CN112414987A - 一种应用光谱检测的荧光成像装置及测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及应用光谱检测的荧光成像装置及测试方法,该成像装置包括成像部和光谱检测部,成像部向其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本发射可见光和近红外光,并将其转换为可见光图像和近红外光图像,并选择荧光亮度最高的区域作为基准区域,选择荧光亮度弱于该基准区域一定程度的区域作为待测区域,采用光谱检测部的近红外激发光照射该待测区域,并采用光谱仪检测该待测区域发射的荧光的峰值波长,从而对比荧光亮度最高区域的峰值波长和该待测区域的峰值波长,确定其特异性靶向荧光蛋白的边界区域。该荧光成像装置引入了光谱仪,利用特异性靶向荧光蛋白的特性,实现了光谱仪对峰值波长的精确测量来区分特异性靶向荧光蛋白的位置和边界区域。
Description
技术领域
本发明涉及成像领域,特别涉及一种应用光谱检测的荧光成像装置及测试方法。
背景技术
光学分子成像方法应用到内窥镜成像中,其通过注射特异性靶向蛋白荧光试剂,并使用白光和激发光两种光源照射样本区域,同时获得成像区域的清晰彩色图像和反应特异性靶向蛋白的荧光图像。该方法能够在肿瘤细胞分子层面对特异性靶向蛋白荧光组织进行在体成像,具有低成本、高通量、非侵入、非接触、非电离辐射、高灵敏度、高特异性等优势。但是由于某些特异性靶向蛋白的部位不易被发现或在较深的组织中,其位置和边界难以精准的确定。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题,本发明的首要目的是提供一种应用光谱检测的荧光成像装置及测试方法。该成像装置包括成像部和光谱检测部,成像部向其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本发射可见光和近红外光,并将该标本反射的可见光和发射的荧光转换为可见光图像和近红外光图像;根据该可见光图像和近红外光图像选择荧光亮度最高的区域作为基准区域,选择荧光亮度弱于该基准区域一定程度的区域作为待测区域,采用光谱检测部的近红外激发光照射该待测区域,并采用光谱仪检测该待测区域发射的荧光的峰值波长,从而对比荧光亮度最高区域的峰值波长和该待测区域的峰值波长,确定其特异性靶向荧光蛋白的边界区域。该荧光成像装置引入了光谱仪,利用特异性靶向荧光蛋白的特性,实现了光谱仪对峰值波长的精确测量来区分特异性靶向荧光蛋白的位置和边界区域。
基于此,本发明至少提供如下技术方案:
一种应用光谱检测的荧光成像装置,包括:
成像部,包含可见光光源、第一近红外激发光源和双图像传感器;
光谱检测部,包含第二近红外激发光源和光谱仪;
其中,所述可见光源向其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本发射可见光,该标本反射可见光;所述第一近红外激发光源向其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本发射近红外激发光,所述激发光激发所述具有特异性靶向荧光蛋白的标本,从所述特异性靶向荧光蛋白处发射荧光;所述反射的可见光和所述发射的荧光传输至所述双图像传感器,所述双图像传感器将所述发射的荧光转换为第一图像,将所述反射的可见光转换为第二图像;
所述第二近红外激发光源向其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本发射近红外激发光,所述激发光激发所述具有特异性靶向荧光蛋白的标本,从所述特异性靶向荧光蛋白处发射荧光,所述光谱仪检测该发射荧光的峰值波长。
进一步地,所述成像部还包括陷波滤光器,所述反射的可见光和所述发射的荧光在传输至所述双图像传感器之前经过所述陷波滤光器。
进一步地,所述双图像传感器还设置有可见光带通滤光片和近红外带通滤光片。
进一步地,所述成像部还包括第一光路通道,所述反射的可见光和所述发射的荧光沿所述第一光路通道传输至所述陷波滤光器。
进一步地,所述光谱检测部还包括第二光路通道,所述发射的荧光沿所述第二光路通道传输至所述光谱仪。
进一步地,所述光谱检测部还包括一光环行器,所述第二光路通道、所述第二近红外激发光源以及所述光谱仪分别连接至所述光环行器。
进一步地,所述第二光路通道优选光纤。
本发明还提供一种应用光谱检测的荧光成像测试方法,其包括:
使用适用于向其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本发射近红外激发光的激发光源来产生激发光,其中所述激发光激发所述具有特异性靶向荧光蛋白的标本,从所述特异性靶向荧光蛋白处发射荧光;
同时提供可见光光源投射所述其中具有特异性荧光蛋白的标本,该标本反射可见光;
收集所述发射的荧光,将其转换为第一图像信息,以及收集所述反射的可见光,将其转换为第二图像信息;
根据所述第一和第二图像信息,选择荧光亮度最高的区域作为基准区域,收集该基准区域反射的荧光,将其转换为光谱信息,获得该基准区域的荧光光谱峰值波长,以该峰值波长作为基准峰值波长;
以所述基准区域的荧光亮度为参照,选择荧光亮度低于该基准区域一定范围的区域作为待测区域;
使用所述激发光源照射所述待测区域,收集该待测区域的荧光,将其转换为光谱信息,判断该光谱信息中的荧光光谱峰值波长,以初始偏离所述基准峰值波长的区域作为特异性荧光蛋白的真实边界区域。
进一步地,所述选择荧光亮度低于该基准区域一定范围是指选择荧光亮度低于该基准区域的10%~30%。
进一步地,所述选择荧光亮度低于该基准区域一定范围是指选择荧光亮度低于该基准区域的10%~20%。
附图说明
图1是本发明一实施例的应用光谱检测的荧光成像原理示意图。
图2是本发明一实施例的光环行器结构示意图。
图3是本发明一实施例中一样本的可见光图像、近红外光图像以及边界区域图像。
具体实施方式
接下来将结合本发明的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它实施例,均属于本发明保护的范围。
下面来对本发明做进一步详细的说明。一实施例中,参照图1,应用光谱检测的荧光成像装置10包括,成像部20和光谱检测部40,成像部20包含成像光源22和双图像传感器24,成像光源22包含可见光源和第一近红外激发光源。可见光源例如是白光光源。白光光源照射其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本,该标本反射可见光。第一近红外激发光源发射近红外激发光,该近红外激发光照射至具有特异性靶向荧光蛋白的标本上,激发该特异性靶向荧光蛋白发射荧光。在另一实施例中,成像光源22也可以选用集成有白光LED与近红外LED的一体式照明光源。
双图像传感器24用于将接收的可见光转换成可见光图像,将荧光转换成荧光图像。双图像传感器24包含例如是彩色CCD 24a和近红外CCD 24b,用于可见光图像和荧光图像的转换。
反射光和发射的荧光传输至双图像传感器24之前,先传输经过陷波滤波器26,陷波滤波器26阻挡近红外激发光,允许可见光和荧光通过。在一实施例中,陷波滤光器26的陷波中心优选785nm,陷波波段宽度优选20~30nm。通过陷波滤波器26的可见光和荧光传输至双图像传感器24中,经分光镜将光线分为两部分,一部分通过可见光带通滤光片28a进入可见光图像传感器如彩色CCD24a,彩色CCD 24a将可见光转换为彩色图像。另一部分通过近红外带通滤光片28b进入近红外CCD 24b,近红外CCD 24b将荧光转换为近红外图像。在一实施例中,可见光带通滤光片28a的通带范围优选为450~650nm,近红外带通滤光片28b的通带范围优选为700~1000nm。
反射的可见光和发射的荧光经第一光路通道传输至双图像传感器24。在一实施例中,光路通道选用一内窥镜引导可见光和荧光传输至双图像传感器24。
光谱检测部40包含近第二近红外激发光源42和光谱仪46。第二近红外激发光源42向其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本发射近红外激发光,近红外激发光激发该具有特异性靶向荧光蛋白发射荧光,发射的荧光传输至光谱仪46,光谱仪检测该发射荧光的峰值波长。根据该特异性靶向荧光蛋白的发光光谱,第二近红外激发光源42的波长范围较第一近红外激发光源22b的范围窄,提高被激发荧光的强度,增加光谱信号的信噪比。
光谱检测部40还包括一第二光路通道和一光环行器。第二光路通道通过光环行器与第二近红外激发光源42和光谱仪46连接。如图2,光环行器44有三个端口a、b、c,端口a连接第二近红外激发光源42,端口b连接第二光路通道,端口c连接光谱仪46。第二近红外激发光源42发射近红外激发光,经光环行器44进入第二光路通道传输至具有特异性靶向荧光蛋白的样本区域,激发出的荧光沿第二光路通道传输经光环行器44传输至光谱仪46,光谱仪46将该荧光信号转换为波长信号,输出峰值波长。在一实施例中,第二光路通道优选光纤。
该荧光成像装置10特别适用于其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本,特异性靶向荧光蛋白是指荧光试剂具有靶向性,该靶向性能够使得该荧光试剂与标本中的蛋白质特异性结合,在激发光的激发下,与靶向蛋白相结合的样本部位发射荧光激发带,从而能够区分样本中该特异性蛋白质的部位,荧光激发带的主波长不同于激光光源的波长。接下来以PEG-RGD@ICG纳米靶向荧光探针为例,来进一步介绍该荧光成像装置的测试方法。PEG-RGD@ICG纳米靶向荧光探针是现有的一种具有靶向性的荧光显影剂,其具体是纳米材料聚乙二醇(nPEG),脂质体PEG连接RGD靶向分子然后包裹吲哚菁绿(ICG)荧光显影剂。该荧光显影剂被注射进例如是患有肿瘤的小白鼠体内,PEG-RGD@ICG发挥纳米探针被动靶向作用,到达肿瘤组织。RGD负责与肿瘤组织上高表达的整合素(Integrin)特异性结合,在激发光源的照射下,肿瘤组织发射比正常组织强烈的荧光,从而使得肿瘤组织被标记。另外ICG发出的荧光,该荧光光谱的确切形状和光谱的峰值波长取决于ICG分子的化学环境和物理条件,如温度和ICG的浓度等。根据亮度最高处的靶向性特异荧光蛋白的峰值波长,检测荧光亮度较弱区域的峰值波长,如果峰值波长偏离该最亮区域的峰值波长,即可认为该亮度较弱的区域不属于该靶向性特异荧光蛋白区域,即不属于肿瘤区域。依据此可判断该靶向性特异荧光蛋白的形状边界。
在一实施例中,使用适用于激发该PEG-RGD@ICG显影剂的激发光源,例如波长为780~800nm的激光器照射该标本,该标本中PEG-RGD@ICG显影剂已经与肿瘤组织结合。同时采用白光光源照射该标本,该标本中的显影剂在激发光的激发下发射荧光,同时该标本反射白光,发射的荧光和反射的白光经内窥镜传输经过陷波滤光器26阻挡近红外激发光后,分别传输经过带通滤光片28a和带通滤光片28b后,传输至彩色CCD 24a和近红外CCD 24b,分别将反射的可见光转换为彩色图像,如图3中的b图,将发射的荧光转换为近红外光图像,即荧光图像,如图3中的a图。d图是可见光彩色图像和近红外光图像合成后的图像,以方便观察。
在该标本的另外一个角度,第二红外激发光源42例如是波长为785nm的红外激发光照射该标本,该标本在激发光的激发下发射荧光。根据上述彩色图像和荧光图像,选择荧光亮度最高的区域作为基准区域,收集该基准区域反射的荧光,将其转换为光谱信息,获得该基准区域的荧光光谱峰值波长,如该峰值波长为810-815nm,以该峰值波长为基准峰值波长。以该基准区域的荧光亮度为参照,选择荧光亮度低于该基准区域亮度的10~30%的区域作为待测区域,在一优选实施例中,选择荧光亮度低于该基准区域10~20%的区域作为待测区域。使用785nm的红外激发光照射该待测区域,收集该待测区域发射的荧光,该荧光传输至光谱仪46,光谱仪46将该荧光转换为光谱信息,判断该光谱信息中的荧光光谱峰值波长,若该区域的荧光光谱峰值波长等于或接近于基准峰值波长(偏差为2nm左右),则该区域依然为特异性荧光蛋白的真实区域。若该区域的荧光光谱峰值波长和基准峰值波长超过2nm,且该区域是初始偏离基准峰值波长的区域,所谓初始偏离即沿荧光亮度梯度下降方向上首个偏离基准峰值波长的区域。此处的荧光亮度梯度下降方向是指荧光亮度变化下降最快的方向。则以该初始偏离基准峰值波长的区域作为特异性荧光蛋白的真实边界区域。如图3中的c图,是采用本发明的测试方法找寻的特异性荧光蛋白组织的边界区域图,通过该测试方法可以精确确定特异性荧光蛋白组织的边界区域。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种应用光谱检测的荧光成像装置,其特征在于,包括: 成像部,包含可见光光源、第一近红外激发光源和双图像传感器; 光谱检测部,包含第二近红外激发光源和光谱仪;其中,所述可见光源向其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本发射可见光,该标本反射可见光;所述第一近红外激发光源向其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本发射近红外激发光,所述激发光激发所述具有特异性靶向荧光蛋白的标本,从所述特异性靶向荧光蛋白处发射荧光;所述反射的可见光和所述发射的荧光传输至所述双图像传感器,所述双图像传感器将所述发射的荧光转换为第一图像,将所述反射的可见光转换为第二图像; 所述第二近红外激发光源向其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本发射近红外激发光,所述激发光激发所述具有特异性靶向荧光蛋白的标本,从所述特异性靶向荧光蛋白处发射荧光,所述光谱仪检测该发射荧光的峰值波长。
2.根据权利要求1的所述荧光成像装置,其特征在于,所述成像部还包括陷波滤光器,所述反射的可见光和所述发射的荧光在传输至所述双图像传感器之前经过所述陷波滤光器。
3.根据权利要求2的所述荧光成像装置,其特征在于,所述双图像传感器还设置有可见光带通滤光片和近红外带通滤光片。
4.根据权利要求2或3的所述荧光成像装置,其特征在于,所述成像部还包括第一光路通道,所述反射的可见光和所述发射的荧光沿所述第一光路通道传输至所述陷波滤光器。
5.根据权利要求1至3之一的所述荧光成像装置,其特征在于,所述光谱检测部还包括第二光路通道,所述发射的荧光沿所述第二光路通道传输至所述光谱仪。
6.根据权利要求5的所述荧光成像装置,其特征在于,所述光谱检测部还包括一光环行器,所述第二光路通道、所述第二近红外激发光源以及所述光谱仪分别连接至所述光环行器。
7.根据权利要求5的所述荧光成像装置,其特征在于,所述第二光路通道优选光纤。
8.一种应用光谱检测的荧光成像测试方法,其包括:
使用适用于向其中具有特异性靶向荧光蛋白的标本发射近红外激发光的激发光源来产生激发光,其中所述激发光激发所述具有特异性靶向荧光蛋白的标本,从所述特异性靶向荧光蛋白处发射荧光;
同时提供可见光光源投射所述其中具有特异性荧光蛋白的标本,该标本反射可见光;
收集所述发射的荧光,将其转换为第一图像信息,以及收集所述反射的可见光,将其转换为第二图像信息;
根据所述第一和第二图像信息,选择荧光亮度最高的区域作为基准区域,收集该基准区域反射的荧光,将其转换为光谱信息,获得该基准区域的荧光光谱峰值波长,以该峰值波长作为基准峰值波长;
以所述基准区域的荧光亮度为参照,选择荧光亮度低于该基准区域一定范围的区域作为待测区域;
使用所述激发光源照射所述待测区域,收集该待测区域的荧光,将其转换为光谱信息,判断该光谱信息中的荧光光谱峰值波长,以初始偏离所述基准峰值波长的区域作为特异性荧光蛋白的真实边界区域。
9.根据权利要求8的所述测试方法,其特征在于,所述选择荧光亮度低于该基准区域一定范围是指选择荧光亮度低于该基准区域的10%~30%。
10.根据权利要求8的所述测试方法,其特征在于,所述选择荧光亮度低于该基准区域一定范围是指选择荧光亮度低于该基准区域的10%~20%。
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