CN112402685B - 一种高效止血抗菌多功能材料的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效止血抗菌多功能材料的制备及其应用。材料按与创面接触由内而外分为止血抑菌层,粘附层,检测层,抑菌层,其中粘附层可粘附皮肤防止血液外流,而止血抑菌层可快速吸收血液水分促使血小板浓度增大,进一步提高了凝血效果;检测层通过负载报告分子,使其具备对细菌感染检测响应的能力,其原理是报告分子与致病菌分泌的酶发生反应生成荧光分子;负载了抑菌剂的防护层可对细菌灭活。本专利发明的多功能材料从创口止血到创口愈合可进行全程干预,避免了细菌的侵入感染,同时避免了反复更换敷料对创口造成的二次损伤,最大程度保障了患者的生命安全。
Description
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域,更具体的说涉及一种高效止血抗菌多功能材料的制备及其应用,用于皮肤创面的快速有效止血、细菌感染响应、抗菌及促进伤口愈合。
背景技术
随着抗生素类药物的广泛应用,细菌耐药性问题日益严重,给临床治疗带来极大的挑战。光敏剂是一种在适当波长范围光源的激发下,依靠氧气的参与,产生单线态氧等活性氧物质,可原位进行细菌杀灭的抗菌药物,这种光动力抗菌疗法由于具有不易产生细菌耐药性,依靠光能驱动而不消耗光敏剂本身的优势,成为近几年最有前景的抗菌治疗方法之一。
止血材料对伤口的愈合有一定的促进作用。目前市场上的止血材料存在很多不足,其功能单一,一方面其无法在快速止血的同时防止细菌感染,这增加了患者因感染而死亡的风险;另一方面其无法在后续创口愈合过程中及时对细菌侵入感染进行响应报告,并在不反复更换伤口敷料的情况下原位抗菌,这对创口愈合是极大的隐患,原位抗菌意味着不用更换止血材料,极大的避免了创口的二次损伤,对创口愈合有极大的促进作用。因此医疗卫生领域对集快速止血、细菌感染响应、原位抗菌的多功能医用材料是迫切需求的。
基于上述问题,本发明采用生物相容性的材料为基体设计了一种高效止血抗菌多功能材料,其中通过酶切报告分子来实现对细菌的侵入响应检测,当有细菌感染时,酶切报告分子与细菌分泌的β-葡萄糖醛酸酶(β-GUS)进行酶切反应生成荧光报告分子,在紫外灯(λ=365nm)下以颜色显现的形式报告细菌感染;通过负载的光敏剂对细菌进行原位光动力抗菌,同时依靠多孔淀粉接枝丙烯酸制备的共聚物的吸水能力以及单宁酸与聚乙二醇衍生物混合制备的胶粘剂的粘附能力实现对伤口的快速止血与保护。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效止血抗菌多功能材料的制备方法及其应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
1.一种高效止血抗菌多功能材料它为四层圆片结构,按与创面接触由内而外分为止血抑菌层1,粘附层2,检测层3,防护抑菌层4,其中止血抑菌层的直径小于其他三层的直径;所述的止血抑菌层以多孔淀粉接枝丙烯酸形成的共聚物为基材,基材内分布有抗菌剂;所述的粘附层为单宁酸与聚乙二醇衍生物共混组成的胶粘剂;所述的检测层以细菌纤维素膜为基材,基材的纳米纤维内分布有酶切报告分子;所述防护抑菌层以静电纺丝法制备的醋酸纤维素膜为基体,基体的纳米纤维内分布有抗菌剂;所述抗菌剂包括各类抗生素、无机抗菌材料(如纳米银等)、天然抗菌材料(如甲壳素等)以及光敏分子(如金丝桃素、卟啉、2,2‘:5',2”-三噻吩-5-甲醛以及季铵盐等)的一种或几种的组合,所述的聚乙二醇衍生物包括聚乙二醇、醛基化的聚乙二醇的一种或几种的组合,所述的酶切报告分子包括4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷(MUD)、4-甲基伞型酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)的一种或几种的组合。
2.一种高效止血抗菌多功能材料的制备方法,操作步骤如下:
1)止血抑菌层的制备
1.1)称取一定质量的淀粉置于装有质量体积百分浓度为0.05%~0.5%的NaOH溶液的烧杯中,磁力搅拌1~4h以去除蛋白。最后用标准检验筛过滤以除去粗纤维,过滤后烘干得到预处理淀粉,称取一定质量的预处理淀粉置于三颈烧瓶中,向其中加入质量体积百分浓度为1%~5%的盐酸以配成质量体积百分浓度为20%~60%的淀粉乳液,然后在温度为45~65℃下搅拌30~100min,最后用饱和的碳酸氢钠溶液调节其pH值至7.0,过滤、水洗三次后烘干得到酸水解淀粉,称取5g酸水解淀粉置于含有pH=4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的三颈烧瓶中,于20~80℃预热0.5h后,加入用少量磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释的α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶溶液,使得复合酶加入量为水解量的20%~70%,在一定温度下反应10~30h后加入5~6mL质量体积百分浓度为4%的NaOH溶液终止反应,过滤、水洗三次后烘干得到酸-酶解淀粉。
1.2)在三颈烧瓶内加入2.5~3g的酸-酶解淀粉和去离子水混合搅拌,再将配制好的丙烯酸中和度为40%~80%的混合液移入三颈烧瓶内,一侧安装玻璃塞,另一侧通氮气,于30~80℃下依次加入交联剂、引发剂,搅拌至溶液黏稠,停止搅拌,于氮气保护下反应1~5h,反应结束后将产品干燥后用水和乙醇反复洗涤,随后将其浸入抗菌剂如金丝桃素溶液或将其浸入2,2‘:5',2”-三噻吩-5-甲醛溶液内搅拌24h,将负载有抗菌剂或2,2‘:5',2”-三噻吩-5-甲醛溶液的产品干燥,最终得到止血抑菌层材料。
2)粘附层的制备
2.1)取0.5~2g聚乙二醇加入到溶解有8~32g的4-羧基苯甲醛,95~380g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及30~120g的4-二甲氨基吡啶的无水二氯甲烷溶液中,在氮气保护下于37℃下搅拌反应0.5~2天,随后将产物用1mol/L盐酸溶液、饱和碳酸氢钠以及盐水洗涤,将有机层真空干燥后得到醛基化聚乙二醇。
2.2)吸取300~600uL浓度为1g/mL的醛基化聚乙二醇透明溶液与2000uL浓度为1g/mL的单宁酸透明溶液充分混合后高速离心去除上清液,收集沉淀下来的产品得到粘附层的胶粘剂。
3)检测层的制备
3.1)将木醋杆菌接种在锥形瓶内的培养基中,充分振荡后将接种后的培养基倒入培养盘中25~30℃恒温静置培养7~10天,然后将得到的细菌纤维素膜用水洗涤,并在0.5%~4%的氢氧化钠溶液中煮沸40min,然后再用水洗涤干净并高压灭菌,最终得到细菌醋酸纤维素湿膜。
3.2)将得到的膜干燥后浸入酶切报告分子溶液中24h,最后取出负载有4-甲基伞型酮-β-D-葡糖苷酸的细菌纤维素膜,将其适当冷冻干燥后得到检测层材料。
4)防护抑菌层的制备
以丙酮和N,N-二甲基乙酰胺按1.5:1~2.5:1比例混合液为溶剂配制质量体积百分浓度为14-20%的醋酸溶液,并加入一定量的抗菌剂如金丝桃素,混合搅拌后通过静电纺丝法在检测层的细菌纤维素膜上制备一层负载抗菌剂如金丝桃素的醋酸纤维素膜,该层为防护抑菌层。
5)各功能层的组装
将制备的止血抑菌层、粘附层、检测层和防护抑菌层进行组装连接,止血抑菌层与检测层通过粘附层的胶粘剂进行胶粘,防护抑菌层通过静电纺丝法负载在检测层一侧,由此得到组装的一种高效止血抗菌多功能材料。
3.一种高效止血抗菌多功能材料的应用原理及其应用实验:
1)止血抑菌层通过负载的光敏剂对细菌进行原位光动力抗菌,同时依靠多孔淀粉接枝丙烯酸制备的共聚物的吸水能力吸收血液中的水分提高血小板浓度来加快凝血;粘附层中单宁酸与醛基化的聚乙二醇混合制备的胶粘剂依靠其氢键形成的粘附能力和醛基与皮肤组织氨基的席夫碱反应形成的粘附能力来保护伤口,双重机制下阻止血液外流,从而进一步促进凝血;检测层通过酶切报告分子来实现对细菌的侵入响应检测,当有细菌感染时,酶切报告分子4-甲基伞型酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)或4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷(MUD)与细菌分泌的β-葡萄糖醛酸酶进行酶切反应生成荧光分子4-甲基伞形酮,在紫外灯(λ=365nm)下以颜色显现的形式报告细菌感染;防护抑菌层通过负载光敏剂防止细菌从外部侵入材料和创口造成伤口感染,必要时通过光源照射进行细菌杀灭保护。
2)将MUG或MUD与菌液在96孔板内充分接触,观察其荧光变化以验证其检测细菌感染能力,然后再将检测层截取为直径为10mm的圆片与细菌充分接触并观察检测层的荧光变化以评估其检测细菌感染能力。
3)将光敏剂进行光动力抗菌,并设置光照组、黑暗组以及空白组,以此证明光敏剂的光动力抗菌效果,然后再将制备得到的高效止血抗菌多功能材料进行动物模型实验,评估其光动力治疗效果,并对小鼠伤口组织进行观察,评估其创口愈合能力。
4)用多孔淀粉接枝丙烯酸形成的共聚物以倾斜法进行体外凝血实验,从加入共聚物到血液中开始计时直到倾斜小瓶血液不再流动为止记录下血液凝固时间,设置空白组及阳性对照组对比评估其体外凝血能力。将粘附层的胶粘剂与两块猪皮胶粘,并用万能拉力试验机测试其最大粘附力以评估其依靠粘附力对止血过程的促进作用。将大鼠麻醉并进行断尾处理,用组装好的多功能材料紧紧包裹其出血部位,设置的空白组不对出血部位做任何处理,记录下出血量,以此评估材料的止血能力。
本发明与现有技术相比,具有如下优点和技术效果:
1)本发明制备的一种高效止血抗菌多功能材料具备良好的生物相容性,其负载的药物都无毒副作用,且材料适用于多种形貌创面,对复杂难以处理的伤口可及时止血并保护创口。
2)本发明的止血机制为多重止血机制,即多孔淀粉接枝丙烯酸形成的共聚物依靠吸水能力促进血小板浓缩而加速凝血,同时单宁酸和醛基化聚乙二醇形成的胶粘剂依靠氢键形成的物理粘附和醛基与皮肤组织氨基形成的席夫碱化学粘附协同作用,共同粘附皮肤,防止血液不断外流,进一步提高了凝血效果。
3)本发明制备的材料是多层多功能性的医用材料,在对伤口快速止血的同时,能有效防止细菌侵入,在伤口愈合过程中能及时检测到细菌感染,并且在细菌感染的情况下,能在不更换材料的前提下进行光照抗菌,使创口免受二次损伤。
附图说明
图1是本发明制备的一种高效止血抗菌多功能材料的结构及其动物模型示意图。
图中,1为止血抑菌层,2为粘附层,3为检测层,4为防护抑菌层,可将材料以建立动物模型的方式评估其光动力治疗效果。
图2是MUG、MUD对铜绿假单胞菌荧光响应检测的效果图。
图中,A为铜绿假单胞菌菌液,B为MUG和铜绿假单胞菌混合液,C为MUD和铜绿假单胞菌混合液。
图3是负载有酶切报告分子的细菌纤维素膜在紫外灯(λ=365nm)下检测细菌显色响应的效果图。
图中,A1、A2、A3依次为负载MUG、负载MUD以及空白的细菌纤维素膜对铜绿假单胞菌的荧光检测响应,B1、B2、B3依次为负载MUG、负载MUD以及空白的细菌纤维素膜对金黄色葡萄球菌的荧光检测响应,C1、C2、C3依次为负载MUG、负载MUD以及空白的细菌纤维素膜对大肠杆菌的荧光检测响应。
图4是以2,2‘:5',2”-三噻吩-5-甲醛为光敏剂对铜绿假单胞菌进行光动力抗菌的效果图。
图中,A为光敏剂光动力治疗组,B为光敏剂黑暗处理组,C为未加入光敏剂的空白对照组。
图5是对小鼠创口光动力治疗的表皮组织学对比图。
图中,A为无干预空白组,B为细菌感染组,C为光照组,D为黑暗组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。以下为本发明的实施示例,并不用以限制本发明,凡在本发明的基础上所做的任何修改、替换和改进等,均包含在本发明的保护范围之内。
一种高效止血抗菌多功能材料它为四层圆片结构如图1所示,按与创面接触由内而外分为止血抑菌层1,粘附层2,检测层3,防护抑菌层4,其中止血抑菌层的直径小于其他三层的直径;所述的止血抑菌层以多孔淀粉接枝丙烯酸形成的共聚物为基材,基材内分布有抗菌剂;所述的粘附层为单宁酸与聚乙二醇衍生物共混组成的胶粘剂;所述的检测层以细菌纤维素膜为基材,基材的纳米纤维内分布有酶切报告分子;所述防护抑菌层以静电纺丝法制备的醋酸纤维素膜为基体,基体的纳米纤维内分布有抗菌剂;所述抗菌剂包括各类抗生素、无机抗菌材料(如纳米银等)、天然抗菌材料(如甲壳素等)以及光敏分子(如金丝桃素、卟啉、2,2‘:5',2”-三噻吩-5-甲醛以及季铵盐等)的一种或几种的组合,所述的聚乙二醇衍生物包括聚乙二醇、醛基化的聚乙二醇的一种或几种的组合,所述的酶切报告分子包括4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷(MUD)、4-甲基伞型酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)的一种或几种的组合。
一种高效止血抗菌多功能材料的应用原理及其应用实验:
1)止血抑菌层通过负载的光敏剂对细菌进行原位光动力抗菌,同时依靠多孔淀粉接枝丙烯酸制备的共聚物的吸水能力吸收血液中的水分提高血小板浓度来加快凝血;粘附层中单宁酸与醛基化的聚乙二醇混合制备的胶粘剂依靠其氢键形成的粘附能力和醛基与皮肤组织氨基的席夫碱反应形成的粘附能力来保护伤口,双重机制下阻止血液外流,从而进一步促进凝血;检测层通过酶切报告分子来实现对细菌的侵入响应检测,当有细菌感染时,酶切报告分子4-甲基伞型酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)或4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷(MUD)与细菌分泌的β-葡萄糖醛酸酶进行酶切反应生成荧光分子4-甲基伞形酮,在紫外灯(λ=365nm)下以颜色显现的形式报告细菌感染,如图2所示;防护抑菌层通过负载光敏剂防止细菌从外部侵入材料和创口造成伤口感染,必要时通过光源照射进行细菌杀灭保护。
2)将MUG或MUD与菌液在96孔板内充分接触,观察其荧光变化以验证其检测细菌感染能力,然后再将检测层截取为直径为10mm的圆片与细菌充分接触并观察检测层的荧光变化以评估其检测细菌感染能力如图3所示。
3)将光敏剂进行光动力抗菌,并设置光照组、黑暗组以及空白组,以此证明光敏剂的光动力抗菌效果,如图4所示。然后再将制备得到的高效止血抗菌多功能材料进行动物模型实验,评估其光动力治疗效果,并对小鼠伤口组织进行观察,评估其创口愈合能力如图5所示。
4)用多孔淀粉接枝丙烯酸形成的共聚物以倾斜法进行体外凝血实验,从加入共聚物到血液中开始计时直到倾斜小瓶血液不再流动为止记录下血液凝固时间,设置空白组及阳性对照组对比评估其体外凝血能力。将粘附层的胶粘剂与两块猪皮胶粘,并用万能拉力试验机测试其最大粘附力以评估其依靠粘附力对止血过程的促进作用。将大鼠麻醉并进行断尾处理,用组装好的多功能材料紧紧包裹其出血部位,设置的空白组不对出血部位做任何处理,记录下出血量,以此评估材料的止血能力。
实施例1
一种高效止血抗菌多功能材料的制备方法,包括以下步骤:
1)止血抑菌层的制备
1.1)称取15g的淀粉置于装有0.05%(w/v)的NaOH溶液的烧杯中,磁力搅拌4h以去除蛋白。最后用标准检验筛过滤以除去粗纤维,过滤后烘干得到预处理淀粉。称取7g的预处理淀粉置于三颈烧瓶中,向其中加入浓度1%(w/v)的盐酸以配成浓度20%(w/v)的淀粉乳液,然后在45℃下加入搅拌100min,最后用饱和的碳酸氢钠溶液调节其pH值至7.0,过滤、水洗三次后烘干得到酸水解淀粉。称取5g的酸水解淀粉置于含有磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH=4.0)的三颈烧瓶中,于80℃预热0.5h后,加入用少量磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释的α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶溶液,使得复合酶加入量为水解量的20%,在40℃下反应30h后加入5mL的NaOH(4%)溶液终止反应,过滤、水洗三次后烘干得到酸-酶解淀粉。
1.2)在三颈烧瓶内加入3g酸-酶解淀粉和20mL去离子水混合搅拌,再将配制好的丙烯酸中和度为40%的混合液移入三颈烧瓶内,一侧安装玻璃塞,另一侧通氮气,于30℃下依次加入交联剂、引发剂,搅拌至溶液黏稠,停止搅拌,于氮气保护下反应5h。反应结束后将产品干燥后用水和乙醇反复洗涤,随后将其浸入金丝桃素溶液内搅拌24h,将负载有金丝桃素的产品干燥,最终得到止血抑菌层材料。
2)粘附层的制备
2.1)取0.5g聚乙二醇加入到溶解有8mg 4-羧基苯甲醛,95mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCl)以及30mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)的无水二氯甲烷溶液中,在氮气保护下于37℃下搅拌反应0.5天,随后将产物用1mol/L盐酸溶液、饱和碳酸氢钠以及盐水洗涤,将有机层真空干燥后得到醛基化聚乙二醇。
2.2)吸取600uL的醛基化聚乙二醇透明溶液(1g/mL)与1200uL单宁酸透明溶液(1g/mL)充分混合后高速离心去除上清液,收集沉淀下来的产品得到粘附层的胶粘剂。
3)检测层的制备
3.1)将木醋杆菌接种在锥形瓶内的培养基中,充分振荡后将接种后的培养基倒入培养盘中25℃恒温静置培养10天,然后将得到的细菌纤维素膜用水洗涤,并在0.5%的氢氧化钠溶液中煮沸40min,然后再用水洗涤干净并高压灭菌,最终得到细菌醋酸纤维素湿膜。
3.2)将得到的膜干燥后浸入酶切报告分子溶液中24h,最后取出负载有MUG的细菌纤维素膜,将其适当冷冻干燥后得到检测层材料。
4)防护抑菌层的制备
以丙酮和N,N-二甲基乙酰胺的体积比1.5:1混合液为溶剂配制14%的醋酸溶液,并加入5mg的卟啉,混合搅拌后通过静电纺丝法在检测层的细菌纤维素膜上制备一层负载卟啉的醋酸纤维素膜,该层为防护抑菌层。
5)各功能层的组装
将制备的止血抑菌层、粘附层、检测层和防护抑菌层进行组装连接,止血抑菌层与检测层通过粘附层的胶粘剂进行胶粘,防护抑菌层通过静电纺丝法负载在检测层一侧,由此得到组装的一种高效止血抗菌多功能材料。
实施例2
1)止血抑菌层的制备,操作步骤如下:
1.1)称取15g的淀粉置于装有0.2%(w/v)的NaOH溶液的烧杯中,磁力搅拌2h以去除蛋白。最后用标准检验筛过滤以除去粗纤维,过滤后烘干得到预处理淀粉。称取7g的预处理淀粉置于三颈烧瓶中,向其中加入浓度3%(w/v)的盐酸以配成浓度40%(w/v)的淀粉乳液,然后在50℃下加入搅拌70min,最后用饱和的碳酸氢钠溶液调节其pH值至7.0,过滤、水洗三次后烘干得到酸水解淀粉。称取5g的酸水解淀粉置于含有磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH=4.0)的三颈烧瓶中,于40℃预热0.5h后,加入用少量磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释的α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶溶液,使得复合酶加入量为水解量的40%,在40℃下反应18h后加入5mL的NaOH(4%)终止反应,过滤、水洗三次后烘干得到酸-酶解淀粉。
1.2)在三颈烧瓶内加入2.772g的酸-酶解淀粉和20mL去离子水混合搅拌,再将配制好的丙烯酸中和度为80%的混合液移入三颈烧瓶内,一侧安装玻璃塞,另一侧通氮气,于50℃下依次加入交联剂、引发剂,搅拌至溶液黏稠,停止搅拌,于氮气保护下反应2h。反应结束后将产品干燥后用水和乙醇反复洗涤,随后将其浸入2,2‘:5',2”-三噻吩-5-甲醛溶液内搅拌24h,将负载有2,2‘:5',2”-三噻吩-5-甲醛的产品干燥,最终得到止血抑菌层材料。
2)粘附层的制备
2.1)取1g聚乙二醇加入到溶解有15mg 4-羧基苯甲醛,190mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCl)以及60mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)的无水二氯甲烷溶液中,在氮气保护下于37℃下搅拌反应1天,随后将产物用1mol/L盐酸溶液、饱和碳酸氢钠以及盐水洗涤,将有机层真空干燥后得到醛基化聚乙二醇。
2.2)吸取310uL的醛基化聚乙二醇透明溶液(1g/mL)与690uL的单宁酸透明溶液(1g/mL)充分混合后高速离心去除上清液,收集沉淀下来的产品得到粘附层的胶粘剂;
3)检测层的制备
3.1)将木醋杆菌接种在锥形瓶内的培养基中,充分振荡后将接种后的培养基倒入培养盘中30℃恒温静置培养7天,然后将得到的细菌纤维素膜用水洗涤,并在1%的氢氧化钠溶液中煮沸40min,然后再用水洗涤干净并高压灭菌,最终得到细菌醋酸纤维素湿膜。
3.2)将得到的膜干燥后浸入酶切报告分子溶液中24h,最后取出负载有MUG的细菌纤维素膜,将其适当冷冻干燥后得到检测层材料;
4)防护抑菌层的制备
以丙酮和N,N-二甲基乙酰胺的体积比2:1混合液为溶剂配制16%的醋酸溶液,并加入2mg的2,2‘:5',2”-三噻吩-5-甲醛,混合搅拌后通过静电纺丝法在检测层的细菌纤维素膜上制备一层负载2,2‘:5',2”-三噻吩-5-甲醛的醋酸纤维素膜,该层为防护抑菌层。
5)各功能层的组装
将制备的止血抑菌层、粘附层、检测层和防护抑菌层进行组装连接,止血抑菌层与检测层通过粘附层的胶粘剂进行胶粘,防护抑菌层通过静电纺丝法负载在检测层一侧,由此得到组装的一种高效止血抗菌多功能材料。
实施例3
1)止血抑菌层的制备,操作步骤如下:
1.1)称取14g的淀粉置于装有0.5%(w/v)的NaOH溶液的烧杯中,磁力搅拌1h以去除蛋白。最后用标准检验筛过滤以除去粗纤维,过滤后烘干得到预处理淀粉。称取6g的预处理淀粉置于三颈烧瓶中,向其中加入浓度5%(w/v)的盐酸以配成浓度20%(w/v)的淀粉乳液,然后在65℃下加入搅拌30min,最后用饱和的碳酸氢钠溶液调节其pH值至7.0,过滤、水洗三次后烘干得到酸水解淀粉。称取4g的酸水解淀粉置于含有磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH=4.0)的三颈烧瓶中,于20预热0.5h后,加入用少量磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释的α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶溶液,使得复合酶加入量为水解量的70%,在50℃下反应10h后加入6mL的NaOH(4%)终止反应,过滤、水洗三次后烘干得到酸-酶解淀粉。
1.2)在三颈烧瓶内加入2.5g的酸-酶解淀粉和18mL去离子水混合搅拌,再将配制好的丙烯酸中和度为40%的混合液移入三颈烧瓶内,一侧安装玻璃塞,另一侧通氮气,于80℃下依次加入交联剂、引发剂,搅拌至溶液黏稠,停止搅拌,于氮气保护下反应1h。反应结束后将产品干燥后用水和乙醇反复洗涤,随后将其浸入金丝桃素溶液内搅拌24h,将负载有金丝桃素的产品干燥,最终得到止血抑菌层材料。
2)粘附层的制备
2.1)取2g聚乙二醇加入到溶解有32mg 4-羧基苯甲醛,380mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCl)以及120mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)的无水二氯甲烷溶液中,在氮气保护下于37℃下搅拌反应2天,随后将产物用1mol/L盐酸溶液、饱和碳酸氢钠以及盐水洗涤,将有机层真空干燥后得到醛基化聚乙二醇。
2.2)吸取300uL的醛基化聚乙二醇透明溶液(1g/mL)与600uL的单宁酸透明溶液(1g/mL)充分混合后高速离心去除上清液,收集沉淀下来的产品得到粘附层的胶粘剂。
3)检测层的制备
3.1)将木醋杆菌接种在锥形瓶内的培养基中,充分振荡后将接种后的培养基倒入培养盘中28℃恒温静置培养8天,然后将得到的细菌纤维素膜用水洗涤,并在4%的氢氧化钠溶液中煮沸40min,然后再用水洗涤干净并高压灭菌,最终得到细菌醋酸纤维素湿膜。
3.2)将得到的膜干燥后浸入酶切报告分子溶液中24h,最后取出负载有MUD的细菌纤维素膜,将其适当冷冻干燥后得到检测层材料。
4)防护抑菌层的制备
以丙酮和N,N-二甲基乙酰胺的体积比2.5:1混合液为溶剂配制20%的醋酸溶液,并加入4mg的2,2‘:5',2”-三噻吩-5-甲醛,混合搅拌后通过静电纺丝法在检测层的细菌纤维素膜上制备一层负载2,2‘:5',2”-三噻吩-5-甲醛的醋酸纤维素膜,该层为防护抑菌层。
5)各功能层的组装
将制备的止血抑菌层、粘附层、检测层和防护抑菌层进行组装连接,止血抑菌层与检测层通过粘附层的胶粘剂进行胶粘,防护抑菌层通过静电纺丝法负载在检测层一侧,由此得到组装的一种高效止血抗菌多功能材料。
本发明制备的是一种多功能性的医用材料,其同时具备止血、细菌感染响应报告、光动力抗菌的多种性能,从创口止血到创口愈合可进行全程干预,避免了细菌的侵入感染和因感染而反复更换材料对创口造成的二次损伤,最大程度保障了患者的生命安全。
Claims (3)
1.高效止血抗菌多功能材料,其特征如下 :它为四层圆片结构,按与创面接触由内而外分为止血抑菌层(1),粘附层(2),检测层(3),防护抑菌层(4),其中止血抑菌层的直径小于其他三层的直径;所述的止血抑菌层以多孔淀粉接枝丙烯酸形成的共聚物为基材,基材内分布有抗菌剂;所述的粘附层为单宁酸与聚乙二醇共混组成的胶粘剂;所述的检测层以细菌纤维素膜为基材,基材的纳米纤维内分布有酶切报告分子;所述防护抑菌层以静电纺丝法制备的醋酸纤维素膜为基体,基体的纳米纤维内分布有抗菌剂;所述抗菌剂包括抗生素、无机抗菌材料、天然抗菌材料以及光敏分子的一种或几种的组合,所述的酶切报告分子包括4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷、4-甲基伞型酮-β-D-葡糖苷酸的一种或几种的组合。
2.根据权利要求1所述的高效止血抗菌多功能材料的制备方法,具体步骤如下:
1)止血抑菌层的制备
1.1)称取一定质量的淀粉置于装有质量体积百分浓度为0.05%~0.5%的NaOH溶液的烧杯中,磁力搅拌1~4 h以去除蛋白,最后用标准检验筛过滤以除去粗纤维,过滤后烘干得到预处理淀粉;称取一定质量的预处理淀粉置于三颈烧瓶中,向其中加入质量体积百分浓度为1%~5%的盐酸以配成质量体积百分浓度为20%~60%的淀粉乳液,然后在温度为45~65℃下搅拌30~100 min,最后用饱和的碳酸氢钠溶液调节其pH值至7.0,过滤、水洗三次后烘干得到酸水解淀粉,称取5g酸水解淀粉置于含有pH=4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的三颈烧瓶中,于20~80℃预热0.5 h后,加入用少量磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释的α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶溶液,使得复合酶加入量为水解量的20%~70%,在一定温度下反应10~30h后加入5~6 mL质量体积百分浓度为4%的NaOH溶液终止反应,过滤、水洗三次后烘干得到酸-酶解淀粉;
1.2)在三颈烧瓶内加入2.5~3g的酸-酶解淀粉和去离子水混合搅拌,再将配制好的丙烯酸中和度为40%~80%的混合液移入三颈烧瓶内,一侧安装玻璃塞,另一侧通氮气,于30~80℃下依次加入交联剂、引发剂,搅拌至溶液黏稠,停止搅拌,于氮气保护下反应1~5 h,反应结束后将产品干燥后用水和乙醇反复洗涤,随后将其浸入抗菌剂溶液内搅拌24 h,然后干燥,最终得到止血抑菌层材料;
2)粘附层的制备
2.1)取0.5~2g聚乙二醇加入到溶解有8~32g的4-羧基苯甲醛,95~380g的 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及30~120g的4-二甲氨基吡啶的无水二氯甲烷溶液中,在氮气保护下于37℃下搅拌反应0.5~2天,随后将产物用1 mol/L盐酸溶液、饱和碳酸氢钠以及盐水洗涤,将有机层真空干燥后得到醛基化聚乙二醇;
2.2)吸取300~600 μL 浓度为1 g/mL的醛基化聚乙二醇透明溶液与2000 μL浓度为1g/mL的单宁酸透明溶液充分混合后高速离心去除上清液,收集沉淀下来的产品得到粘附层的胶粘剂;
3)检测层的制备
3.1)将木醋杆菌接种在锥形瓶内的培养基中,充分振荡后将接种后的培养基倒入培养盘中25~30℃恒温静置培养7~10天,然后将得到的细菌纤维素膜用水洗涤,并在0.5%~4%的氢氧化钠溶液中煮沸40 min,然后再用水洗涤干净并高压灭菌,最终得到细菌醋酸纤维素湿膜;
3.2)将得到的膜干燥后浸入酶切报告分子溶液中24 h,最后取出负载有4-甲基伞型酮-β-D-葡糖苷酸的细菌纤维素膜,将其适当冷冻干燥后得到检测层材料;
4)防护抑菌层的制备
以丙酮和N,N-二甲基乙酰胺按1.5:1~2.5:1比例混合液为溶剂配制质量体积百分浓度为14-20%的醋酸溶液,并加入一定量的抗菌剂,混合搅拌后通过静电纺丝法在检测层的细菌纤维素膜上制备一层负载抗菌剂的醋酸纤维素膜,该层为防护抑菌层;
5)各功能层的组装
将制备的止血抑菌层、粘附层、检测层和防护抑菌层进行组装连接,止血抑菌层与检测层通过粘附层的胶粘剂进行胶粘,防护抑菌层通过静电纺丝法负载在检测层一侧,由此得到组装的一种高效止血抗菌多功能材料。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,各功能层通过胶粘或针刺法组合连接。
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