CN112410278A

CN112410278A - 一种在白色链霉菌中高效合成默诺霉素a的方法

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Publication number: CN112410278A
Application number: CN202011374492.2A
Authority: CN
Inventors: 康前进; 李兴; 白林泉; 欧一新
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112410278B

Abstract

本发明公开了一种在白色链霉菌中高效合成默诺霉素A的方法；是基于默诺霉素A生物合成基因簇异源表达宿主Streptomyces.albus导入定点突变型A类青霉素结合蛋白基因优化其异源宿主的方法，默诺霉素A通过作用于细菌细胞壁aPBP的肽聚糖糖基转移酶结构域活性位点，来高效抑制革兰氏阳性细菌细胞壁的合成。通过基因工程的手段对默诺霉素生物合成基因簇进行大片段组装和启动子优化，在优化菌株II中导入默诺霉素A抗性基因MaPBP进一步提高菌株II默诺霉素耐受性。最终在菌株LX03中默诺霉素A异源表达产量相比出发菌株I提高了110％。本发明不仅阐述了大片段基因簇的基因工程改造方法，同时也开启了抗性基因优化Streptomyces.albus宿主来提高目标化合物产量的先河。

Description

一种在白色链霉菌中高效合成默诺霉素A的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种在白色链霉菌中高效合成默诺霉素A的方法，尤其涉及一种基于默诺霉素A生物合成基因簇异源表达和宿主菌株默诺霉素A抗性基因MaPBP优化的方法，具体是一种基于默诺霉素A生物合成基因簇异源表达宿主Streptomyces.albus J1074导入定点突变型A类青霉素结合蛋白(Mutant class Apenicillin-binding proteins，MaPBP)基因优化其异源宿主的方法。

背景技术

默诺霉素类化合物通过与细菌细胞壁肽聚糖糖基转移酶(Peptidoglycantransferase，PGT)的活性位点结合，对众多的革兰氏阳性细菌均具有较好的杀灭或抑制作用，针对有些菌株的最低抑菌浓度(MIC)仅为1～100ng/mL，生物学活性是万古霉素的约近10-1000倍，默诺霉素类抗生素的化学结构复杂新颖，含有一个3-磷酸甘油酸单元、4～5个糖基和一个特殊的异戊烯基脂肪链，也被称为磷糖脂类抗生素。而且在已经发现的十多种天然磷糖脂类化合物中，许多成员都具有显著的抗菌活性和一定的抗肿瘤活性，是抗生素新药研发的热点化合物。但是默诺霉素在其产生放线菌加纳链霉菌ATCC14672中产量极低，且为多种化合物混合物，对默诺霉素生物合成与新结构临床药物的创制工作极为不利，严重限制了磷酸糖脂类化合物临床药物的研究进程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在白色链霉菌中高效合成默诺霉素A的方法；通过对默诺霉素A生物合成基因簇基因工程的启动子优化和导入默诺霉素A抗性基因MaPBP提高宿主对默诺霉素A的耐受性两种主要策略来优化默诺霉素A异源合成体系，提高高活性默诺霉素A的产量。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。

第一方面，本发明涉及一种高效化合物默诺霉素A，分子式为C₆₉H₁₀₈N₅O₃₄P，化学结构式为：

第二方面，本发明涉及一种在白色链霉菌中高效异源合成默诺霉素A的方法，通过基因工程的手段得到了默诺霉素A生物合成基因簇并进行启动子的优化后得到默诺霉素A异源合成菌株Streptomyces albus，再通过代谢工程的手段在菌株Streptomyces albus中导入默诺霉素A抗性基因MaPBP来增强宿主对默诺霉素A的耐受能力，所得菌株发酵培养得到默诺霉素A。该方法使默诺霉素A的异源表达产量得以提高。

作为本发明的一个具体实施方案，所述菌株Streptomyces albus为默诺霉素A异源合成菌株Streptomyces albus LX02，所得菌株为LX02::pJQK557。

作为本发明的一个实施方案，所述默诺霉素A生物合成基因簇包括默诺霉素生物合成基因簇cluster 1和包含moeA4&moeB4&moeC4和moeR5&moeS5五个基因的cluster 2；其中，moeA4&moeB4&moeC4基因序列如SEQ ID NO.11所示，moeR5&moeS5序列如SEQ ID NO.12所示。

作为本发明的一个实施方案，所述启动子为Promoter 6、KasOp*、PermE*和Promoter 2，序列分别如SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.37所示。

作为本发明的一个实施方案，所述默诺霉素A抗性基因MaPBP的序列为SEQ IDNO.52。

所述默诺霉素A抗性基因MaPBP来源于Streptomyces albus J1074，将第200位的苯丙氨酸突变为天冬氨酸，238位的脯氨酸突变为谷氨酰胺。

作为本发明的一个实施方案，所述方法包括如下步骤：

S1、在林可链霉菌NRRL2936的基因组文库中筛选包含默诺霉素生物合成基因簇cluster 1的fosmid质粒pJQK455；

S2、以加纳链霉菌ATCC14672基因组为模板通过高保真PCR的方法得到包含moeA4&moeB4&moeC4和moeR5&moeS5五个基因的默诺霉素生物合成基因簇cluster 2；

S3、(将包含cluster 2基因簇的质粒命名为pJQK551，酶切处理后得到默诺霉素基因簇cluster 2的片段)通过λ-red同源重组技术对cluster 1和cluster 2基因簇进行组装，获得默诺霉素A完整生物合成基因簇的

位点整合型质粒I，命名为pJQK554；

S4、对

位点整合型质粒I中的四个关键开放阅读框(moeJ5、moeE5、moeP5和moeGT5的启动子)进行Promoter 6、KasOp*、PermE*和Promoter 2强启动子替换得到

位点整合型质粒II，命名为pJQK556；

S5、分别将S3和S4构建得到的质粒I和质粒II接合转移导入野生型受体菌株Streptomyces albus中，获得默诺霉素A异源合成菌株I和菌株II,命名为LX01和LX02；

S6、设计并构建用于提高菌株II耐受性的默诺霉素A抗性基因MaPBP的

位点整合型质粒III，命名为pJQK557；

S7、将S6构建得到的质粒III接合转移导入受体菌株II中，得到默诺霉素A高效异源合成菌株Ⅲ，命名为LX03；

S8、发酵培养所述菌株I，菌株II、菌株Ⅲ。在菌株Ⅲ中默诺霉素A异源表达产量相比出发菌株I提高了110％。

步骤S2中，PCR用引物包括序列如SEQ ID NO.7、8所示的ABC-F/R和序列如SEQ IDNO.9、10所示的R5S5-F/R。

步骤S4中，所述强启动子包括序列如SEQ ID NO.36所示的KasOp*强启动子和序列如SEQ ID NO.39所示的PermE^*强启动子。

作为本发明的一个实施方案，步骤S3包括如下步骤：

S31、在默诺霉素生物合成基因簇cluster 2的两端添加和cluster 1基因簇两端有45bp同源臂以及酶切位点MunI的质粒pJQK551，其中包含作为筛选标记的抗性基因卡那霉素；

S32、用MunI限制内切酶处理质粒pJQK551，得到包含cluster 2基因簇的10kb基因片段；将包含cluster 1的质粒pJQK455和包含cluster 2基因簇的10kb基因片段通过电转导入λ-red同源重组菌株GB08中，10％阿拉伯糖诱导线性环形重组发生，通过阿伯拉霉素和卡那霉素抗生素筛选得到阳性克隆质粒I，即所述

位点整合型质粒I。

步骤S31中，所述同源臂的序列如SEQ ID NO.14、15所示。

步骤S31中，所述抗性基因卡那霉素的序列如SEQ ID NO.13所示。

步骤S32中，所述10kb基因片段的序列为moeA4&moeB4&moeC4基因序列SEQ IDNO.11，moeR5&moeS5基因序列SEQ ID NO.12，同臂源序列SEQ ID NO.14、15以及卡那霉素基因cassette序列SEQ ID NO.13的和。(图6为酶连顺序)

所述λ-red同源重组菌株GB08指的是带有Redαβ重组体系，专门用于线性环形同源重组的菌株。为微生物领域常用商用菌株(GeneBridges公司)，本领域技术人员可以通过购买得。

作为本发明的一个实施方案，步骤S4包括如下步骤：

S41、构建启动子优化所需的Promoter 6-FRT-cml-FRT-KasOp*和PermE^*-MTFRT-kan-MTFRT-Promoter 2两个基因cassette 1和cassette 2；

S42、将cassette 1和cassette 2分别通过电转导入含有质粒pJQK455的λ-red同源重组菌株GB08中，10％阿拉伯糖诱导重组发生，通过FRT同源重组敲除cassettes中的氯霉素和卡那霉素抗性基因后得到质粒pJQK553；

S42、将S32中包含cluster 2基因簇的10kb基因片段与质粒pJQK553电转导入λ-red同源重组菌株GB08中，10％阿拉伯糖诱导线性环形重组发生，通过阿伯拉霉素和卡那霉素抗生素筛选得到阳性克隆质粒II，即所述

位点整合型质粒II。

步骤S41中，所述cassette 1和cassette 2的序列分别如SEQ ID NO.28、29所示。

步骤S41中，Promoter 6加强moeJ5及其下游基因的转录，KasOp*加强moeE5及其下游基因转录，PermE^*加强moeP5及其下游基因的转录，Promoter 2加强moeGT5及其下游基因的转录。

作为本发明的一个具体实施方案，步骤S5中，所述野生型受体菌株Streptomycesalbus为野生型受体菌株Streptomyces albus J1074。

作为本发明的一个实施方案，步骤S6中，默诺霉素A抗性基因MaPBP来源于Streptomyces albus J1074，将第200位的苯丙氨酸突变为天冬氨酸，238位的脯氨酸突变为谷氨酰胺。

作为本发明的一个实施方案，步骤S6中，所述构建是将默诺霉素A抗性基因MaPBP片段插入用NdeI和MunI消化处理的

位点整合型质粒pLX15a中构建得到所述

位点整合型质粒III。其中，pLX15a质粒包含

整合所需的attP序列和相对应的int整合酶，同时含有潮霉素抗性基因，为由通用质粒pSET152改造而来。

作为本发明的一个实施方案，步骤S8中，所述发酵培养是将所述默诺霉素异源合成菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的孢子接种于R5固体培养基中，30℃培养168h后得发酵固体板。

第三方面，本发明涉及一株高效异源合成默诺霉素A的白色链霉菌Streptomycesalbus J1074-LX03，保藏编号为CGMCC NO.20985。

本发明中的白色链霉菌Streptomyces albus J1074-LX03，已经于2020年11月2日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.20985。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用基因工程和代谢工程的手段对默诺霉素A生物合成基因簇进行体外启动子优化得到异源表达宿主II，在菌株II中通过导入默诺霉素A抗性基因MaPBP提高了宿主对默诺霉素A的耐受性，使得突变菌株LX03中默诺霉素A产量较其出发菌株I提高了110％，为高效默诺霉素A生物合成的研究与新结构临床药物的创制奠定了基础。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为整合型质粒pJQK554和pJQK556琼脂糖凝胶电泳验证图；

图2为默诺霉素A抗性基因MaPBP的

位点整合型质粒III琼脂糖凝胶电泳验证图；

图3为菌株I(LX01)，II(LX02)和LX03质谱检测结果分析图；

图4为菌株I(LX01)，II(LX02)和LX03默诺霉素A相对产量柱状图；

图5为pJQK455质粒构建图；

图6为pJQK551质粒构建图；

图7为pJQK554质粒构建图；

图8为pJQK553质粒构建图；

图9为pJQK556质粒构建图；

图10为pLX15a和pJQK557质粒构建图。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明进一步作说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，并给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。

实施例

默诺霉素A高产菌株Streptomyces albus LX03的构建

步骤一：包含默诺霉素生物合成基因簇cluster 1的fosmid质粒pJQK455的构建；通过antiSMASH在线分析，在林可链霉菌全基因组(GenBank:CP016438.1)中发现不完整的默诺霉素生物合成基因簇cluster 1(GenBank assembly accession:GCA_003344445.1RefSeq assembly accession:GCF_003344445.1)。设计引物(Moe-L-F/Moe-L-R和Moe-R-F/Moe-R-R)利用聚合酶链式反应递缩基因组文库的方法筛选得到含有默诺霉素生物合成基因簇的fosmid质粒5B1、8F3、9A8和16G7，通过BamHⅠ和KpnⅠ限制酶酶切确定是正确的，选取其中的5B1进行测序确认为正确质粒，命名为pJQK455(图5)。

上述步骤一所用引物为：

引物名称	碱基序列
		Moe-L-F	5′-CCCGGGACGACATGCATGAT-3′SEQ ID NO.1
Moe-L-R	5′-CGGGAGATCTTCTCCTTCGG-3′SEQ ID NO.2
		Moe-R-F	5′-CACATCGCCCGGTTGAACAC-3′SEQ ID NO.3
Moe-R-R	5′-TACGACGGTGAGGTCCACGT-3′SEQ ID NO.4

步骤二：默诺霉素生物合成基因簇cluster 2克隆的构建；

以加纳链霉菌ATCC14672基因组总DNA(GenBank:MT417183.1)为模板，分别以ABC-F/R和R5S5-F/R为引物通过高保真PCR的方法克隆得到包含moeA4&moeB4&moeC4和moeR5&moeS5两个DNA片段(SEQ ID NO.11、12)，再以kan-F/R为引物构建卡那霉素基因cassette(SEQ ID NO.13)，在卡那霉素基因cassette和moeR5&moeS5末端设计与pJQK455质粒上替换序列两端同源的45bp长度的左右同源臂(SEQ ID NO.15、14)，通过基因测序验证上述三个PCR片段(其中，moeA4&moeB4&moeC4对应的序列如SEQ ID NO.11所示，moeR5&moeS5对应的PCR片段的序列如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.12的和所示，卡那霉素基因cassette对应的PCR片段的序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.15的和所示)的正确性。在37度水浴条件下用XbaI和HindIII内切酶消化moeA4&moeB4&moeC4，KpnI和XbaI消化卡那霉素基因cassette，HindIII和PstI消化moeR5&moeS5，以及用KpnI和PstI消化pBlueScriptⅡSK(+)质粒，通过琼脂糖凝胶回收试剂盒将以上四个基因片段进行回收纯化，用连接酶进行连接后通过感受态钙转法导入克隆菌株大肠杆菌DH10B，次日挑取单克隆抽提质粒后酶切验证。用SacI/XhoI消化处理后可以观察到2917bp，2338bp，2143bp，1277bp，938bp，784bp，409bp，357bp，39bp的目标条带表明质粒构建正确命名为pJQK551(图6)。将MupJQK551用nI内切酶(酶切位点位于SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.10上)消化后可得到10.3kb的与pJQK455质粒进行线性环形重组用的默诺霉素基因簇cluster 2(cluster2序列即为三个PCR片段的和，其顺序即为酶切酶连的顺序，如图6所示)。

上述步骤二所用引物为：

步骤三：默诺霉素不完整基因簇cluster 1和cluster 2的组装；

将步骤一构建完成的质粒pJQK455通过电转的方法将其导入宿主大肠杆菌GB08中，取转化子于含有阿伯拉霉素(50ug/ml)抗生素的LB培养基中37℃过夜培养，将过夜培养物按5％的比例接种于含有阿伯拉霉素(50ug/ml)抗生素的LB培养基中，培养两个小时后，按3％的比例加入10％阿拉伯糖诱导GB08中重组酶的表达，继续培养40分钟后将培养物置于冰上，用冰水洗涤菌体三次以充分去除培养物中的抗生素。取步骤二制备的50ng/ul浓度的默诺霉素基因簇cluster 2水溶液2ul加入35ul洗涤后的GB08-pJQK455菌体，置于电转杯中以1350V的电压电击6毫秒后迅速加入800ul预冷液体LB吹打混匀，将获得菌液37度摇床培养1小时，均匀涂布于含有阿伯拉霉素(50ug/ml)抗生素和卡那霉素(50ug/ml)抗生素的固体LB平板上，37度培养箱倒置培养12-16小时后挑取单克隆抽提质粒，经NcoI消化处理后可以观察到1306bp,1570bp,1629bp,2135bp，3012bp,3903bp,4171bp,6795bp,19101bp的酶切片段说明质粒构建正确(图1)，成功获得包含默诺霉素A完整生物合成基因簇的

位点整合型质粒I命名为pJQK554(图7)。

步骤四：默诺霉素基因簇质粒I中四个关键开放阅读框进行强启动子替换后的整合型质粒pJQK556的构建；

首先构建启动子优化所需的Promoter 6-MTFRT-cml-MTFRT-KasOp*和PermE^*-FRT-kan-FRT-Promoter 2两个基因cassette 1和cassette 2，在基因cassette 1的两端分别带有50bp左右的moeJ5和moeE5的同源臂序列(SEQ ID NO.30、31)，在基因cassette 2的两端分别带有50bp左右的moeP5和moeGT5的同源臂序列(SEQ ID NO.32、33)。以白色链霉菌J1074基因组为模板，P6-F/R为引物通过高保真PCR的方法扩增出Promoter 6的序列(SEQID NO.34)；以氯霉素基因为模板，cml-F/R为引物扩增出氯霉素(cat)序列(SEQ IDNO.35)；以KasOp*序列为模板，KasOp*-F/R为引物扩增出KasOp*基因序列(SEQ ID NO.36)；通过Overlap PCR的方法将Promoter 6,cat和KasOp*进行序列拼接，得到1810bp的PCR产物。将纯化后的PCR片段连接于EcoRV处理的pBluescript SK(+)载体，经过蓝白斑筛选及测序正确后，经XhoI/PstI双酶切后回收1810bp的目标片段，得到用于λ-red同源重组的基因cassette 1(SEQ ID NO.28)。

然后构建启动子优化所需的PermE^*-FRT-kan-FRT-Promoter 2基因cassette 2，在基因cassette 2的两端分别带有50bp左右的moeP5和moeGT5的同源臂序列(SEQ IDNO.32、33)。以白色链霉菌J1074基因组为模板，P6-F/R为引物通过高保真PCR的方法扩增出Promoter 2的序列(SEQ ID NO.37)；以卡那霉素基因为模板，kan-F/R为引物扩增出卡那霉素(noe)序列(SEQ ID NO.38)；以PermE^*序列为模板，PermE^*-F/R为引物扩增出PermE^*基因序列(SEQ ID NO.39)；通过Overlap PCR的方法将Promoter 2,noe和PermE^*进行序列拼接，得到2273bp的PCR产物。将纯化后的PCR片段连接于EcoRV处理的pBluescript SK(+)载体，经过蓝白斑筛选及测序正确后，经XhoI酶切后回收2273bp的目标片段，得到用于λ-red同源重组的基因cassette 2(SEQ ID NO.29)。所用引物如下表。

将cassette 1通过电转导入步骤三含有质粒pJQK455的λ-red同源重组菌株GB08(GB08-pJQK455)中，10％阿拉伯糖诱导基因重组的发生，在含有阿伯拉霉素(50ug/ml)抗生素和氯霉素(50ug/ml)抗生素的固体LA平板上得到筛选得到阳性转化子，挑取单克隆置于含有同种抗生素的液体LB中，37度培养过夜后利用电转质粒法将pBT340导入GB08::pJQK455::cassette 1菌株中，于在含有阿伯拉霉素(50ug/ml)，氯霉素(50ug/ml)和氨苄青霉素(100μg/mL)三种抗生素的固体LA平板上，37度倒置过夜培养，将得到的阳性转化子单克隆置于含有阿伯拉霉素(50ug/ml)的LA平板上，42度过夜培养，pBT340质粒中的FLP/FRT重组系统发挥功能，敲除cassette 1中的氯霉素抗性基因同时菌株将pBT340质粒丢失，将42度过夜培养所得单克隆液体LB扩大培养，抽提质粒，验证正确后电转导入大肠杆菌GB08，以同种方式将cassette 2敲入目标质粒。将敲入四个启动子并敲除相关抗性基因的质粒pJQK455命名为pJQK553(图8)。经NcoI消化处理后可以观察到569bp，1119bp，1570bp，1629bp，3051bp，3324bp，3922bp，4120bp，9391bp和19533bp，说明质粒构建正确。

将构建完成的质粒pJQK553通过电转的方法将其导入宿主大肠杆菌GB08中，利用步骤三所述λ-red同源重组的方法将pJQK553与默诺霉素生物合成基因簇cluster 2进行组装，得到完整的默诺霉素基因簇命名为pJQK556(图9)。经NcoI消化处理后可以观察到1306bp，1570bp，1629bp，2135bp，3012bp，3903bp，4171bp，7136bp和19533bp；经KpnI消化后可以观察到4305bp，4674bp，5884bp，6459bp，7297bp和12736bp。说明质粒构建正确(图1)。

上述步骤四所用引物为：

步骤五：将步骤三和步骤四构建得到的质粒pJQK554和pJQK556通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体菌株Streptomyces albus J1074中；

将步骤三和步骤四已构建完成的质粒pJQK554和pJQK556通过化学转化法将其导入E.coli ET12567/pUZ8002中。取该转化子于含有50ug/ml氯霉素、50ug/ml卡那霉素和50ug/ml阿泊拉霉素三种抗生素的LB培养基中37℃过夜培养，将过夜培养物按10％的比例转接至新鲜LB培养液培养3小时，然后用新鲜的LB溶液洗涤菌体2次以充分除去培养物中的抗生素。同时制备Streptomyces albus J1074的新鲜孢子溶液一毫升，用TES溶液漂洗2～3次后再用0.5mL TES溶液悬浮孢子，在50℃水浴锅中热激10min，自来水下冷却至室温后加入等体积2×孢子预萌发培养液及0.5uM氯化钙溶液在37℃摇床培养2.5小时进行孢子的预萌发过程。离心收集孢子，并用新鲜的LB溶液漂洗孢子1次，然后将孢子重悬于适量的LB中，在混合器上充分震荡并打散孢子，按照1:10的供受体比与大肠杆菌细胞混合后均匀涂布于不含有抗生素的MS平板上，待平板吹干后转移至30℃培养箱中培养12-16小时后取出平板，并用含有阿伯拉霉素(0.5mg)与萘啶酮酸(1mg)的1.5mL无菌水覆盖于MS平板上，将平板吹干后转移至30℃培养箱中培养。5-6天后可见平板上有单菌落结合子长出，最后采用moeJ5-F/R为PCR引物验证结合子正确性，获得默诺霉素A异源合成菌株Streptomyces albusJ1074::pJQK554(菌株I)和Streptomyces albus J1074::pJQK556(菌株II)。

上述步骤五所用引物为：

引物名称	碱基序列
		moeJ5-F	5′-GTTCATCGACCACACGCTGACC-3′SEQ ID NO.40
moeJ5-R	5′-GGTAGAAGCGGGAGGGCC-3′SEQ ID NO.41

步骤六：构建用于提高LX02耐受性的默诺霉素A抗性基因MaPBP的

位点整合型质粒pJQK557；

通过PCR定点突变和Overlap PCR技术以白色链霉菌J1074基因组(GenBank:DS999645.1)为模板将其aPBP蛋白第200位Phe突变为Asp，238位Pro突变为Gln，并置于强启动子KasOp*下游(基因cassette的具体构建方法如步骤三)。测序正确用NdeI和EcoRI限制性核酸内切酶消化带有目的基因MaPBP的克隆载体，回收2353bp基因片段(SEQ ID NO.52，即默诺霉素A抗性基因MaPBP的序列)，将其插入用NdeI和MunI(与EcoRI为同尾酶)消化处理的

位点整合型质粒pLX15a，在含有潮霉素(50ug/ml)的固体LA平板上挑取转化子，成功构建用于表达默诺霉素A抗性基因MaPBP的

位点整合型质粒pJQK557(图2，图10)。

上述步骤六所用引物为：

步骤七：将步骤六构建得到的质粒pJQK557通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体菌株II中；

将步骤六构建完成的质粒pJQK557通过化学转化法将其导入E.coli ET12567/pUZ8002中。取该转化子于含有50ug/ml氯霉素、50ug/ml卡那霉素和25ug/ml潮霉素三种抗生素的LB培养基中37℃过夜培养，将过夜培养物按10％的比例转接至新鲜LB培养液培养3小时，然后用新鲜的LB溶液洗涤菌体2次以充分除去培养物中的抗生素。同时制备菌株II的新鲜孢子溶液一毫升进行接合转移(具体接合转移操作如步骤五所述)，培养12-16小时后取出平板，并用含有潮霉素(0.5mg)，阿伯拉霉素(0.5mg)与萘啶酮酸(1mg)的1.5mL无菌水覆盖于MS平板上，将平板吹干后转移至30℃培养箱中培养。5-6天后可见平板上有单菌落结合子长出，最后采用moeJ5-F/R和hyg-F/R为PCR引物验证结合子正确性，获得默诺霉素A异源合成菌株LX03(LX02::pJQK557)。

上述步骤七所用引物为

引物名称	碱基序列
		hyg-F	5′-GCGAAGTCCTCGGTCCGCTT-3′SEQ ID NO.50
hyg-R	5′-CTGGCCGTGGCCCTACCTG-3′SEQ ID NO.51

步骤八：对以上步骤所述LX01，LX02和LX03三种突变菌株发酵培养，并分析默诺霉素A产物；

本步骤发酵采用R5培养基固体发酵法，种子培养基(TSBY)配方为Oxoid胰胨豆汤粉30g，蔗糖103g，Difco酵母膏5g，加蒸馏水定容至1L；发酵培养基R5配方为蔗糖60g/L,硫酸钾0.25g/L,六水氯化镁10.12g/L,葡萄糖10g/L，酪蛋白水解物0.1g/L，微量元素2ml/L，酵母提取物5g/L，TES缓冲液5.73g/L，琼脂粉15g/L,加蒸馏水定容至1L。氯化钴1mg/L(灭菌后加入)，磷酸二氢钾(0.5％)10ml/L(灭菌后加入)，氯化钙(5M)4ml/L(灭菌后加入)，L-脯氨酸(20％)15ml/L(灭菌后加入)，氢氧化钠(1N)7ml/L(灭菌后加入)。

将R5固体发酵培养基灭菌后置于培养皿上，每块培养皿分装30毫升固体培养基。首先将LX01，LX02和LX03三种突变菌株转接至种子培养基中，以220rpm转速在30℃摇床培养24h后得发酵种子液，最后将发酵种子液按照5％的接种比例转接于固体发酵培养基中，涂布棒涂布均匀，在30℃恒温培养箱培养7天后收取固体发酵培养基，并按照以下方法进行检测、分析。

将固体发酵培养产物切块后置于无菌玻璃容器中，往里面添加等倍体积(30mL)的甲醇溶液，混匀并超声处理15min，获得发酵萃取液。取1mL发酵萃取液于1.5mL离心管中，12000rpm离心5～8min，所得上清液经0.22μm有机滤膜过滤后，即可获得用于LC-MS分析的发酵产物样品。经检测分析，在LX03中默诺霉素A异源表达产量相比出发菌株I提高了110％(图3，图4)。

综上所述，本发明提供了一种基于默诺霉素A生物合成基因簇异源表达宿主Streptomyces.albus J1074导入定点突变型A类青霉素结合蛋白(Mutant class Apenicillin-binding proteins，MaPBP)基因优化其异源宿主的方法，默诺霉素A通过作用于细菌细胞壁aPBP的肽聚糖糖基转移酶(Peptidoglycan glycosyltransferase,PGT)结构域活性位点，来高效抑制革兰氏阳性细菌细胞壁的合成。通过对默诺霉素生物合成基因簇进行基因工程改造和在菌株LX02中导入默诺霉素A抗性基因MaPBP的代谢工程改造，默诺霉素A异源表达产量相比出发菌株LX01提高了110％。本发明不仅阐述了大片段基因簇的基因工程改造方法，同时也开启了抗性基因优化Streptomyces.albus宿主来提高目标化合物产量的先河。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种在白色链霉菌中高效合成默诺霉素A的方法

<130> KAG45562

<160> 52

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccgggacga catgcatgat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggagatct tctccttcgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggagatct tctccttcgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tacgacggtg aggtccacgt 20

<210> 5

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttggtacctt caattggaca ccccgcgcca cgcccgcgcc gccctacgac agctgcgact 60

gggcgtcccg gaaaacgatt ccg 83

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttctagaca cgctgccgca agcactca 28

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttaagctttc agccaccgcc ggcgaagcg 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aatctagatc agagagcggc cggggtcgc 29

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttaagctttc agaccagccg gtggccg 27

<210> 10

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aactgcagaa caattgcctg ggagccgcgg gacgcggagg agaccgggaa ggagttccgc 60

ggtgagagtt cttgtcgtcg gcg 83

<210> 11

<211> 4738

<212> DNA

<213> 加纳链霉菌(streptomyces ghanaensis ATCC14672)

<400> 11

actagttcag agagcggccg gggtcgccgg cacgcgggcg gagcccactt cctcccagac 60

ctggctcaga gcgtcgacga attcgcgtac gtcgtcggcg gtgtgcacgg ctccgggggc 120

gacccgcagg atctcctcac cgacccgcac gctcggcgcg ttgatcgcct gcacgtagat 180

tccgtgccgg tcgagcagca gcgcggacat ccgcttgcac acggcctcgt cccccaccat 240

gacggacacg atgtgcgtct ggtccgaaat gaaggggatg ccacgctcgt tcagcagccg 300

gtgcatcaac tgcgcgttcg accagagctg ttcccgctcg acctcggagg accgcagatg 360

gtgtacggct gccagggcgc cggcggccac ggccggcgcc agcgcggtgg tgaagacgaa 420

ggagcgggag aacatgcgca ccgcctcgat gatttcggcg ggccctgcga tgtagccgcc 480

ggtggtgccg aaacccttgg ccaaggtgcc catgatgacg gtgaagtcgt cggcgatgcc 540

ctcccgggcc gcgatgccgg caccctccgg gccgtacatg cccaccgcgt gcacctcgtc 600

gaggtacgtc atcgccccgt ggcgcttggc gatgtcggcg atttcggaca gcggggcgat 660

gtcgccgttc atcgagtaca cggactcggc gacgatgagc ttggggacgt cggggtcggc 720

cgccgctatc agttcttcca ggtgagcggg gtcgttgtgg cggaagatct gcttctgggc 780

gcggctgtgg cgcaggccgt cgatgatgga cgcgtggttg agtgcgtcgg agaagacgac 840

acacttctcc atgcggccgg cgatgacgga cagcgcaccg tcgttggcgg tgtaaccgga 900

ggtgaacagc agggcctcgt ccttgccgtg gagcgcggcg agctctctct ccagcagcac 960

gtggtagtgg ttggtgccgc cgatgttgcg tgagccgccg gcgccggcgc cgtactcgtc 1020

gatcgcgtcc ttcatggctt tgagcactgc gggatgctgg cccatgccga ggtagtcgtt 1080

gctgcaccag acgctgatgc tgtcccggcc ggtcacgggt ccactgctgc ggacgctggc 1140

cgcggggaag ctcccggcga gccgtccgat ctccaggaac tccctctttc ccccgtcgga 1200

gttttctgtg aggcgtgcaa agagatccag atattgggtc gtcacgtcta ctcgcttcgt 1260

tccaggccgt ctgaggctac atgcaactac gggcaaccgc gcataactgg ctgaaatcgc 1320

acggccatga ctggattctg cttgtccccg gcgccggtgc gaacgtgtca ctggcgaaat 1380

cgcgcgggag cggcctcacc attcgcaaca caggggaagg gcatgaaggt aacgtctgta 1440

tatcatcgac tccggcaggc attcaactcg cccaaggctg ccgggtgttg agaactggcc 1500

gacggcagcc gtgctcaccg gccgcacgcc caatggttac cgagagcggg ttgtcgcgct 1560

ttcgcgcgat catgtaagtc tgcactgacc gataaacgaa ccagcatggt gggggaacga 1620

tgtcctcgaa cgagaattac gtccgccggg tgcttgaggc gttggcctcc gaccccgacc 1680

ggattgccct gtgggcggat ggtgaagaaa tcaccgcggg ccagttctcc agggcggttc 1740

tcacggcagc ggaacttctg ctccggcact tcacggaaca tcgagacccg agtgcggaag 1800

gcaaggcccc ggttgtggcg gtgctgaccg tcaccaacag cccggcgacc atcatcctcc 1860

gctacgcggc caacctggcc ggggccaccc tggtccacct gcactccacg aacgcggtgg 1920

accccaccga ccagctggcc gccgccgccc ggctggacat tctcagcaag accggggcga 1980

ccttcctcgc cgtcgacaag gagaacctcg acgcggcccg agagctgtgc gaccggctgc 2040

ccgagccacc gcgtctcgcc gctctcggtg ccctcggccc cgatgtcctg gacctctcgt 2100

cgggcgaccc ggacgccttc ggccacgacg ccgtcgaggc cgaccccgaa cagccggccg 2160

tggtgatcta caccagcggt accagcggac gtcccaaggg tgtcacgcag ccgtaccgcc 2220

ttcgccgtgc caacctccaa gtggccctcc agtcccccga acccatcgtg tacctgtcga 2280

ccctgccggt gagcaactcc agcggctccg ccgtcgacgt cgcgctcgcc tccggcggaa 2340

cggtcgtcct gcacgacggg ttcgaggcgg gcgaagtgct gcgggccgtg gaacagcacc 2400

gcgtctccac gctgaccatc accccgccgc agctgtacat gctgatcgac caccccgaca 2460

ccgccaccac cgaccgttcg agcatcaggc tcatcaccta cctcggttcc cccgcggccc 2520

ccgcccgact ggccgaggcg gtcgaggtgt tcggcccggt gttgctccag ctctacggga 2580

ccacggaagt caacggcatc agcatgctga tgccgcagga ccacttcgac ccggaactgc 2640

gccggaccgt cggacgtccg accacggaga tacgcatccg cgacgtggac gacgaccgcg 2700

acctgccgcc cggcgagatc ggcgaggtgt gcgtgcagag cccgtccacc atgctcggct 2760

actggggcga accggagctg accgccgcga tcatccgcga cggctgggtg cacaccggcg 2820

acctcggttc cctcgacgag aacggctttc tgcgcctgca cggccgcatg ggcgaggtga 2880

tgaagaccaa cggcatcaag gtccatccca ccgatgtgga gaacgcgctg ctgacccatc 2940

cggaggtcac ccaggccgct gtgtactgcg tggtcgacga ggaccgcgtg gagcacatcc 3000

acgccgccgt cgtggtacgg ccgggcggca ccgccgactc cgggacgctg atcggccacg 3060

tcgccgccga gctgtctccg aagcacgtac cggccgtggt gacgttccac gacgcgctgc 3120

ccctcacccg tgccggaaaa ccggacaagc cggcgctggc cgcacggcac aacggtgcgg 3180

catgaccctg accgccgcgt ccgtactggc cgagtccgcc gggcgacgcc ccgaccaccc 3240

cgcgctcgtc ttcggctccg aacgcatcac ctacgccgag ctctggctcg caacccgccg 3300

gtacgcggcg gtgctgaggg accgcggtgt gcgcccgggc gaccggatcg ccctgctgct 3360

gccgaacaca ccgcacttcc cgatggtgta ctacggcgtg ctggcgctcg gtgccgtggt 3420

ggtcccggtg cacggcctgc tgcgtgccga cgagatcgtc cacgtgctgg gcgactccga 3480

ggcgaaggcc atggtgtgcg cggccccgat gctgaccgag ggcgccaagg cggccgggac 3540

ggccggggtt ccgctgctca ccgtcatggt cgagaacggc gaggacgacg acggcccggc 3600

acgcctcgac gtgctcgccg aacgggcgga gcccctggac ggtctggtgc cgcgcgcgcc 3660

cgacgacttg gccttggtgc tgtacacctc gggcaccacc ggccggccca agggcgcgat 3720

gatcacccac ctcaacctgg tgatgaacgt cagcaccacg atgcgctcgc cgttcgacct 3780

cggccccgag gacgtgctgc tgggctgtct gccgctgttc cacaccttcg gccagacctg 3840

cggcatgagc gcctgtttcc tggccggcgg caccctggtg ctcatgaacc gcttcgacgg 3900

ccccggcgcg ctcgacctca tggtcaccga gggctgcacg gtgttcatgg gcgtcccgac 3960

catgtacctg gccctcctcg acgccgccgc tcacgacgcc cgccgccccg tgctcgaccg 4020

cgccttctcc ggcggttcgg cgctaccggt caaggtgctc gaggagttcc aggaggtcta 4080

cggctgcccg atctacgagg ggtacggcct cacggagacc tcgccggtgg tggcgtacaa 4140

ccagaaggcg tggccgcgca ggcccggcac cgtggggcgc cccatctggg gcgtggaggc 4200

ggagatcgcc gccgccgacg tggaggaccg tatcgagctg ctgccggccg gggagatcgg 4260

ggagatcgtc gtacgcggcc acaacgtcat ggccggctac ctcaaccggc cggaagccac 4320

cgcagccgtg ctggtcgacg gctggttccg ctcgggcgac ctggggatga aggacgccga 4380

cggctatctg accatcgtcg accgcaagaa ggacatggtg ctgcgcggtg gctacaacgt 4440

ctatccacgc gaggtggagg aggtgctgat gcgtcacccg gccgtcgccc aggttgccgt 4500

catcggtgtc cccgacgaca agtacggcga ggaggtgtgc gccgtggtgc ggacgcggcc 4560

gggcacggat ccggacgcgg cgctggccgc gcacatcgtg tcctggagca ggcagcgaat 4620

cgccgcgtac aagtacccgc gccgggtgga gttcgtcgag gacttccccc tcgggccgag 4680

cggcaaggta ctgaaacgcg aactcgccgc ccgcttcgcc ggcggtggct gaactagt 4738

<210> 12

<211> 2867

<212> DNA

<213> 加纳链霉菌(streptomyces ghanaensis ATCC14672)

<400> 12

ccgcggagtg ctcctgcctc gggaccggcg gacaagcggc cggtctgatc atcggggcag 60

caacatatga ctccggcaca tgtcagggag ctccgaacgg gtgcgttcac cctgatgggg 120

gagtacggga gcgcccgtgc ggaagatcct cgaagggtgt cccgccctcg ttcggccgcg 180

tccgcgtttg acggcgggaa ggccgggggt aagcttctcg gctcgattgg ctctacgcgg 240

ggcccgtgtg gcagactgtc cgggttgctc ggttgagtgc cgatgccgcg cgcctcccgc 300

cgggaggact ggaagcgagt cccacagtac tcgtcgcctc aactgcccca ggttcgccga 360

aggcagcgct gtggcggacg tacgggaatc ttccgggaag cgtgtgcggg gtaccagcca 420

ggcgcccggt ggtcaccaca ccgcaaggtg tggcttcacc gaaccgcgtg gccacggtgt 480

ggaacgcagc cccccagatg ggattccgcg aggaaatttc gtacgggcgg gaaggcgaca 540

cacccgaccg cgtgggtcgg agagagagac cggaccccgg gtcccagagc gttacgagag 600

acaggactac caagtagccg tgagagttct tgtcgtcggc gggagcggct tcctcgggta 660

cgaggtgctc cgccgggccg tggccgccgg gtgggacgtg gccgcgacct accggacccg 720

ccccgaggaa ctgccgccgg tcacctggta ccgggccgac ctccgtgacc cggggcggat 780

gggagaggtg ctggcccgga cccggccggc cgcggtgatc aacgcgtcga gcggacacgc 840

cgactgggcg gtcacggccg acggcgcggc ccgcctcgcc ctggaggcgg cgcgcgccgg 900

ctgccgacta gtccacgtct cctccgacgc cgtgttctcc ggagccgacg tccactaccc 960

ggaggaggcc ctccccgacc ccgtctcccc gtacggcgcg gccaaggccg cggcggagac 1020

ggccgtcagg gtggccgtgc ccgaggccgc cgtggtgcgc acctcgctca tcgtggggca 1080

caaccggtcc gcccacgagg aggcggtgca cgccctggcg gccggccggc gcgccggcgt 1140

cctgttcacg gacgacgtcc gctgtccggt ccacgtcgac gatctggcct ccgcgctttt 1200

ggagatcgcg gcgtcggacg ggtccggggt gttccacgtg gcgggaccgg acgcgatgaa 1260

ccgtcacgac ctgggtgtcc tcatagcccg gcgggacgga ctggacccgg cccggctgcc 1320

ggccggtctg cggagcgagg tggccccgcc ggggaacctc gacatccgtc tcgtcaccga 1380

tgccacgcgg gcccggctcc ggacccggtt gcggggcgcg cgcgaattcc tcggccccgg 1440

cgttccggtg acgcggggcg tccgttgaga aaacccgccc gcaccgcgcc gcgcctcgat 1500

aaagtgattt tcgcggtcgt cctggggtgt cggaagagga cacgtccgac gtcggcggag 1560

ccggcgcagc gggtggcgac ccggccgccg gaatgtgatc cccgtgcgca ggcaccggtg 1620

ggggaacgcg gtggtgccgg tgaggaaagc accaagacga tacgtcggtc ccgttcgtcg 1680

tgtgggtcgg cacgtcagtc atgactcttg tcaaaaagga agtgtgactg catgtttggc 1740

gataattccg tggggtacga cgcgaacttt ccggccggtg gacctctcac cttggacctc 1800

gagaggatta tcggccgcca acgaataagg accggtctcg agagcagcgc cggattactg 1860

cgcggccgac ggatcctggt caccggagcc ggcggctaca tcggatcgga actgtgccgg 1920

cagctcagcc ggtgggaacc cgagagcctc atgatgctcg accggaacga gacggccctc 1980

cacctggcgg ccaccagcat cgggaacgtc tccccgtcgg tgcggacctc catcctcctc 2040

gcggacatca gggactccag agggctcgcc cggctgttcc agcagtgccg gccggacacc 2100

gtcttccacg cggcggccct caaatgggtg cccatcctgg agaagttccc cggggaagcc 2160

gtcaagacga atgtcttcgg cacccgagcg gtgctcgagg cggccctggc cgcggacgtc 2220

gcgttcctgg tgaacatctc gaccgacaag gcggtcgatc cggtcggggt gctcggatac 2280

tcgaaacgca tagccgaagg actcaccgcg gcggccgcga tccaggcggg cagaccgtac 2340

gtgagcgtgc gcttcggcaa cgtgctcggt tgccaggggt ccttcctcga cgtcttcgcc 2400

cggcagatcg cggccggcag accggtgacg gtcacccacc ccgaggtgac gcgctatctg 2460

atgaccgtcc aggaggccgt ggaactggtc atccagtcgg tcgcgctggg cagcgtcggc 2520

cacgccctgg tcctggacat gggggaacag gtccggatcc tcgacatcgc cagaaggctc 2580

atcgcgcacg ccggtgcgga gctcccggtc cgctacgtcg ggctgcggcc gggggagaag 2640

ctcaccgagg cgctggtggc cccttccgag tccccggtcc ggcacgggca tccgaagatc 2700

atggaagtgc cggtgccggc cctgaaggcg ggggacggcc cggaactcga cgcctggggc 2760

gaggaccagg ccgtcgtcgc cgccctgcgc gccacctgcc tcgccatggc gggcgacgac 2820

ccggtggcgc aggaccccgg ccaccggctg gtctgaaagc ttgatac 2867

<210> 13

<211> 1311

<212> DNA

<213> pet28a质粒(Artificial Sequence)

<400> 13

aagtgggctc cgcccgcgtg ccggcgaccc cggccgctct ctgaactcac gctgccgcaa 60

gcactcaggg cgcaagggct gctaaaggaa gcggaacacg tagaaagcca gtccgcagaa 120

acggtgctga ccccggatga atgtcagcta ctgggctatc tggacaaggg aaaacgcaag 180

cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg gcttacatgg cgatagctag actgggcggt 240

tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta aggttgggaa 300

gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc 360

aagatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca 420

cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac 480

aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt 540

tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc 600

gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg 660

aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc 720

tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc 780

ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat 840

ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc 900

cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca 960

tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga 1020

ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat 1080

tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc 1140

tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact 1200

ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc 1260

accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc c 1311

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gccaccctgg gagccgcggg acgcggagga gaccgggaag gagtt 45

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagtcgcagc tgtcgtaggg cggcgcgggc gtggcgcggg gtgtc 45

<210> 16

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttctcgaggc gcaggtagcg gatcagaacg gagagctgcc gtaacgggct gcctgccaag 60

tgaagtggtc ctcccagga 79

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggcgccgacc gcaccacact 20

<210> 18

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgagtgtggt gcggtcggcg ccgaagttcc tatacctttt gaagaatagg aacttcggga 60

gggctaacca tggatcca 78

<210> 19

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcagagaccg ttcgaatgtg aacagaagtt cctattcttc aaaaggtata ggaacttcag 60

gtgacggaag atcacttcgc 80

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgttcacatt cgaacggtct ctgc 24

<210> 21

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aactgcagac caccgctttt cctgtgctgt cggccccgtc gttcgcgtca cccgacattt 60

cacgaactcc cccagtcctg 80

<210> 22

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttctcgagtg cgtgcagccg gacgtcacgc ccggccgacg gcccggacgc ccctcccaaa 60

tgtggatcct accaaccggc 80

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tcgcaggtgc acgcggtcga 20

<210> 24

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atcgaccgcg tgcacctgcg agaagttcct atactttcta gagaatagga acttcgcacg 60

ctgccgcaag cactca 76

<210> 25

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ccgggccgga tatggccggg ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttcggcg 60

tcccggaaaa cgattccg 78

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcccggccat atccggcccg 20

<210> 27

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aactcgagtg gcgcgggcgg cggatcgaag ccgcgggcca ccgcgcgttg ccacgccatg 60

atccgacctc ccccttcgg 79

<210> 28

<211> 1810

<212> DNA

<213> 白色链霉菌J1074(treptomyces albus J1074)

<400> 28

ttctcgaggc gcaggtagcg gatcagaacg gagagctgcc gtaacgggct gcctgccaag 60

tgaagtggtc ctcccaggac tgggggtccc cccggactct gtctggggga gggtggatac 120

tccggaccgt gctggcgccc gcgacggacg gcctgcctgc ctcgcggttc cttgccccgc 180

gtggccagcg ggcctcaccg acccggtcct tctgtcactc tcactcggag agtgctaacg 240

ccaataatta gcactcgggg taggagagtg caaggcgcta ggggcctccg gccccgcgcc 300

cgtctactgg gggtgccctg tccgcgccgg cggatgcgga ggtcaggccg cccctgccgg 360

ggcgggggtg gggtggcctc aaacgccggc cgggctcgaa agatggcctc aagcgccggc 420

cgggctgatc tttgacgggc cgtccgctca caggcgcgcg ccaaagacgg cctcaagcgc 480

cggccgggct atagatagcc cggccggcgc ttgaggccgt cagtgaggcg cgcgtgcggg 540

cccagaccgg cccaactcag cccggccggc gcttgaggcc acccttggag cccggccggc 600

gcttgagggc accgagcccg gtcggcgcct gaggccagca cagagggccc gccccctgtt 660

ggtggggcgg gccctcgtga gtgtggtgcg gtcggcgccg aagttcctat accttttgaa 720

gaataggaac ttcgggaggg ctaaccatgg atccatggtt acgccccgcc ctgccactca 780

tcgcagtact gttgtaattc attaagcatt ctgccgacat ggaagccatc acaaacggca 840

tgatgaacct gaatcgccag cggcatcagc accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc 900

atggtgaaaa cgggggcgaa gaagttgtcc atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg 960

aaactcaccc agggattggc tgagacgaaa aacatattct caataaaccc tttagggaaa 1020

taggccaggc tttcaccgta acacgccaca tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg 1080

aaatcgtcgt ggtattcact ccagagcgat gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg 1140

gtgtaacaag ggtgaacact atcccatatc accagctcac cgtctttcat tgccatacgg 1200

aattccggat gagcattcat caggcgggca agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg 1260

tgcttatttt tctttacggt ctttaaaaag gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta 1320

taggtacatt gagcaactga ctgaaatgcc tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat 1380

atatcaacgg tggtatatcc agtgattttt ttctccattt tagcttcctt agctcctgaa 1440

aatctcgata actcaaaaaa tacgcccggt agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg 1500

gaacctctta cgtgccgatc aacgtctcat tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg 1560

gtatcaacag ggacaccagg atttatttat tctgcgaagt gatcttccgt cacctgaagt 1620

tcctatacct tttgaagaat aggaacttct gttcacattc gaacggtctc tgctttgaca 1680

acatgctgtg cggtgttgta aagtcgtggc caggagaata cgacagcgtg caggactggg 1740

ggagttcgtg aaatgtcggg tgacgcgaac gacggggccg acagcacagg aaaagcggtg 1800

gtctgcagtt 1810

<210> 29

<211> 2273

<212> DNA

<213> 白色链霉菌J1074(treptomyces albus J1074)

<400> 29

ttctcgagtg cgtgcagccg gacgtcacgc ccggccgacg gcccggacgc ccctcccaaa 60

tgtggatcct accaaccggc acgattgtgc ccacaacagc atcgcggtgc cacgtgtgga 120

ccgcgtcggt cagatcctcc ccgcacctct cgccagccgt caagatcgac cgcgtgcacc 180

tgcgagaagt tcctatactt tctagagaat aggaacttcg cacgctgccg caagcactca 240

gggcgcaagg gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca gaaacggtgc 300

tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag 360

agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg 420

acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc 480

aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct 540

gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt 600

tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc 660

tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag 720

accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg 780

gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac 840

tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc 900

gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc 960

tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc 1020

ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg 1080

ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat 1140

gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc 1200

cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa 1260

gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat 1320

tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt 1380

tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg 1440

ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccgaagtt cctatacttt 1500

ctagagaata ggaacttcgg cccggccata tccggcccgg ccaaatctcg gccggccacc 1560

tcggcctggc cagcctggcc cggccaatct cggcccgacc aacttcagcc cggccggcgc 1620

ttgaggccga tgagccgcgg agcggcgagt cttccgcccg gccggtccgg gtggcctcaa 1680

gcgccggccg ggctggtttt ggtgcggaca cgtctgaccg tgccggtcac cgatggcctc 1740

aagcgccggc cgggctggga gtggtggccg aggcttcggg cgtacgtgcc agcccgcaag 1800

gggctgcggt ggggtggcct caagcgccgg ccgggctgag gttggctggc tgggccgggt 1860

tcggccggtg ggtcgaggtg gcctggccgg gctcgccagg gtgagttggc cgacgggccg 1920

aggcggcccg cccgggctcc ccgggccgag ttggcgcggc caggccaggg ctcagcaggg 1980

tgggggagtg gggcaggcgg cccggtaggg gagtgcggga gggcagcgcg cgccgcgcgc 2040

attggcactc cgcttgaccg agtgctaatc gcggtcatag tctcagctct ggcactcccc 2100

gcaggagagt gccaacacag cgacgggcag gtccggcacc cgcgacgacg gatcgacctg 2160

gtcgccacac tcagatcagt taaccccgtg atctccgaag ggggaggtcg gatcatggcg 2220

tggcaacgcg cggtggcccg cggcttcgat ccgccgcccg cgccactcga gtt 2273

<210> 30

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ttctcgaggc gcaggtagcg gatcagaacg gagagctgcc gtaacgggct gcctgccaa 59

<210> 31

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aatgtcgggt gacgcgaacg acggggccga cagcacagga aaagcggtgg tctgcagtt 59

<210> 32

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ttctcgagtg cgtgcagccg gacgtcacgc ccggccgacg gcccggacgc ccctcccaa 59

<210> 33

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

atggcgtggc aacgcgcggt ggcccgcggc ttcgatccgc cgcccgcgcc actcgagtt 59

<210> 34

<211> 640

<212> DNA

<213> 白色链霉菌J1074(streptomyces albus J1074)

<400> 34

gtgaagtggt cctcccagga ctgggggtcc ccccggactc tgtctggggg agggtggata 60

ctccggaccg tgctggcgcc cgcgacggac ggcctgcctg cctcgcggtt ccttgccccg 120

cgtggccagc gggcctcacc gacccggtcc ttctgtcact ctcactcgga gagtgctaac 180

gccaataatt agcactcggg gtaggagagt gcaaggcgct aggggcctcc ggccccgcgc 240

ccgtctactg ggggtgccct gtccgcgccg gcggatgcgg aggtcaggcc gcccctgccg 300

gggcgggggt ggggtggcct caaacgccgg ccgggctcga aagatggcct caagcgccgg 360

ccgggctgat ctttgacggg ccgtccgctc acaggcgcgc gccaaagacg gcctcaagcg 420

ccggccgggc tatagatagc ccggccggcg cttgaggccg tcagtgaggc gcgcgtgcgg 480

gcccagaccg gcccaactca gcccggccgg cgcttgaggc cacccttgga gcccggccgg 540

cgcttgaggg caccgagccc ggtcggcgcc tgaggccagc acagagggcc cgccccctgt 600

tggtggggcg ggccctcgtg agtgtggtgc ggtcggcgcc 640

<210> 35

<211> 882

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏菌AH25(escherichia coli strain AH25)

<400> 35

gggagggcta accatggatc catggttacg ccccgccctg ccactcatcg cagtactgtt 60

gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga agccatcaca aacggcatga tgaacctgaa 120

tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt gcgtataata tttgcccatg gtgaaaacgg 180

gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg 240

gattggctga gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt agggaaatag gccaggcttt 300

caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt 360

attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt 420

gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc catacggaat tccggatgag 480

cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata aaacttgtgc ttatttttct 540

ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca gctgaacggt ctggttatag gtacattgag 600

caactgactg aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg 660

tatatccagt gatttttttc tccattttag cttccttagc tcctgaaaat ctcgataact 720

caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt 780

gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt tggcccaggg cttcccggta tcaacaggga 840

caccaggatt tatttattct gcgaagtgat cttccgtcac ct 882

<210> 36

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tgttcacatt cgaacggtct ctgctttgac aacatgctgt gcggtgttgt aaagtcgtgg 60

ccaggagaat acgacagcgt gcaggactgg gggagttcgt ga 102

<210> 37

<211> 695

<212> DNA

<213> 白色链霉菌J1074(streptomyces albus J1074)

<400> 37

gcccggccat atccggcccg gccaaatctc ggccggccac ctcggcctgg ccagcctggc 60

ccggccaatc tcggcccgac caacttcagc ccggccggcg cttgaggccg atgagccgcg 120

gagcggcgag tcttccgccc ggccggtccg ggtggcctca agcgccggcc gggctggttt 180

tggtgcggac acgtctgacc gtgccggtca ccgatggcct caagcgccgg ccgggctggg 240

agtggtggcc gaggcttcgg gcgtacgtgc cagcccgcaa ggggctgcgg tggggtggcc 300

tcaagcgccg gccgggctga ggttggctgg ctgggccggg ttcggccggt gggtcgaggt 360

ggcctggccg ggctcgccag ggtgagttgg ccgacgggcc gaggcggccc gcccgggctc 420

cccgggccga gttggcgcgg ccaggccagg gctcagcagg gtgggggagt ggggcaggcg 480

gcccggtagg ggagtgcggg agggcagcgc gcgccgcgcg cattggcact ccgcttgacc 540

gagtgctaat cgcggtcata gtctcagctc tggcactccc cgcaggagag tgccaacaca 600

gcgacgggca ggtccggcac ccgcgacgac ggatcgacct ggtcgccaca ctcagatcag 660

ttaaccccgt gatctccgaa gggggaggtc ggatc 695

<210> 38

<211> 1264

<212> DNA

<213> pet28a质粒(Artificial Sequence)

<400> 38

cacgctgccg caagcactca gggcgcaagg gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag 60

ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa 120

gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc 180

tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg 240

gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat 300

ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac 360

aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 420

gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 480

gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg 540

cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg 600

tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt 660

catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc 720

atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 780

cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg 840

ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc 900

tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 960

ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 1020

ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 1080

acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 1140

tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg 1200

agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga 1260

cgcc 1264

<210> 39

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

atgtggatcc taccaaccgg cacgattgtg cccacaacag catcgcggtg ccacgtgtgg 60

accgcgtcgg tcagatcctc cccgcacctc tcgccagccg tcaagatcga ccgcgtgcac 120

ctgcga 126

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gttcatcgac cacacgctga cc 22

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ggtagaagcg ggagggcc 18

<210> 42

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tcatatgttg agctctgttc acattcgaac ggtctctgc 39

<210> 43

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ccgcccgagc gcttgtttcc cattcacgaa ctcccccagt cctg 44

<210> 44

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

atgggaaaca agcgctcggg cggcggcctg tct 33

<210> 45

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

tgccgtacgc ctgctgcccg aagtcggtga tgttcaggta gtt 43

<210> 46

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

aactacctga acatcaccga cttcgggcag caggcgtacg gca 43

<210> 47

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

tgaccgggtc gtaccggctt tgcgactgga cgaggcccgc 40

<210> 48

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gcgggcctcg tccagtcgca aagccggtac gacccggtca 40

<210> 49

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

aagaattctc agcggccctg gccgccgccg aac 33

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gcgaagtcct cggtccgctt 20

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

ctggccgtgg ccctacctg 19

<210> 52

<211> 2229

<212> DNA

<213> 白色链霉菌J1074(streptomyces albus J1074)

<400> 52

atgggaaaca agcgctcggg cggcggcctg tctccggccc agcaggccgc caagttcctc 60

ggggtcagcg tggtcgccgg cgcggtgctg gcggggatcg ccctgcccgc cgccggggcc 120

ctgggcctgg ccgcgaaggg ctccgtcgag ggattcgacg agctgccggc caacctcaag 180

acaccaccgc tgagtcagcg cagcaccatc ctggacgcgg agggcggcaa gatcgccacc 240

gtctactacc gcgaccgcac gatagtcccg ctcaaggaca tctcgcccta catgcagaag 300

gcgatcgtcg ccatcgagga ctcgcgcttc tacgagcacg gcgcgatcga cctcaagggc 360

atcctccgcg cggtcaacga gaacgcgcag agcggcggcg tctcccaggg cgcctcgacg 420

ctgacccagc agtacgtgaa gaacgtcttc gtcgaggagg caggggacga cgccgacaag 480

gtcgccgagg ccacccagca gacgatcggc cgcaaggtcc gcgagctgaa attcgccatc 540

cagatcgagg aggagctggg caagaagggc atcctcgaga actacctgaa catcaccgac 600

ttcgggcagc aggcgtacgg catcgaggca gccgcccagc gctacttctc caagccggcc 660

aaggacctga acatccagga gtcggccctc ctcgcgggcc tcgtccagtc gcaaagccgg 720

tacgacccgg tcaacgacga gcaggaggcg gtcaagcggc gcaacaccgt catccagcgg 780

atggcggcgg tccgcgacat caccccccag gaggcggcgg aggcgaagaa ggcccccctc 840

ggcctgaaga tcagccgccc cagcagcggc tgcatcaccg ccgtcaaggg cgccggcttc 900

ttctgcgact acgtgcggcg cgccttcctc accgacccgg tcttcggcaa gaccgccgag 960

gagcgccaga agacctggga gcgcggcggc ctgaccatcc gcaccaccct ggacccgaag 1020

gcccaggagt cggtgcaggc ggccatagag aacggggtct acaaggacga cgaggtcgcc 1080

accgcggtcg ccctggtcga gcccggcacc ggcaagatca ccggaatggg ccagtccagg 1140

ccgtacggct acggcaagaa cgagacggag atgaacctct ccgtcaacgc ctccatgggc 1200

ggcggcgccg gctaccagcc cggctccacc ttcaagccca tcgtggccgc cgccgccctc 1260

gaacgcggca tgccggtgac caagacgtac tcctcgccgt acgagatgcc gtacccgagc 1320

cccgtcgcca cctgctccgg gaactacgtc aacacctcct ccgaggagct ggccaacgag 1380

aacgagaagg aggtcggccc ctactccatg aaggaggcga ccgccctctc ggtcaacacc 1440

tacttcgtgc agatgatcag cgagatcggc acctgcccgg tcatcgagct gtcgaagaag 1500

atgggcatcg agcgctccga cggcaacgac ttcggccagg gcccctccat cgcgctgggc 1560

acccaggagg tctctccgct gacgatggcc tccgcgtacg ccaccttcgc cacccggggc 1620

acgtactgct cgccgatcgc catcgcctcc atcaccggcc cggacaagaa gtcgatgccg 1680

gtgccgaagt cgacctgcac caaggtgatg tcggagaaga ccgccgacac cgtcaacacc 1740

ctgctgcgcg gcgtggtcga ggacggcacc ggccgccagg cgggcctcca gggccgcgcc 1800

agcgccggca agaccggaac caccgacttc cgctacgccg cctggttcgc cggctacacc 1860

ccgaacctct ccggcgccgt ctgggtcggc gacccgcagc acaagcgcca gatgaccaac 1920

atcaccatcg gcggccgccc gtacgacaag gtcttcggcg gtgaggtccc cggaccgatc 1980

tggaagaccg cgatggccgg tgccctggag ggcaaggaag cccccggctt caacctggtc 2040

gacatccccg agcccgacaa gcccggcaag aacaagccca accgccccgg cggcggcaac 2100

gggaacggcg ggggcgggaa cggcggcggc gacaacaagc ccggcggcaa ccgtcccggc 2160

ggcggcgaca acccgccccc ggacatccag ctcccgggcg actggttcgg cggcggccag 2220

ggccgctga 2229

Claims

1.一种在白色链霉菌中高效异源合成默诺霉素A的方法，其特征在于，通过基因工程的手段得到了默诺霉素A生物合成基因簇并进行启动子的优化后得到默诺霉素A异源合成菌株Streptomyces albus；再通过代谢工程的手段在菌株Streptomyces albus中导入默诺霉素A抗性基因MaPBP来增强宿主对默诺霉素A的耐受能力，所得菌株发酵培养得到默诺霉素A。

2.根据权利要求1所述的在白色链霉菌中高效异源合成默诺霉素A的方法，其特征在于，所述默诺霉素A生物合成基因簇包括默诺霉素生物合成基因簇cluster 1和包含moeA4&moeB4&moeC4和moeR5&moeS5五个基因的cluster 2；其中，moeA4&moeB4&moeC4基因序列如SEQ ID NO.11所示，moeR5&moeS5序列如SEQ ID NO.12所示。

3.根据权利要求1所述的在白色链霉菌中高效异源合成默诺霉素A的方法，其特征在于，所述启动子为Promoter 6、KasOp*、PermE*和Promoter 2，序列分别如SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.37所示；所述默诺霉素A抗性基因MaPBP的序列为SEQ ID NO.52所示。

4.根据权利要求1所述的在白色链霉菌中高效异源合成默诺霉素A的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：

S3、通过λ-red同源重组技术对cluster 1和cluster 2基因簇进行组装，获得包含默诺霉素A完整生物合成基因簇的

位点整合型质粒I；

S4、对

位点整合型质粒I中的moeJ5、moeE5、moeP5和moeGT5的启动子进行Promoter 6、KasOp*、PermE*和Promoter 2的强启动子替换得到

位点整合型质粒II；

S5、将步骤S3和步骤S4构建得到的质粒I和质粒II分别通过接合转移的手段导入野生型受体菌株Streptomyces albus中，获得默诺霉素A异源合成菌株I和Ⅱ；

S6、构建用于提高菌株Ⅱ耐受性的默诺霉素A抗性基因MaPBP的

位点整合型质粒Ⅲ；

S7、将步骤S6构建得到的质粒Ⅲ接合转移导入受体菌株Ⅱ中，得到默诺霉素A高效异源合成菌株Ⅲ；

S8、发酵培养所述菌株I、菌株Ⅱ、菌株Ⅲ。

5.根据权利要求4所述的白色链霉菌中高效异源合成默诺霉素A的方法，其特征在于，步骤S3包括如下步骤：

S31、在默诺霉素生物合成基因簇cluster 2的两端构建和cluster 1基因簇两端有45bp同源臂以及酶切位点MunI的质粒pJQK553，其中包含作为筛选标记的抗性基因卡那霉素；

S32、用MunI限制内切酶处理质粒pJQK553，得到包含cluster 2基因簇的10kb基因片段；将包含cluster 1的质粒pJQK455和包含cluster 2基因簇的10kb基因片段通过电转导入λ-red同源重组菌株GB08中，10％阿拉伯糖诱导线性环形重组发生，通过阿伯拉霉素和卡那霉素抗生素筛选得到阳性克隆质粒I，即所述

位点整合型质粒I。

6.根据权利要求5所述的白色链霉菌中高效异源合成默诺霉素A的方法，其特征在于，步骤S4包括如下步骤：

S42、将cassette 1和cassette 2分别通过电转导入含有质粒pJQK455的λ-red同源重组菌株GB08中，10％阿拉伯糖诱导重组发生，通过FRT同源重组敲除cassettes中的氯霉素和卡那霉素抗性基因后得到质粒pJQK552；

S42、将S32中包含cluster 2基因簇的10kb基因片段与质粒pJQK552电转导入λ-red同源重组菌株GB08中，10％阿拉伯糖诱导线性环形重组发生，通过阿伯拉霉素和卡那霉素抗生素筛选得到阳性克隆质粒II，即所述

位点整合型质粒II。

7.根据权利要求6所述的白色链霉菌中高效异源合成默诺霉素A的方法，其特征在于，步骤S41中，Promoter 6加强moeJ5及其下游基因的转录，KasOp*加强moeE5及其下游基因转录，PermE^*加强moeP5及其下游基因的转录，Promoter 2加强moeGT5及其下游基因的转录。

8.根据权利要求4所述的白色链霉菌中高效异源合成默诺霉素A的方法，其特征在于，步骤S6中，默诺霉素A抗性基因MaPBP来源于Streptomyces albus J1074，将第200位的苯丙氨酸突变为天冬氨酸，238位的脯氨酸突变为谷氨酰胺。

9.根据权利要求4所述的白色链霉菌中高效异源合成默诺霉素A的方法，其特征在于，步骤S8中，所述发酵培养是将所述默诺霉素异源合成菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的孢子接种于R5固体培养基中，30℃培养168h后得发酵固体板。

10.一株高效异源合成默诺霉素A的白色链霉菌Streptomyces albus J1074-LX03，保藏编号为CGMCC NO.20985。