脂质体递送核酸药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过周期性拉伸促进阳离子脂质体递送核酸药物的方法,属于医药技术领域。通过将载有核酸药物的阳离子脂质体加入含有细胞的培养液中,将培养液置于应力加载系统上对细胞进行拉伸,设置合适的拉伸长度和拉伸频率,选择拉伸模式为加入载药脂质体进行转染的同时进行持续3‑8h的无间隔拉伸,可以提高阳离子脂质体递送核酸药物的效率。本发明使用的拉伸方法对癌细胞的作用效果更为明显,具备取材容易、操作简单、收效明显、无明显毒性反应等特点,特别适合我国目前的基础实验室研究和临床科室开展各类临床前实验,具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体而言,涉及一种通过周期性拉伸促进阳离子脂质体递送核酸药物的方法。
背景技术
核酸药物是各种具有不同功能的寡聚核糖核苷酸(RNA)或寡聚脱氧核糖核苷酸(DNA),主要作用于基因水平,在信息流传递的上游阶段起作用,效率较高。由于其具有特定的靶点和作用机制,因此核酸药物具有广泛的应用前景。现今人类面临的8000多种疾病,其中7000多种是遗传性罕见病,其发病率低、在临床治疗上几乎无药可治,核酸药物对这种单基因疾病非常有优势,例如遗传疾病、代谢性疾病、肿瘤、传染性疾病以及罕见病等重大疾病。在全球精准医疗大时代下,不同基因差异或表达异常引起的疾病,理论上核酸药都可对其进行个性化开发。
由于一般的核酸药物分子量大,又具有亲水性,与具有两亲性的细胞膜难以融合;核酸药物带负电荷,易与同样带有负电荷的细胞膜表面产生静电排斥,导致核酸药物难以被细胞吸收。通常情况下核酸药物需要载体协助递送。
根据递送使用的载体种类,核酸药物递送方式主要分为病毒类与非病毒类。病毒类载体能够依赖自身衣壳表面的蛋白靶向哺乳动物细胞表面相应的受体从而引发膜融合或者细胞的内吞,将核酸药物高效地递送到宿主细胞内,具有较高的传递效率。但病毒类载体存在变异风险,因此在考虑递送核酸药物时更多选择非病毒类载体。
非病毒类载体主要为多聚阳离子载体、脂质体、无机纳米材料、框架核酸等纳米载体。与病毒载体相比,非病毒类载体的特征在于更低的毒性,能够避免造成机体组织器官的损伤以及载体复合物的清除。此外,非病毒载体能够与任何形式的核酸材料大量结合,提高核酸装载量。基于以上特点,非病毒载体作为核酸递送载体受到了广泛的关注。
脂质体是由一层或者多层的磷脂双分子层组成的封闭的囊泡状结构,具有很高的生物相容性、生物可降解性和安全性,因此它可以被用来递送多种活性成分。脂质体的内部与外部均为亲水相,磷脂双分子层中为亲油相,药物可根据其极性包裹于磷脂双分子中或内外水相中。阳离子脂质体表面带正电荷,能与核酸的磷酸根通过静电作用,将分子包裹入内,形成复合体;也能被表面带负电荷的细胞膜吸附,再通过融合、细胞内吞作用或渗透作用,将药物传递进入细胞。但阳离子脂质体形成的纳米复合物尺寸较大,这在一定程度上影响了脂质体的细胞摄取。
阳离子脂质体通过吸附内吞、膜融合或受体介导的内吞途径入胞,其中小窝蛋白介导的内吞途径是重要的通路之一。小窝蛋白是小窝的主要结构和调节成分,小窝蛋白不仅参与跨膜物质转运,而且是细胞信号分子富集和信号转导的枢纽。小窝蛋白能与关键性信号分子连接,对其活性状态起直接调控作用,尤其是负性调控作用,从而参与了细胞生理过程。因此,目前多采用将核酸类药物包裹在病毒载体或脂质类非病毒载体内,可使药物的稳定性明显增加。但是,脂质类非病毒载体系统还存在包裹率低、转染效率不高以及易出现脱靶效应等问题,这些均限制了其推广和应用。因此提高递送系统转染效率成为核酸类药物所要解决的另一大难题。
力学刺激在维持细胞稳态中起非常重要的作用,参与了骨骼、肌肉、肺、血管等组织和器官的发生、发育及生长。有充分的文献证明,细胞在受力学刺激下会发生异于静态条件下的行为,包括级联反应和转录因子表达水平受到影响。以对细胞进行周期性拉伸为例,在对循环拉伸的众多生物和生理反应中,大多可分为四个主要领域:改变细胞骨架和细胞外基质、激活细胞信号通路、转录因子功能的改变和基因调控和细胞增殖的变化。周期性拉伸可以改变细胞生理学、细胞骨架结构、信号转导、基因表达。
到目前为止,没有任何细胞在力学刺激周期性拉伸动态条件下,递送系统的转染效率如何变化的研究。作为外源性核酸药物,无论是病毒的还是非病毒,都必须穿过质膜进入细胞,穿过细胞质和细胞骨架网络,进入细胞核,并被转录,这样基因治疗才能成功,这一过程与力学刺激密切相关。为了填补在力学刺激下体外细胞层面药物递送系统的转染效率情况的空白,更好地提高脂质非病毒载体的转染效率,本发明人通过大量实验和创造性劳动,利用力学刺激对细胞进行一定处理,对细胞的骨架蛋白产生显著干预,使骨架蛋白更加松弛,将有利于提高阳离子脂质体递送核酸药物的效率,为体外研究如何提高脂质载体递送核酸药物提供了借鉴。
发明内容
本发明针对上述问题,提供一种通过周期性拉伸促进阳离子脂质体递送核酸药物的方法。
本发明的通过周期性拉伸促进阳离子脂质体递送核酸药物的方法,其包括如下步骤:
细胞接种于双向应力细胞培养板上,加入无血清培养液,将载有核酸药物的阳离子脂质体加入含有细胞的培养液中,将双向应力细胞培养板置于应力加载系统上,设置细胞拉伸长度为3-8%,拉伸频率为0.5-2.0Hz,拉伸模式为加入载有核酸药物的阳离子脂质体进行转染的同时进行持续3-8h的无间隔拉伸,转染结束后,用新鲜的含血清的培养液替换原培养液。
根据本发明优选的实施方案,所述的细胞拉伸长度为5%,拉伸频率为0.5Hz。
根据本发明优选的实施方案,所述的无间隔拉伸拉伸持续时间为5-8h。
根据本发明优选的实施方案,所述的无血清培养液为无血清的DMEM高糖培养基;所述的含血清的培养液为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。
根据本发明优选的实施方案,细胞的种板浓度为9×105-3×106个/孔。
根据本发明优选的实施方案,所述的载有核酸药物的阳离子脂质体的用量为20-30μg/孔。
根据本发明优选的实施方案,所述载有核酸药物的阳离子脂质体中,核酸药物与阳离子脂质体的质量比为:1:10,即2-3μg/孔。
根据本发明优选的实施方案,双向应力细胞培养板上每孔加入的无血清培养液量为1mL,以提高转染过程中载有核酸药物的阳离子脂质体的浓度;转染结束后,含血清的培养液的加入量为3mL/孔。
根据本发明优选的实施方案,所述的细胞优选为干细胞。
与现有技术相比,本发明具有的有益效果是:
通过限定的细胞拉伸条件,即设置拉伸长度为3-8%,拉伸频率为0.5-2.0Hz,拉伸模式为加入载药脂质体进行转染的同时进行持续3-8h的无间隔拉伸,使得载有核酸药物的阳离子脂质体的胞机制由CPZ和细胞松弛素所抑制的入胞途径转变为以吲哚美辛所抑制的入胞途径,即网格蛋白介导的胞吞,有利于将核酸药物通过细胞膜融合或者受体介导的胞吞作用递送入细胞内。
本发明创造性地模拟了人体体内环境,研究了核酸药物在人体动态平衡下的释放与吸收情况,证明了在限定的拉伸条件下,拉伸刺激可以提高阳离子脂质体递送核酸药物的效率,为药理活性评价与药物筛选提供了新的方案,对细胞疗法和临床生物药物递送具有研究意义。
本发明使用的拉伸方法可以提高阳离子脂质体递送核酸药物的效率,并且对癌细胞的作用效果更为明显,具备取材容易、操作简单、收效明显、无明显毒性反应等特点,特别适合我国目前的基础实验室研究和临床科室开展各类临床前实验,具有广阔的市场前景。
附图说明
图1实施例1与实施例2细胞拉伸长度与频率实验结果;
图2实施例4细胞拉伸模式实验结果;
图3实施例5细胞摄取药物效率实验结果;
图4实施例5药物体内分布的流式分析结果;
图5实施例6拉伸前后药物入胞途径变化;
图6实施例7WB-相应蛋白分析结果;
图7实施例8两种细胞拉伸前后的药物摄取率;
图8实施例9两种载药方式拉伸前后的药物递送效率;
附图1中A为细胞拉伸长度实验结果,B为细胞拉伸频率实验结果;
附图2中A为转染前拉伸实验结果,B为转染后拉伸实验结果,C为转染时拉伸实验结果;
附图4中A为未拉伸细胞1、3、6、9h的药物胞内摄取情况,B为拉伸细胞1、3、6、9h的药物胞内摄取情况;
附图6中1为对照组,2为给药组。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明,但不以任何形式限制本发明。
需要说明,本发明所述的DMEM高糖培养基和DMEM高糖培养液具有完全相同的含义,其为市售标准产品。DMEM高糖培养基有利于细胞停泊于一个位置生长,适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞。
实施例1:细胞拉伸长度实验
配置含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养液作为培养基,接种B16F10细胞(购于中国科学院上海生命科学研究院),将培养皿置于5%二氧化碳、饱和湿度下37℃的培养箱内培养。
取出培养箱内的细胞加入胰酶消化并加入培养液终止消化,在1200r/min、室温条件下离心5分钟。去除上清液,加适量培养液重悬并吹匀,取10μl于血球计数板上计数。用培养液将细胞浓度稀释至1×105cells/ml后,取双向应力细胞培养板(CULTURE PLATES),板上每孔中加入3ml细胞悬液,摇晃使细胞均匀分布。放入5%二氧化碳、饱和湿度下37℃的培养箱中过夜,使细胞贴壁。
待细胞贴壁后取出培养箱内的细胞,倒出培养液,PBS缓冲液清洗,加入1mL无血清DMEM高糖培养液。取适量(3ug pDNA/well,weight ratio脂质体:pDNA=10:1)载药脂质体加入双向应力细胞培养板(CULTURE PLATES),将培养板置于FX-5000T应力加载系统,设置拉伸频率为0.5Hz。保持其他条件不变,以拉伸长度为变量,长度范围为1-10%,对实验细胞进行拉伸。将培养板置于培养箱中培养,6小时后取出培养板,去除上清液,每孔加入3ml含血清DMEM高糖培养液,继续在培养箱中培养18小时,得到基因转染成功的实验细胞。
实施例2:细胞拉伸频率实验
设定拉伸长度为5%,以拉伸频率为变量,频率范围为0.1-6.0Hz,对实验细胞进行拉伸。其他操作同实施例1。
对比例1:
实施例3:荧光素酶报告基因检测
1.萤火虫荧光素酶检测
取实施例1~2、对比例1的实验后细胞,吸去培养液,PBS缓冲液清洗2次。每孔加入1mL报告基因细胞裂解液,在置于摇床的冰袋上振摇30分钟。每孔内细胞裂解液吹打约20次,用细胞刮刀确保细胞充分裂解并转移至EP管中,在13500r/min、室温条件下离心5分钟。取上清液,吸取500μl置于新的EP管中,避光条件下加入500μl荧光素酶检测试剂,用枪吹匀后放入发光检测仪中测定荧光值。
2.蛋白质浓度检测
按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B(50:1)配置BCA工作液,充分混匀。将蛋白标准溶液用超纯水分别稀释至浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml,分别以20μl/孔加入96孔板中,各孔再加200μl BCA工作液,用1ml枪头轻吹除去气泡,在摇床上振摇30秒后,37℃放置30分钟,用酶标仪在570nm下测定吸光度,绘制标准曲线。另取测荧光值时剩余的细胞裂解液,用超纯水稀释4倍,分别以20μl/孔加入96孔板中,各孔再加200μl BCA工作液,充分混匀,37℃放置30分钟后,用酶标仪在570nm下测定吸光度值,代入标准曲线计算蛋白含量,计算公式如下:
结果见附图1。从附图1中可以发现,当其他实验条件保持不变时,设置拉伸长度为3-8%,拉伸频率为0.5-2.0Hz,脂质体转染基因的效率显著提升。
实施例4:细胞拉伸模式实验
选取拉伸长度为5%,拉伸频率为0.5HZ的实验条件,设置转染前拉伸、转染后拉伸、转染时拉伸三个大实验组,转染前拉伸、转染后拉伸组设置拉伸时间分别为0、1、3、6、9、12、24h,转染时拉伸组设置拉伸具体组别为不拉伸(对照)、拉伸30s/间隔90s、拉伸0.5h/间隔0.5h、拉伸1h/间隔1h、拉伸6h不间断(所有的情况拉伸的总时长均为6h),其他操作同实施例1。对实验后细胞进行荧光素酶报告基因检测,其他操作同实施例3。
结果见附图2。从附图2中可以发现,当设置拉伸长度为5%,拉伸频率为0.5Hz且其他实验条件不变时,最佳拉伸模式为加入载药脂质体进行转染的同时进行持续6h的无间隔拉伸;当设置为其他拉伸模式时,脂质体转染基因的效率提升不明显。
实施例5:细胞摄取实验
为验证本发明对细胞摄取药物效率的影响,选取拉伸长度为5%,拉伸频率为0.5HZ、拉伸模式为加入载药脂质体进行转染的同时进行持续6h无间隔拉伸的实验条件,选取细胞转染后1、3、6、9h为观测点,计算细胞对药物的摄取效率。结果见附图3。
利用免疫荧光单标记法对药物在上述细胞内分布情况进行研究。利用流式细胞仪检测并记录结果。结果见附图4。
从附图3和附图4中可以发现,拉伸之后,细胞对于载药脂质体的摄取能力有显著提升,尤其在拉伸后1h和3h。
实施例6:拉伸前后药物入胞途径的考察
为考察拉伸前后细胞摄取药物的途径,选取了4条药物入胞途径(分别为CPZ、Cytochaiasin、Indometacin、Sodium azide),在细胞贴壁后的培养板中加入相应的内吞抑制剂,孵育30min,选取拉伸长度为5%,拉伸频率为0.5HZ、拉伸模式为加入载药脂质体进行转染的同时进行持续6H无间隔拉伸的实验条件,其余操作同实施例1。
结果见附图5。从附图5中可以发现,细胞拉伸之后,其主要入胞机制由CPZ和cytochalasin所抑制的入胞途径转变为以Indometacin所抑制的入胞途径,即网格蛋白介导的胞吞。
实施例7:特定蛋白对药物入胞的影响
为验证药物入胞途径蛋白水平表达的改变,我们利用蛋白质免疫印迹技术(Western Blot,WB)对相应蛋白进行分析。通过化学发光凝胶成像系统拍照。
结果见附图6。从附图6中可以发现,EHD2的结果没有差异,F-actin和caveolin-1的蛋白表达水平发生变化:F-actin蛋白的表达下调,而Caveolin-1蛋白的表达上调,证明细胞内吞与小窝蛋白具有一定的相关性。
实施例8:细胞种类对拉伸效果的影响
为验证不同的细胞或处于不同生长阶段的细胞对于拉伸刺激的响应,设置拉伸长度为5%,拉伸频率为0.5Hz,拉伸模式为加入载药脂质体进行转染的同时进行持续6h的无间隔拉伸,设置组别为间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)与小鼠黑色素瘤细胞(B16F10),其他操作同实施例1。
结果见附图7。从附图7中可以发现,拉伸过后,两种细胞对于药物的摄取率均有不同程度的增加,表明拉伸刺激可以促进不同细胞对脂质体协载药物的摄取率;B16F10细胞对拉伸刺激的相应程度远大于MSC细胞,表明拉伸刺激可以大大地促进脂质体协载基因类药物治疗癌症,在临床使用上具有良好的前景。
实施例9:拉伸刺激对载药方式的影响
为验证拉伸刺激对阳离子脂质体外的游离载药是否有效,设置拉伸长度为5%,拉伸频率为0.5Hz,拉伸模式为加入载药脂质体进行转染的同时进行持续6h的无间隔拉伸,设置组别为Naked-pGL组(游离药物组)与Lipo C/pGL(脂质体载药组),其他操作同实施例1。
结果见附图8。从附图8中可以发现,拉伸前后,游离药物的递送效率没有明显上升,而脂质体协载的基因药物递送效率大大增大,表明在拉伸条件下无作用的基因药物,必须在阳离子脂质体的介导下,才能促进核酸药物的递送。
Claims (8)
1.一种通过周期性拉伸促进阳离子脂质体递送核酸药物的方法,其特征在于:
小鼠黑色素瘤细胞B16F10接种于双向应力细胞培养板上,加入无血清培养液,将载有核酸药物的阳离子脂质体加入含有细胞的培养液中,将双向应力细胞培养板置于应力加载系统上,设置细胞拉伸长度为3-8%,拉伸频率为0.5-2.0Hz,拉伸模式为加入载有核酸药物的阳离子脂质体进行转染的同时进行持续3-8h的无间隔拉伸,转染结束后,用新鲜的含血清的培养液替换原培养液。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的细胞拉伸长度优选为5%,拉伸频率优选为0.5Hz。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的无间隔拉伸拉伸持续时间优选为5-8h。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的无血清培养液为无血清的DMEM高糖培养基;所述的含血清的培养液为含血清的DMEM高糖培养基。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,细胞的种板浓度为9×105-3×106个/孔。
6. 根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的载有核酸药物的阳离子脂质体的用量为20-30 μg/孔。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述载有核酸药物的阳离子脂质体中,核酸药物与阳离子脂质体的质量比为:1:10。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述无血清培养液的加入量为1mL/孔;转染结束后,含血清的培养液的加入量为3mL/孔。
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