CN112423776B - 冻干方法和由该方法获得的替维瑞克-tfa冻干物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备替维瑞克‑TFA冻干物的冻干方法，所述方法包括以下步骤：a)通过以足以提供微晶替维瑞克‑TFA悬浮液而不形成凝胶的摩尔比混合替维瑞克和三氟乙酸来提供冻干悬浮液，和b)将所述冻干悬浮液冻干，从而提供替维瑞克‑TFA冻干物。该方法提供了获得“纯”替维瑞克‑TFA冻干物的可能性，即在组合物中没有任何不希望的残留物。
Description
技术领域
本发明涉及一种冻干方法，一种通过所述方法获得的替维瑞克-TFA冻干物，以及一种重构所述替维瑞克-TFA冻干物的方法。
背景技术
替维瑞克(Teverelix)是一种合成的促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRH拮抗剂)，与内源性神经激素GnRH(或称为黄体生成素释放激素，LHRH)竞争结合其在垂体前叶中的受体。通过降低或阻断GnRH的作用，该GnRH拮抗剂抑制促卵泡激素(FSH)和黄体生成素(LH)从垂体前叶释放。
FSH和LH均参与正常的生殖功能。在女性中，FSH刺激未成熟的格拉夫卵泡(Graafian follicle)生长至成熟，而LH水平的变化控制排卵。另一方面，在男性中，FSH在精子发生中起重要作用，而LH刺激睾丸中睾酮的产生。
因此，替维瑞克适合于治疗激素依赖性病症，例如良性前列腺肥大、激素依赖性前列腺癌、子宫内膜异位症和子宫肌瘤。
缓释制剂通常需要溶解在少量的水或某种其它合适溶剂中的很高浓度的活性成分。由于替维瑞克(Ac-D-Nal-D-pClPhe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2)是疏水性肽，它不易溶于水或其它溶剂中。替维瑞克还甚至在低浓度下也倾向于在水性或其它溶剂中形成凝胶，这大大限制了它在缓释制剂中的使用。
WO2003/022243旨在解决该问题，并公开了可以通过使替维瑞克肽与抗衡离子、例如三氟乙酸根(TFA)接触来防止形成凝胶。根据WO2003/022243，为了确保得到期望的微晶悬浮液，替维瑞克与抗衡离子三氟乙酸根的比率至少为1:1.6是至关重要的，否则将形成凝胶。然而，本发明的发明人发现，WO2003/022243中公开的摩尔比将导致不希望的凝胶形成并导致悬浮液不均匀。这是一个问题，不仅因为这样的悬浮液将难以注射，而且因为由于凝胶干扰了替维瑞克肽的期望的持续作用从而损害了所述肽的生物利用度。
本发明的发明人此外还发现，由WO2003/022243的制造商提供的替维瑞克与抗衡离子TFA的摩尔比存在批次差异，即使所述批次应用的制造条件和方法是相同的。由于摩尔比对于获得期望的微晶悬浮液是至关重要的，因此所述比率的差异可影响药物制剂中替维瑞克的生物利用度。因此，医疗人员和其他用户能够信赖制造品提供的替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比是至关重要的。
关于WO2003/022243的替维瑞克组合物的另一个问题是所述组合物在例如冷藏和室温下储存期间不稳定，因此替维瑞克在这样的条件下保存期限较短。
冻干(冷冻干燥)是一种用于改善药物稳定性的广泛使用的方法，虽然WO2003/022243提到了替维瑞克的冷冻干燥和冻干，但该文献仅以一般方式提及该技术，例如“将材料冷冻干燥过夜”以及其它类似描述的一般陈述，但未公开替维瑞克-TFA冻干所需的具体要求。
替维瑞克-TFA在水中的溶解度很低，为了提供可以进行冻干过程的溶液，必须将替维瑞克-TFA溶解。然而，这只能在强酸、例如浓酸中完成。使用强酸作为溶剂不仅需要更多地关注冷冻干燥过程，而且还需要更低的温度来冷冻和浓缩溶剂，并且所述溶剂容易绕过冷凝器并最终导致损坏例如真空泵。因此，需要专门的冻干设备以防止设备损坏，增加了冻干过程的总成本。
此外，在冻干开始之前，仔细考虑样品中的所有非挥发性化合物非常重要，因为它们会与相关的活性成分(即，替维瑞克)一起浓缩。非挥发性的酸或碱可导致极端的pH值，而盐的存在可在将样品再溶解时产生非常高的离子强度。因此，至关重要的是，在冻干替维瑞克组合物时要特别小心，因为由此产生的冻干物可能最终包含残留酸，这将对预期用途具有不良影响。这给冻干过程增添了进一步的复杂性，因为为了确保重构的替维瑞克-TFA冻干物可以安全地施用于患者，例如通过皮下和/或肌内注射施用，除去冻干物中的所有溶剂是很重要的。
最后，替维瑞克-TFA溶液的粘度导致灭菌过滤器堵塞，也使得灭菌过程费力且昂贵。
因此，需要开发一种新的方法来制造具有长保存期限的稳定且无菌的替维瑞克-TFA冻干物。
发明内容
因此，本发明的第一方面要提供一种用于提供替维瑞克-TFA冻干物的简单有效的新型冻干方法，并且其中消除了使用强有机溶剂来溶解替维瑞克-TFA。
本发明的第二方面要提供一种冻干方法，其不需要过滤灭菌步骤来提供无菌的替维瑞克-TFA冻干物。
本发明的第三方面要提供一种替维瑞克-TFA冻干物，其具有比迄今所知的更高的替维瑞克-TFA浓度。
本发明的第四方面要提供一种替维瑞克-TFA冻干物，其可以容易地在水性重悬液中重悬，从而提供均匀的水性替维瑞克-TFA制剂。
本发明的第五方面要提供一种调节所述水性替维瑞克-TFA制剂中肽与抗衡离子的摩尔比的方法。
根据本发明，这些和其它方面是通过提供一种制备替维瑞克-TFA冻干物的冻干方法来实现的，所述方法包括以下步骤：
a)通过以足以提供微晶替维瑞克-TFA悬浮液而不形成凝胶的摩尔比混合替维瑞克和三氟乙酸根来提供冻干悬浮液，和
b)将所述冻干悬浮液冻干，从而提供替维瑞克-TFA冻干物。
使用本发明的冻干方法获得许多优点。首先，由于与溶解在溶剂中的替维瑞克-TFA浓度(约10mg/ml)相比，在微晶替维瑞克-TFA悬浮液中可以获得更高的替维瑞克-TFA浓度(约100mg/ml)，因此为了获得相同量的替维瑞克-TFA，需要的冻干体积明显更小。这确保了冻干步骤可以比常规冻干过程更快且更有成本效益。
其次，由于冻干的是微晶替维瑞克-TFA悬浮液，因此消除了使用强酸来溶解替维瑞克-TFA的需求。因此，本发明的冻干方法提供了以快速和简单的方式获得“纯”替维瑞克-TFA冻干物(即，在组合物中没有任何不希望的残留物)的可能性。
为了获得微晶替维瑞克-TFA悬浮液而不形成凝胶，本发明的发明人发现，替维瑞克与抗衡离子三氟乙酸根的摩尔比必须为至少1:2.1，因为摩尔比低于1:2.1将导致凝胶形成。当该摩尔比高于1:2.2时，微晶替维瑞克-TFA悬浮液也是均匀的。
在本发明的内容之内，术语“替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比”是指替维瑞克和三氟乙酸根之间的摩尔关系，其中所述摩尔比的第一个数字是组合物中替维瑞克的摩尔含量，第二个数字是指组合物中TFA的摩尔含量。例如，摩尔比为1:2.2意味着对于组合物中的每摩尔替维瑞克而言，所述组合物包含2.2mol TFA，而摩尔比为至少1:2.2意味着对于组合物中的每摩尔替维瑞克而言，所述组合物包含至少2.2摩尔三氟乙酸根(TFA)。
所得的替维瑞克-TFA冻干物可以储存并用水或其它合适的水溶液重构以制备水性替维瑞克-TFA制剂，所述制剂例如可以用作可注射的药物制剂。
然而，为了获得更稳定的替维瑞克-TFA冻干物，或能够根据预期用途提供特定的所述摩尔比，希望降低所述摩尔比，即，降低所述组合物中TFA的含量，因此步骤a)包括以下附加步骤：
a')将步骤a)的微晶替维瑞克-TFA悬浮液离心或过滤，从而提供替维瑞克-TFA沉淀团或替维瑞克-TFA滤饼，以及
a”)将所述替维瑞克-TFA沉淀团或所述替维瑞克-TFA滤饼悬浮在水性悬浮溶液中。
尽管所述冻干悬浮液可以不经离心步骤或过滤步骤而直接冻干，但优选将微晶替维瑞克-TFA悬浮液离心或过滤后获得替维瑞克-TFA沉淀团或替维瑞克-TFA滤饼进行悬浮并然后进行冻干步骤。
本发明的发明人发现，如果所述微晶替维瑞克-TFA悬浮液的摩尔比高于1:2.1(这是不会得到凝胶的摩尔比)，则离心后的沉淀团或滤饼中的摩尔比将降至1:1.70和1:1.85之间的摩尔比。例如，本发明人发现，当替维瑞克和三氟乙酸根以1:2.2的摩尔比和75mg/ml的肽浓度混合时，离心后的沉淀团具有约1:1.77的摩尔比。
因此，本发明的冻干方法的离心/过滤和悬浮步骤提供了以下优点：由此产生的替维瑞克-TFA冻干物将具有预定的摩尔比，该摩尔比低于微晶替维瑞克-TFA悬浮液的摩尔比，从而确保当重构所述冻干物时，可以将摩尔比调节到任何期望的摩尔比(高于初始摩尔比)。此外，由于所述冻干物的抗衡离子三氟乙酸根含量降低，因此所述冻干物中的pH值维持在一个确保减少可能的替维瑞克去酰胺化的值，从而增加了替维瑞克在储存期间的稳定性。
为了减少要进行冻干的体积，并同时确保所生成的冻干物中的高替维瑞克浓度，在一个实施方式中将微晶替维瑞克-TFA悬浮液在足以确保形成沉淀团的条件下离心。然后将沉淀团悬浮在相对少量的水性悬浮溶液中，然后将所悬浮沉淀团的悬浮液冻干。
然而，本发明的发明人发现，如果通过过滤所述微晶替维瑞克-TFA悬浮液获得替维瑞克-TFA滤饼(而不是离心所述悬浮液并提供替维瑞克-TFA沉淀团)，则水性替维瑞克和过量的TFA将通过过滤器，只有低摩尔比(即，摩尔比在1:1.70和1:1.85之间)的固体替维瑞克(微晶)将会收集在过滤器上。因此，使用过滤步骤来提供替维瑞克-TFA滤饼提供了基本上由微晶替维瑞克-TFA悬浮液的微晶组成的冻干产物，因此提供了改善的替维瑞克-TFA最终冻干物。
原则上可以使用任何类型的过滤技术来获得替维瑞克-TFA滤饼，然而优选使用采用合适的过滤器(例如，0.45至0.8μm膜过滤器)的压力或真空过滤技术，因为这样的过滤器既能够允许粘胶替维瑞克-TFA悬浮液通过，又能够有效阻挡微晶。
本发明人还发现，通过首先提供沉淀团或滤饼，然后将所述沉淀团或滤饼悬浮在水性悬浮溶液中，出乎意料地消除了使用强酸来溶解替维瑞克-TFA的需要。在一个优选的实施方式中，用于悬浮沉淀团或滤饼的水性悬浮溶液可以是水或甘露醇溶液，例如5％甘露醇溶液，因此，如果冻干物中留有少量的溶剂残留物，这不会影响冻干物用于药物制剂的能力。
不管所述微晶替维瑞克-TFA悬浮液是进行离心还是过滤步骤，优选在水(例如，生理用水)中或在三氟乙酸溶液中制备步骤a)中的微晶替维瑞克-TFA悬浮液。然而，如果替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比为至少1:2.2，则优选在水中制备所述替维瑞克-TFA悬浮液，如果所述摩尔比低于1:2.2，则优选在三氟乙酸溶液中制备所述悬浮液，以便将三氟乙酸添加到所述悬浮液中以获得至少1:2.2的摩尔比。
已经计算出三氟乙酸根和替维瑞克的摩尔质量：MTFA＝114g/mol以及MTev＝1459g/mol，并因此所述悬浮液中三氟乙酸根或替维瑞克的摩尔比和/或含量可通过以下公式计算：
为了确保替维瑞克-TFA冻干物中的高替维瑞克浓度，优选步骤a)的微晶替维瑞克-TFA悬浮液中的替维瑞克-TFA浓度为至少100mg/ml。如果此后将所述悬浮液离心，则高替维瑞克浓度还具有与上清液一起被丢弃的肽较少的优点。
冻干是本领域公知的方法，所述方法在本申请中不会详细讨论。然而，简而言之，将样本(即，冻干悬浮液，其可以是所述微晶替维瑞克-TFA悬浮液或所述悬浮的沉淀团或滤饼)转移到一个或多个玻璃容器中，并尽快冷冻，例如通过将容器的外部浸入液氮中或通过使用电动冷冻机。而且，可以任选旋转所述容器，以便样品在大的表面积上散开并冷冻。然后优选将带有样品的玻璃容器放入也包含冷却盘管的极低压空间(真空)中。所述冷却盘管充当冷凝器。盘管的温度通常低于-50℃。所述冷冻样品的挥发性化合物将在真空中蒸发(升华)。蒸发(在这种情况下为升华)过程吸收热量。这种效果使样品保持冷冻。蒸发的分子被冷却盘管从气相中捕获，在其上形成冻结层。在该过程结束时，替维瑞克-TFA以固体形式保留在容器中。由于该过程不会引起替维瑞克降解，因此本发明的冻干方法不仅可以用于浓缩替维瑞克，而且还可以用于保存所述肽以便长期储存。
鉴于本发明，本领域技术人员将理解，代替对步骤a)的冻干悬浮液进行冻干过程，在根据本发明的改进方法中也可以对所述悬浮液进行喷雾干燥过程或类似的干燥过程，以获得粉末和/或粉末状产物。
由于冻干是对在水或甘露醇中制成的冻干悬浮液进行的，因此所述悬浮液不包含任何有害的非挥发性化合物，例如可能能够导致极端pH值的非挥发性酸、以及可能导致非常高的离子强度的盐。因此，所生成的冻干物不会含有任何不希望的化合物，并且重悬的水性替维瑞克-TFA悬浮液可以安全地施用于需要这样的治疗的患者。
在大多数常规冻干中，首先将要冷冻干燥的溶液无菌过滤，以除去任何无关的固体和微生物。然而，由于替维瑞克-TFA溶液的粘度导致灭菌过滤器堵塞，这样的灭菌步骤既费力且昂贵。本发明的发明人发现，通过本发明的方法获得的替维瑞克-TFA冻干物可以进行γ射线灭菌，从而消除了对过滤灭菌的需求。此外，也消除了在无菌条件下(例如，在洁净室中)工作的需求。
正常情况下，冻干物以基本干燥的状态储存以维持组合物的稳定性。然而，本发明的发明人发现，如果在本发明的替维瑞克-TFA冻干物中存在少量的水(即，基于替维瑞克-TFA冻干物的总重量在0.3至5重量％之间、优选约1至2重量％的量)，提供了改善的替维瑞克-TFA冻干物，其易于处理、重构和相应地使用。
不受理论的束缚，水含量可以在替维瑞克粒子之间提供高静电力，这在处理所述替维瑞克-TFA冻干物时具有重要性，例如如果要将所述冻干物填充到小瓶或注射器腔中的话。
在一个优选的实施方式中，基于替维瑞克-TFA冻干物的总重量，水在所述替维瑞克-TFA冻干物中的存在量为1重量％和2重量％之间，优选1.5重量％，因为这将提供保留其化学完整性并提供稳定组合物的替维瑞克-TFA冻干物。
本发明提供的稳定性允许更长的在室温下的保存期限，使得所述替维瑞克-TFA冻干物可以在例如灭菌后储存。可以将所述可重构的替维瑞克-TFA冻干物包装和储存(例如在注射器或小瓶中)供以后使用。
由于替维瑞克干燥粒子之间的静电力，可能难以将所述替维瑞克-TFA冻干物转移到小瓶、容器或注射器腔中，因为所述粒子会粘附于设备表面等。因此，优选在将所述悬浮的沉淀团或悬浮的滤饼进行冻干(即，干燥)之前，将所述悬浮的沉淀团/滤饼(即，其处于水性状态时)放入或以其它方式转移到小瓶或容器中，所述悬浮的沉淀团或悬浮的滤饼可以在其中进行冻干。进一步优选所述小瓶或容器也可以用于储存由此产生的替维瑞克-TFA冻干物。
在一个优选的实施方式中，所述小瓶或容器在冻干后将包含单位剂量的所述替维瑞克-TFA冻干物。在本发明的上下文内，术语“单位剂量”是在单剂量中施用于患者的替维瑞克的量。
本发明还涉及一种重构所述替维瑞克-TFA冻干物的方法，其中所述方法包括向所述替维瑞克-TFA冻干物添加水性重构溶液，并通过添加三氟乙酸根来调节替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比。所述方法将有效且简单地获得精确且期望的摩尔比，以获得流体乳状微晶替维瑞克-TFA水性悬浮液，而不形成凝胶。优选通过添加足量的三氟乙酸根将重构后的替维瑞克与TFA的摩尔比调节到至少1:2.1，优选至少1:2.2，并更加优选至少1:2.4，因为这将提供可直接使用的水性药物制剂(即，所述制剂是即用的)。
三氟乙酸根含量可以在所述冻干物重构之后添加/调节，但在一个优选的实施方式中，三氟乙酸根是水性重构溶液的一部分，因为这将确保以快速且有效的方式重构本发明的替维瑞克-TFA冻干物。如果需要，所述水性重构溶液可含有等渗剂，例如甘露醇和/或可药用的赋形剂。
本领域技术人员可以容易地计算出要添加的三氟乙酸根的正确量。例如，如果所述替维瑞克-TFA冻干物的摩尔比为1:1.77，并且如果期望最终的替维瑞克-TFA水性制剂中的摩尔比为1:2.2，则在重构过程期间所述组合物中存在的每摩尔替维瑞克必须添加0.43mol TFA。
本发明的发明人此外还发现，当在最终的水性药物制剂中替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比为至少1:2.1时，所述制剂将包含可溶性和不溶性替维瑞克二者，从而提供独特的替维瑞克生物利用度。
不受理论的束缚，所述可溶性替维瑞克为水溶液形式，在一些情况下为凝胶形式。凝胶的存在将抑制任何自由的水性替维瑞克，因此防止或至少减少了立即释放。所述不溶性替维瑞克为微晶形式。所述微晶将防止凝胶形成，因此“解锁”所述水性替维瑞克。随着时间流逝，本发明的组合物中的TFA将被身体吸收，使比率降低，使得微晶随后转变成凝胶，形成了缓慢释放的贮库。因而，所述非凝胶可溶性替维瑞克是立即可用的，提供了作用的几乎立即起效，而所述凝胶可溶性和不溶性替维瑞克(微晶)将有助于提供替维瑞克的持续释放。
因此，使用本发明的替维瑞克-TFA冻干物，可以简单地通过调节添加到所述替维瑞克-TFA冻干物中的三氟乙酸根的量来改变所述注射制剂中不溶性与可溶性替维瑞克的比率，从而调节替维瑞克的释放曲线。
由于替维瑞克在与酸接触时去酰胺化，因此在储存期间会在组合物/制剂内出现不希望的降解产物(杂质)。所述杂质可影响替维瑞克组合物/制剂的质量、安全性和功效，从而潜在地引起严重的健康危害。
本发明的发明人已经发现，当替维瑞克与TFA的摩尔比等于或低于1:2.8时(即，当TFA的摩尔含量等于或低于2.8/摩尔替维瑞克时)，杂质水平保持在可接受的水平。因此，本发明的替维瑞克-TFA冻干物中的最佳摩尔比优选在1:2.2(或1:2.4)和1:2.8之间。
在一个优选的实施方式中，本发明还涉及一种药盒，其包含填充有单位剂量的替维瑞克的第一包装和填充有重构溶液的第二包装，所述重构溶液包含足够量的TFA以获得至少1:2.1、优选至少1:2.2并更加优选约为或高于1:2.4的期望摩尔比，任选摩尔比等于或低于1:2.8。所述第一包装可以例如是注射器，并且所述第二包装可以与所述注射器物理连接，以确保获得正确的替维瑞克与TFA摩尔比。作为彼此物理连接的第一和第二包装的一个例子，可以提及用于冻干产品的常规双腔注射器。这样的双腔注射器是本领域公知的。
在一个实施方式中，所述药盒被布置用于提供最终流体乳状微晶替维瑞克-TFA水性悬浮液，所述悬浮液的替维瑞克与抗衡离子的摩尔比为至少1:2.1，优选至少1:2.2，并更加优选大约或高于1:2.4，并任选等于或低于1:2.8。优选替维瑞克的浓度在30mg/ml和约100mg/ml之间，更加优选在45mg/ml和90mg/ml之间，例如约75mg/ml。在一些情况下，替维瑞克的浓度可以高于约100mg/ml。体积可以在0.4ml和1.6ml之间，例如约1.2ml。已证明以该浓度和体积皮下和/或肌内注射只产生轻微的注射部位反应。
本发明中提供的冻干物和制剂制造起来便宜，并且由于容易使用，它们提供了非常简单的剂量方案。
具体实施方式
实施例：
为了确定替维瑞克与抗衡离子三氟乙酸根的摩尔比的影响，进行了许多测试。
实施例1：具有不同摩尔比的替维瑞克-TFA组合物的制备
获得定制批次的具有低TFA含量的替维瑞克，批次A。该批次的特性示于表1。
表1
| 纯度 | 99.3％ |
| 替维瑞克含量 | 85.56重量％ |
| TFA含量 | 10.9重量％ |
| 乙酸根含量 | 0.3重量％ |
| 水含量 | 4.3重量％ |
如果需要含有75mg替维瑞克的组合物A，则必须使用88.28mg的批次A，计算如下：
然后可以计算出组合物A中替维瑞克与TFA的摩尔比。
88.28mg批次A中的TFA含量可计算为：
88.28mg x 10.9/100(TFA的％含量)＝9.62mg。
由于TFA的摩尔质量(MTFA)为114g/mol，并且替维瑞克的摩尔质量(MTEV)为1459g/mol，可以计算出75mg替维瑞克组合物中TFA的摩尔浓度为0.084mmol，而替维瑞克的摩尔浓度为0.051mmol。因此，组合物A中替维瑞克与TFA的摩尔比为1:1.64。
为了制备具有不同摩尔比的许多不同的替维瑞克-TFA水性组合物，将21个含有44.14mg+5％(41.93至46.35mg)组合物A的样品精确称重到2ml带盖玻璃试管中，可借助微量移液器通过所述盖子添加水溶液。
使用从比利时Geel的Acros Organics获得的TFA组合物制备7种在5％甘露醇中含有TFA的TFA溶液。所述TFA组合物的纯度为99％，密度为1.535g/ml。相应的溶液示于表2。
表2
使用微量移液器通过二十一个含有44.14mg+5％(41.93至46.35mg)组合物A的玻璃试管的盖子添加0.5ml各上述溶液，来制备相应的替维瑞克-TFA水性组合物，即制备三个具有相同摩尔比的替维瑞克-TFA水性组合物。使用涡旋将所述混合物搅拌1分钟，并目视观察所述溶液10分钟，以确定是否获得了期望的流体乳状微晶替维瑞克-TFA均匀水性悬浮液，或者是否形成了凝胶。结果总结在下表3中：
表3
| 试管 | 摩尔比 | 凝胶形成 | 微晶形成 | 乳状悬浮液形成 | 均匀悬浮液 |
| A1，A2，A3 | 1:1.64 | 是 | 否 | 否 | - |
| B1，B2，B3 | 1:1.85 | 是 | 否 | 否 | - |
| C1，C2，C3 | 1:2.1 | 否 | 是 | 是 | 否 |
| D1，D2，D3 | 1:2.36 | 否 | 是 | 是 | 是 |
| E1，E2，E3 | 1:2.61 | 否 | 是 | 是 | 是 |
| F1，F2，F3 | 1:2.86 | 否 | 是 | 是 | 是 |
| G1，G2，G3 | 1:3.12 | 否 | 是 | 是 | 是 |
在法国Realux供应的偏光显微镜下进一步观察了1号试管中替维瑞克-TFA水性组合物的微晶含量。相应的摩尔比的结果示于图1a-图1g中。从这些观察结果清楚看出，在摩尔比为1:1.85及以下时，未观察到微晶形成，因此，为了引发期望的微晶形成，替维瑞克与抗衡离子TFA的摩尔比必须高于至少1:2.1。
此外，从表3明显看出，直到摩尔比高于1:2.1才得到替维瑞克-TFA的均匀悬浮液，因此，相应地优选在用于提供所述冻干悬浮液的微晶替维瑞克-TFA悬浮液、以及重构的替维瑞克-TFA水性悬浮液二者中的摩尔比均高于1:2.1并优选更高，例如至少1:2.2，并更加优选至少1:2.4。
实施例2：可溶性替维瑞克和不溶性替维瑞克的含量与摩尔比的关系
为了确定相应的试管中可溶性替维瑞克相对于不溶性替维瑞克的含量，将各摩尔比的2号和3号试管以10,000rpm离心10至20分钟，并使用HPLC分析来测量上清液和沉淀团中的替维瑞克浓度。
HPLC分析的色谱条件示于表4。
表4
通过称量59.9mg替维瑞克乙酸盐(批次080113)到容量瓶中，并用水:乙腈65:35v/v将体积补足至100ml，制备两个100％标准。用相同的溶剂将10ml的该溶液补足至50ml，提供浓度为0.1mg/ml的替维瑞克肽。
通过用相同的溶剂将2ml的100％标准稀释至200ml来提供0.001mg/ml替维瑞克肽的浓度，制备1％标准溶液。
使用所述两个100％标准进行内部标准化。所述1％标准用于检查响应的线性。用100％标准的回收率必须在95％-105％的区间内。
将离心后得到的沉淀团溶解在65:35v/v的水:乙腈中，并用相同的溶剂将体积补足至100mL。将该溶液稀释5倍(10mL加入50mL中)，并进行HPLC。
将上清液转移至容量瓶中，并用相同的溶剂(即，水:乙腈65:35v/v)将体积补足至100mL。将该溶液稀释5倍(10mL加入50mL中)，并进行HPLC。HPLC分析的结果示于表5。
表5
计算各摩尔比的平均浓度，见表6，结果在图2和图3中描绘。
表6
从表5和6以及图2和图3明显看出，当三氟乙酸根的量相对于替维瑞克增加时，不溶性替维瑞克的程度增加，因此在1:2.1的摩尔比下，药物制剂的约50％由不溶性替维瑞克组成，而在药物制剂中，在1:2.36(～1:2.4)的摩尔比下，不溶性替维瑞克的量为约82％。
实施例3：血浆浓度与摩尔比的关系
为了评估摩尔比对替维瑞克血浆浓度的相关性，如实施例1中所述制备了五个含有不同摩尔比的玻璃小瓶，提供了包含表7中所示的替维瑞克-TFA水性组合物的试管：
表7
| 试管 | I | II | III | IV | V |
| 摩尔比 | 1:1.64 | 1:2.1 | 1:2.36 | 1:2.61 | 1:2.86 |
每个摩尔比测试五只大鼠。使用25mm 21G luer 6％常规斜角针(可从比利时Leuven的Terumo获得)和100μl luer滑动注射器(可从美国Reno的Hamilton公司获得)向每只大鼠注射60μl相应的溶液。在施用前、然后在施用后1小时、6小时、24小时、48小时、7天、10天、14天、21天和28天测量血浆浓度。
注射到每只个体大鼠中之后替维瑞克的峰值血浆浓度(Cmax)示于表8，并在图4中描绘。
表8
从这些结果清楚地看出，直至摩尔比为1:2.1之前，替维瑞克的Cmax增加，此后血浆浓度基本稳定。
还通过定期采集血样来测量四周期间内的血浆浓度。
图5显示了四周期间的平均血浆水平，显然，替维瑞克的释放曲线取决于摩尔比。例如，摩尔比为1:2.1的悬浮液显示出较高的替维瑞克血浆浓度。因此，可以简单地通过调节在重构期间添加到替维瑞克-TFX冻干物中的三氟乙酸根的量、从而改变药物制剂中的替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比，来调节替维瑞克的释放曲线。
在临床上，这提供了针对例如关于不同的适应症、年龄和/或性别的各个患者群的需求来优化治疗的潜力。一个患者群可能需要作用的立即起效，则需要高浓度的可溶性替维瑞克，而另一个患者群可能需要替维瑞克的持续释放，则需要低浓度的可溶性替维瑞克。以类似的方式，可以在患者治疗的不同阶段施用具有不同摩尔比的不同药物制剂。此外，针对不同患者群的具体需要来调节摩尔比的可能性将会增加患者的治疗接受性和依从性。
实施例4：替维瑞克的稳定性与摩尔比的关系
为了确定替维瑞克与抗衡离子三氟乙酸根的摩尔比对替维瑞克稳定性的影响，进行了以下测试。
以两种浓度：10mg/mL(按碱替维瑞克表示)和1mg/mL(按碱替维瑞克表示)，制备替维瑞克与TFA不同摩尔比(低：1:1.7；中范围：1:2.16；高：1:2.8；极高：1:4.0)的四个批次替维瑞克TFA溶液。
获得作为干粉提供的可重构替维瑞克TFA组合物。所述批次的特性示于表9：
表9
| 替维瑞克含量 | 79.8％ |
| TFA含量 | 13.5％ |
| 水含量 | 3.1％ |
起始材料的摩尔比使用以下计算来确定：
如下制备八个批次，10mg/ml的四个摩尔比各一个，1mg/ml的四个摩尔比各一个。
10mg/mL时的低摩尔比(1:1.7)
1.将0.312g的替维瑞克TFA(替维瑞克净重)用注射用水重构，使该悬浮液达到3.0mL以形成104mg/mL的均匀乳状悬浮液。以前的研究证明，在该浓度下，96％的替维瑞克将形成固体替维瑞克，因此，离心后大约300mg的替维瑞克将作为固体替维瑞克回收。
2.将该制备物立即在4℃下以10,000rpm(8,500g)离心10分钟。
3.弃去离心材料的上清液。以前的研究证明，该固体替维瑞克具有大约1:1.7的替维瑞克与TFA摩尔比。
4.将离心沉淀团用注射用水重悬，并补足到30mL，以形成约10mg/mL并且摩尔比为约1:1.7的溶液。
10mg/mL时的中摩尔范围比(1:2.16)
1.将0.1g替维瑞克TFA(替维瑞克净重)在10mL锥形瓶中用注射用水重构，制成10.0mL体积的溶液以形成替维瑞克为10mg/mL并且替维瑞克与TFA的摩尔比为1:2.16的溶液。
10mg/mL时的高摩尔比(1:2.8)
1.将0.1g替维瑞克TFA(替维瑞克净重)在10mL锥形瓶中用5mL的含0.0097M三氟乙酸的注射用水重构。
2.将该溶液用注射用水补足到10.0mL以形成替维瑞克为10mg/mL并且替维瑞克与TFA的摩尔比为1:2.8的溶液。
10mg/mL时的极高摩尔比(1:4.0)
1.将0.1g替维瑞克TFA(替维瑞克净重)在10mL锥形瓶中用5mL的含0.0252M三氟乙酸的注射用水重构。
2.将该溶液用注射用水补足到10.0mL以形成替维瑞克为10mg/mL并且替维瑞克与TFA的摩尔比为1:4.0的溶液。
1mg/mL时的低摩尔比(1:1.7)
1.将0.312g的替维瑞克TFA(替维瑞克净重)用注射用水重构，使该悬浮液达到3.0mL以形成104mg/mL的均匀乳状悬浮液。
2.将该制备物立即在4℃下以10,000rpm(8,500g)离心10分钟。
3.弃去离心材料的上清液。
3.将离心沉淀团在注射用水中重悬(终体积300mL)，以制成约1mg/mL并且替维瑞克与TFA的摩尔比为约1:1.7的溶液。
4.将10.0mL转移到10mL锥形瓶中。
1mg/mL时的中摩尔范围比(1:2.16)
1.制备替维瑞克TFA在注射用水中的1mg/mL溶液。
1mg/mL时的高摩尔比(1:2.8)
1.将0.010g替维瑞克TFA(替维瑞克净重)在10mL锥形瓶中用5mL的0.001M在注射用水中的三氟乙酸重构
2.用注射用水将体积补足至10mL
1mg/mL时的极高摩尔比(1:4.0)
1.将0.010g替维瑞克TFA(替维瑞克净重)在10mL锥形瓶中用5mL的含0.0205M三氟乙酸的注射用水重构。
2.用注射用水将体积补足至10mL。
在分析替维瑞克纯度之前，所有溶液均保持在实验室温度(20℃)下。
从每个溶液中一式两份取样品，并使用常规RP-HPLC方法分析替维瑞克纯度。色谱条件如表10所示：
表10
制备后(即，零时间)，溶液中的替维瑞克纯度示于表11：
表11
为了评价随时间的稳定性，然后将相应的溶液在有塞子的玻璃锥
形瓶中储存在+40℃和相对湿度75％的舱室中。
在所述10mg/mL溶液的一个月后，和所述1mg/mL溶液的两周后，使用已描述的方法重复替维瑞克纯度分析。下表12显现了所述溶液在相关时间段后的纯度。
表12
稳定性结果示于图6和图7中，并根据悬浮液的摩尔比描绘了储存期间杂质百分比的增加。要注意，所述图显示了每一摩尔替维瑞克的TFA摩尔含量。
从所述图中明显看出，溶液中较高浓度的三氟乙酸根提供了明显较高的杂质浓度，因此结果证实，当替维瑞克与浓度渐增的酸(三氟乙酸根)接触时，将少量出现不希望的降解产物(杂质)，并可潜在影响制剂的质量、安全性和功效，从而潜在地引起严重的健康危害。因此，为了获得稳定的替维瑞克-TFA冻干物，重要的是提供具有低三氟乙酸根浓度/含量的组合物，即对于每摩尔替维瑞克而言，三氟乙酸根的摩尔含量应保持尽可能低。
从图6和图7可以看出，当悬浮液中替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比低于1:2.8(即，1mol替维瑞克比少于或等于2.8mol TFA)时，杂质(即，不希望的降解产物，由例如去酰胺化产生)的水平保持在可接受的水平。
从所述图还清楚看出，替维瑞克的浓度也与杂质水平有关。然而，为了减少注射量，关系到使悬浮液包含的替维瑞克浓度为至少10mg/ml，优选至少30mg/ml，因此实际上不可能简单降低最终的流体乳状水性悬浮液中的替维瑞克浓度。然而，该因素使冻干物中酸(三氟乙酸根)的含量在储存期间更加重要，因为低水平的酸将提供更稳定的产品。
本发明提供的组合物和制剂制造起来便宜，并且由于容易使用，它们还提供了非常简单的剂量方案。
在本发明的范围内，可以预见上述原理和组合的修改和组合。
Claims (12)
1.一种制备替维瑞克-TFA冻干物的冻干方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过以足以提供微晶替维瑞克-TFA悬浮液而不形成凝胶的替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比混合替维瑞克和三氟乙酸根来提供冻干悬浮液，并且其中所述冻干悬浮液包含每摩尔替维瑞克至少2.1摩尔的三氟乙酸根，
b)将得自步骤a)的冻干悬浮液冻干，从而提供替维瑞克-TFA冻干物，所述冻干物具有的每摩尔替维瑞克的三氟乙酸根摩尔含量低于所述冻干悬浮液中每摩尔替维瑞克的三氟乙酸根摩尔含量；
特征在于，所述步骤a)还包括以下步骤：
a') 将所述微晶替维瑞克-TFA悬浮液离心或过滤，从而分别提供具有1:1.70到1:1.85的每摩尔替维瑞克的三氟乙酸根的摩尔含量的替维瑞克-TFA沉淀团或替维瑞克-TFA滤饼，以及
a'')将所述替维瑞克-TFA沉淀团或所述替维瑞克-TFA滤饼悬浮在水性悬浮溶液中。
2.根据权利要求1所述的冻干方法，其中在步骤a中)将替维瑞克和三氟乙酸根以至少1:2.2的摩尔比混合，使得对于所述冻干悬浮液中每摩尔替维瑞克而言，所述冻干悬浮液包含至少2.2摩尔的三氟乙酸根。
3.根据权利要求1或2所述的冻干方法，其中所述水性悬浮溶液是水或甘露醇溶液。
4.根据权利要求1或2所述的冻干方法，其中如果替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比为至少1:2.2，则在水中制备所述微晶替维瑞克-TFA悬浮液，使得对于所述冻干悬浮液中每摩尔替维瑞克而言，所述冻干悬浮液包含至少2.2摩尔的三氟乙酸根。
5.根据权利要求1或2所述的冻干方法，其中得自步骤b)的替维瑞克-TFA冻干物通过γ射线灭菌进行灭菌。
6. 根据权利要求1或2所述的冻干方法，其中在所述微晶替维瑞克-TFA悬浮液中的替维瑞克-TFA浓度为至少100 mg/ml。
7.根据权利要求1或2所述的冻干方法，其中重悬的沉淀团或重悬的滤饼被冻干或喷雾干燥至一定程度，使得基于所获得的替维瑞克-TFA冻干物的总重量，所述替维瑞克-TFA冻干物包含在0.3重量%至5重量%之间的量的水。
8.根据权利要求1或2所述的冻干方法，其中所述冻干以所述替维瑞克-TFA冻干物的单位剂量进行和/或直接在用于储存的包装中进行。
9. 一种重构通过权利要求1至8中任一项所述方法获得的替维瑞克-TFA冻干物的方法，其中所述方法包括向所述替维瑞克-TFA冻干物添加水性重构溶液，并且其中所述方法还包括通过添加三氟乙酸根来调节所述摩尔比，使得对于所述冻干悬浮液中每摩尔替维瑞克而言，所述冻干悬浮液包含至少 2.1摩尔的三氟乙酸根。
10.根据权利要求9所述的方法，其中将替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比调节到至少1:2.2，使得对于所述冻干悬浮液中每摩尔替维瑞克而言，所述冻干悬浮液包含至少2.2摩尔的三氟乙酸根。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比调节到至少1:2.4，使得对于所述冻干悬浮液中每摩尔替维瑞克而言，所述冻干悬浮液包含至少2.4摩尔的三氟乙酸根。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中将所述替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比调节到等于或低于1:2.8，使得对于所述冻干悬浮液中每摩尔替维瑞克而言，所述冻干悬浮液包含等于或低于2.8摩尔的三氟乙酸根。
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