CN112402589B - 一种重组人分泌型ddrgk1的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组人分泌型DDRGK1的应用，本发明经过实验论证，合成重组人分泌型DDRGK1，并应用于制备治疗椎间盘退变、骨折或骨缺损的生物制剂药物，为骨相关疾病的治疗打开了新的思路并取得了较为坚实的科学证据，拓展了重组人分泌型DDRGK1在临床的进一步应用。

Description

一种重组人分泌型DDRGK1的应用

技术领域

本发明属于骨与关节疾病治疗领域，特别涉及一种重组人分泌型DDRGK1的应用。

背景技术

我国人口老龄化不断加剧，老年人口以每年5.2％的速度增加，2017年我国60岁以上老年人口超2.3亿，是世界上唯一一个老年人口过两亿的国家；预计到2050年，中国老年人口将达到4.8亿，约占届时全球老年人口的四分之一。与之相关的老龄人口健康问题也将给我国医疗带来巨大考验，其中以骨与关节疾病(骨关节炎、椎间盘退变、骨质疏松、骨折等)，在我国60岁以上老年人群的发病率高达80％。当然，在WHO的统计下，骨与关节疾病发病率排名第二，仅次于心血管疾病。同时，骨与关节疾病致残率高，导致人力资源丧失，加重医疗负担重。

目前对于骨与关节疾病的治疗已经出现阶梯治疗的概念，即病症较轻的予以药物，病症重，急症等情况采取有创性治疗，从创伤大小又有大多仅能解决部分问题的微创手术治疗(如：关节镜、椎间孔镜等)以及创伤较大但一般一劳永逸的终极手术治疗(如：关节置换、椎间融合等)。对于骨质疏松，往往仅能通过药物进行提升骨量的防治，目前没有有效的手术疗法。

DDRGK1由314个氮基酸组成，其中1-28为信号肽部分，决定DDRGK1在内质网定位或外分泌。DDRGK1(1-114)可与CDK5RAP3结合以调节NF-kB信号，参与内质网应激导致的细胞凋亡[Wu J,Lei G,Mei M,et al.A novel C53/LZAP-interacting protein regulatesstability of C53/LZAP and DDRGK domain-containing Protein 1(DDRGK1)andmodulates NF-kappaB signaling.The Journal of biological chemistry 2010；285:15126-36]。DDRGK1(118-216)与ASC1相互结合，在 Ufmylation系统蛋白相互作用下，实现ASC1的Ufmylation，介导雌激素受体α(ERα)激活后的信号转录[Yoo HM,Kang SH,Kim JY,et al.Modification of ASC1 by UFM1 is crucial for ERalpha transactivation andbreast cancer development.Molecular cell 2014；56:261-74]。DDRGK1的Lys267与UFM1结合，形成Lys-Gly共价交联，因此DDRGK1又被称为UFM1结合蛋白(UFBP1)[Tatsumi K,Sou YS,Tada N,et al.A novel type of E3 ligase for the Ufm1 conjugationsystem.The Journal of biological chemistry 2010；285:5417-27]；同时DDRGK1(216-314)的Lys267同样是与UFL1的结合位点，在这一位点上UFL1催化UFM1与靶蛋白的连接。DDRGK1基因408位点G点突变为A可导致先天性脊柱骨骺发育不良，可能与DDRGK1可抑制SOX9的泛素化-蛋白酶降解有关 [Egunsola AT,Bae Y,Jiang MM,et al.Loss of DDRGK1modulates SOX9 ubiquitination in spondyloepimetaphyseal dysplasia.The Journalof clinical investigation 2017；127:1475-84]。还发现DDRGK1 与IkBa的结合可影响NF-kB通路的活性[Xi P,Ding D,Zhou J,et al.DDRGK1 regulates NF-kappaB activityby modulating IkappaBalpha stability.PloS one 2013；8:e64231]。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组人分泌型DDRGK1的应用，本发明经过实验论证，合成的重组人分泌型DDRGK1可应用于制备治疗椎间盘退变、骨折或骨缺损的药物，为骨与关节疾病的治疗打开了新的思路并取得了较为坚实的科学证据，拓展了重组人分泌型 DDRGK1在临床的进一步应用。

本发明提供了一种重组人分泌型DDRGK1的应用，应用于制备治疗骨与关节相关疾病的药物。

所述重组人分泌型DDRGK1为切除1-28位点的DDRGK1蛋白从定位为细胞膜转变成分泌型的蛋白。

进一步的，所述重组人分泌型DDRGK1通过抑制髓核细胞内ROS，促进细胞外基质蛋白的二硫键形成，最终促进髓核及椎间盘修复。

进一步的，所述重组人分泌型DDRGK1促进骨髓间充质干细胞的成骨能力。

应用于制备治疗椎间盘退变或骨质疏松的药物。

应用于制备治疗骨折或骨缺损的药物。

所述药物以重组人分泌型DDRGK1为活性成分，配以药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂使用。

所述制剂选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。

有益效果

本发明经过实验论证，合成重组人分泌型DDRGK1，并应用于制备治疗椎间盘退变或者制备治疗骨折或骨缺损的药物，为骨与关节疾病的治疗打开了新的思路并取得了较为坚实的科学证据，拓展了重组人分泌型DDRGK1在临床的进一步应用。

附图说明

图1为DDRGK1表达构建体示意图。

图2为DDRGK1分子排阻层析图谱。

图3为将野生型DDRGK1的1-28号位点切除后出现蛋白外分泌减少(左)，同时小鼠胚胎无法发育(右)。

图4为重组人分泌型DDRGK1对小鼠胫骨缺损模型的修复。

图5为重组人分泌型DDRGK1 250ng和600ng刺激大鼠BMSC细胞并诱导成骨的第7天ALP 染色(左)，重组人分泌型DDRGK1 250ng和600ng刺激大鼠BMSC细胞的第14天茜素红染色(右)。

图6为重组人分泌型DDRGK1的2ug挽救大鼠髓核原代细胞在ROS应激下，高密度培养的第21天阿尔新蓝染色。

图7为重组人分泌型DDRGK1的2ug挽救大鼠髓核原代细胞在ROS应激下，DCFH法的活性氧检测。

图8为重组人分泌型DDRGK1的30ug/ml使用DTNB、β-ME、叔丁基过氧化氢法，测定促进二硫键形成。

图9为重组人分泌型DDRGK1对ATDC5软细胞系的作用。

图10上图为m-BMSC在重组人分泌型DDRGK1作用下的成骨分化培养7天和14天后ALP 染色的镜下观(左)及大体观(右)；

图10下图为m-BMSC在重组人分泌型DDRGK1作用下的成骨分化培养21天后茜素红染色的大体观(左)及镜下观(右)；

其中，M+D：m-BMSC+重组人分泌型DDRGK1；M：m-BMSC。

图11左图为h-BMSC在重组人分泌型DDRGK1作用下的成骨分化培养7天和14天后ALP 染色的大体观；右图为m-BMSC在重组人分泌型DDRGK1作用下的成骨分化培养21天后茜素红染色的大体观(左)及镜下观(右)；

其中，H+D：h-BMSC+重组人分泌型DDRGK1；M：h-BMSC。

图12上图为MC3T3-E1在重组人分泌型DDRGK1作用下的成骨分化培养7天和14天后ALP 染色的大体观；

图12下图为MC3T3-E1在重组人分泌型DDRGK1作用下的成骨分化培养21天后茜素红染色的镜下观(左)及大体观(右)；

其中，DDRGK1：MC3T3-E1+重组人分泌型DDRGK1；对照组：MC3T3-E1。

图13为重组人分泌型DDRGK1对小鼠骨髓间充质干细胞(m-BMSC)成骨标志mRNA的PCR 检测。

图14为重组人分泌型DDRGK1对小鼠MC3T3-E1细胞系成骨标志mRNA的PCR检测。

图15为重组人分泌型DDRGK1对小鼠颅骨缺损模型的修复。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)实验材料：

人源DDRGK1基因(金唯智生物公司合成并针对人类进行密码子优化)。

Expi293F细胞(赛默飞世尔,A14527)。

pcDNA3.4-HHC质粒(上海交通大学医学院附属第九人民医院精准医学研究院曹禹研究组改造)。

分子排阻层析柱(GE,Superdex 200Increase 10/300GL)。

Ni Smart Beads 6FF亲和层析介质(天地人和，SA036100)。

烟草蚀纹病毒蛋白酶TEV(上海交通大学医学院附属第九人民医院精准医学研究院曹禹研究组重组表达制备)。

SPINX离心过滤器(百赛)。

大鼠骨髓间充质干细胞BMSC：(上海交通大学医学院附属第九人民医院上海市骨科内植物重点实验室)。

293细胞培养基(永联生物科技有限公司，UP0050)。

转染试剂PEI MAX(Polyscience，24765)。

大鼠髓核细胞：(上海交通大学医学院附属第九人民医院上海市骨科内植物重点实验室)。

ITS-F12培养基：(上海交通大学医学院附属第九人民医院上海市骨科内植物重点实验室)。

小鼠骨髓间充质干细胞m-BMSC：(上海交通大学医学院附属第九人民医院上海市骨科内植物重点实验室)。

人骨髓间充质干细胞h-BMSC：(上海交通大学医学院附属第九人民医院上海市骨科内植物重点实验室)。

小鼠MC3T3-E1细胞系：(上海交通大学医学院附属第九人民医院上海市骨科内植物重点实验室)。

(2)实验方法

①重组表达载体的构建和目的蛋白的表达

人源DDRGK1基因(NCBI参考序列：NM_023935.2)由金唯智生物公司经密码子优化后合成。如图1所示，PCR获得了编码删除第1-28位氨基酸残基的截短型人源DDRGK1 cDNA片段(对应蛋白序列AS AGQEPLHNEE LAGAGRVAQP GPLEPEEPRA GGRPRRRRDL GSRLQAQRRAQRVAWAEADE NEEEAVILAQ EEEGVEKPAE THLSGKIGAK KLRKLEEKQA RKAQREAEEA EREERKRLESQREAEWKKEE ERLRLEEEQK EEEERKAREE QAQREHEEYL KLKEAFVVEE EGVGETMTEE QSQSFLTEFINYIKQSKVVL LEDLASQVGL RTQDTINRIQ DLLAEGTITG VIDDRGKFIY ITPEELAAVA NFIRQRGRVSIAELAQASNS LIAWGRESPA QAPA)，该片段经AscI/NotI双酶切后克隆到实验室改造的pCDNA3.4质粒上，基因序列N端连接出膜信号肽MKTIIALSYIFCLVFA，C端连接TEV酶切位点ENLYFQG和纯化标签HHHHHHHH。

Expi293F细胞于37℃，110rpm，5％CO₂的条件下进行悬浮培养，当细胞数达到每毫升 2.5×106密度后进行转染。使用1mg表达质粒DNA转染1L细胞，其中表达质粒和转染试剂PEI MAX以1:3的比例(w/w)在100ml新鲜培养基中预混合，孵育30分钟后全部加入 1LExpi293F细胞中继续保持原条件进行悬浮培养，在转染72小时后收集细胞培养物上清液进行蛋白纯化。

②蛋白纯化

对所述细胞培养物以1500g转速离心10分钟并收集上清液，然后将所得上清液以5000g 转速再次离心20分钟并收集上清。取2mL Ni Smart Beads 6FF纯化介质装入纯化空柱，首先用约20个柱体积的去离子水清洗该纯化介质，然后用约20个柱体积的缓冲液(20mMHepes pH 8.0,150mM NaCl,10％Glycerol)对该纯化介质进行预平衡。此后，以约0.5ml/min的流速将上清液加载至预平衡的纯化介质。待上清液全部穿流完毕以后，用约20个柱体积的缓冲液洗涤该纯化介质。最后，使用约3个柱体积的缓冲液将介质重悬至离心管中，并向其中加入约0.4mg的TEV蛋白酶，置于旋转摇床上进行4℃过夜酶切处理。

将所述离心管中过夜酶切的样品重新加载至空的纯化柱容器中并收集该酶切处理后的穿流液，然后用约2个柱体积的缓冲液分两份缓慢流过纯化介质并采集穿流液，最后合并全部穿流液。将合并后的穿流液浓缩至1ml并将样品经SPINX离心过滤器过滤，然后用分子排阻层析柱(Superdex 200Increase 10/300GL,GE Healthcare)进行进一步分离纯化，如图2所示。分子排阻层析柱预先装于4℃下的AKTA PURE仪器上并使用20mM Hepes pH8.0,150mM NaCl作为流动相进行预平衡。经SDS-PAGE检验蛋白纯度后，收集包含DDRGK1蛋白的级分(fplc对应的蛋白出峰位置)进行后续实验。

③按本领域常规方法构建CRISPR/Cas9体系下DDRGK1(1-28位敲除)的IVF小鼠。

④成骨分化

使用SD大鼠、C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基试剂盒(Cyagen)，按照试剂盒要求配置SD大鼠、C57BL/6小鼠骨髓间质干细胞成骨诱导分化完全培养基。培养孔板表面包被0.1％明胶，SD大鼠、C57BL/6小鼠骨髓间质干细胞按照2×10⁴cells/cm²接种于孔板中，加入成骨诱导分化完全培养基，同时给予不同浓度重组人分泌型DDRGK1。每隔 3天换用新鲜的成骨诱导分化完全培养基换液。诱导7周后，ALP染色。诱导14周后，进行阿尔新蓝染色。

⑤成软骨分化

使用ITS-F12培养基。小鼠软骨原代细胞及SD大鼠髓核细胞按照1.5×10⁷cells/ml，10ul 接种于孔板中，加入ITS-F12培养基，同时给予不同浓度重组人分泌型DDRGK1。每隔3天换用ITS-F12培养基，诱导9天后，进行阿尔新蓝染色。

⑥DCFH法检测活性氧

孔板内种适量细胞。使用按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。加入双氧水5分钟，后使用重组人分泌型DDRGK1 2ug挽救25分钟。镜下绿色荧光观察。

⑦小鼠胫骨缺损、颅骨缺损修复模型

取8周C57雄性小鼠完成胫骨缺损模型：麻醉后取仰卧位，右下肢脱毛，酒精或碘伏棉球消毒三遍，以膝关节为解剖标志，使用无菌手术刀或剪刀破开膝关节上方皮肤，暴露小鼠髌韧带，在胫骨平台下0.5cm，髌韧带下缘与胫骨粗隆结合位置向内侧旁开2mm，无菌刀片切开肌肉暴露胫骨内侧骨面，先使用5ml注射器针头开孔，然后使用圆锥形磨钻开路到适当直径，最后使用1mm直径圆柱形磨钻确定打孔直径为1mm，手术结束，无需缝合肌肉，直接缝合皮肤，碘伏消毒。分为4组(A：lysis buffer 100ul每次每只；B：2500ng DDRGK1溶于lysisbuffer 100ul每次每只；C：2500ng失活DDRGK1溶于lysis buffer 100ul(99度金属浴5min)每次每只；D：250ng BMP2溶于lysis buffer 100ul每次每只)，术后第2，4，6，8 天手术部位局部给药，术后第十天右下肢取材多甲固定。

取8周C57雄性小鼠完成颅骨缺损模型：麻醉后取俯卧位，头皮脱毛，酒精或碘伏棉球消毒三遍，以颅骨顶点为解剖标志，使用无菌手术刀或剪刀破开颅骨上方皮肤，暴露小鼠颅骨，在颅骨中缝旁开2mm，先使用5ml注射器针头开孔，然后使用圆锥形磨钻开路到适当直径，最后使用1mm直径圆柱形磨钻确定打孔直径为1mm，手术结束，直接缝合皮肤，碘伏消毒。分为2组(对照组：lysis buffer 100ul每次每只；DDRGK1组：2500ng DDRGK1溶于 lysisbuffer 100ul每次每只)，术后第2，4，6，8天手术部位局部给药，术后第十天颅骨取材多甲固定。

⑧DTNB、β-ME、叔丁基过氧化氢法

室温下，配置DTNB(10mM)，β-ME(20mM)，叔丁基过氧化氢(7％)。按照2：1混合DTNB和β-ME。96孔板，每孔100ul，使用酶标仪，可吸收光405nm检测，制作标准曲线。使用2mM的-SH，30ug/ml重组外分泌型DDRGK1，总体积为90ul点入96孔板。加入10ul叔丁基过氧化氢(7％)后立即酶标仪检测，每隔1分钟检测一次。绘制浓度-时间图。

(3)实验结果

①重组人分泌型DDRGK1的发现及对小鼠胚胎的作用

图3左显示，野生型(WT)的DDRGK1显示出分泌型和膜上型(第2,3,4泳道)，1-28 号剪切的DDRGK1出现胞内表达增加(第6泳道)，同时分泌型减少(第7泳道)。K267R 突变出现胞内表达上升(第9泳道)。图3右显示，由于剪切1-28号位点，使DDRGK1无法分泌，出现小鼠胚胎无法发育。

②重组人分泌型DDRGK1对大鼠胫骨骨缺损的修复作用

由图4可知，重组人分泌型DDRGK1作用下的大鼠胫骨缺损修复明显优于对照组、去活性的重组人分泌型DDRGK1组及BMP2组，重组人分泌型DDRGK1作用下的BV/TV较其他组显著增加。

由此说明，重组人分泌型DDRGK1可促进大鼠胫骨骨缺损的修复。

③重组人分泌型DDRGK1对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)成骨分化的作用

由图5左图可知，重组人分泌型DDRGK1作用下的BMSC的ALP染色较对照组显著增加。由图5右图可知，重组人分泌型DDRGK1作用下的BMSC的茜素红染色较对照组显著增加。

由此说明，重组人分泌型DDRGK1可促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)成骨分化。

④重组人分泌型DDRGK1挽救大鼠髓核原代细胞氧化应激(ROS)的作用

由图6可知，ROS刺激下，重组人分泌型DDRGK1作用使得小鼠软骨原代细胞及大鼠髓核原代细胞的阿尔新蓝染色较对照显著增加。重组人分泌型DDRGK1作用下，软骨及髓核细胞更能够抵抗ROS，其细胞外基质的量已经与无ROS组相当。

由此说明，重组人分泌型DDRGK1可促进大鼠髓核细胞抵抗ROS。

⑤重组人分泌型DDRGK1对大鼠原代髓核细胞作用下，胞内活性氧检测。

使用双氧水构建高ROS的大鼠原代髓核细胞，并使用重组人分泌型DDRGK1挽救。由图7可知：DCFH的绿色荧光在重组人分泌型DDRGK1挽救组显著低于ROS应激组。

由此可知：重组人分泌型DDRGK1通过清除大鼠原代髓核细胞胞内的活性氧对抗ROS。

⑥重组人分泌型DDRGK1促进二硫键形成。

使用重组人分泌型DDRGK1后的二硫键形成的反应半数时间显著低于对照组。

由图8可知：重组人分泌型DDRGK1促进二硫键形成，由此对抗由于氧化应激导致的髓核细胞外基质降解，以此修复椎间盘。

⑦重组人分泌型DDRGK1对ATDC5软细胞系的作用

ATDC5(前增殖软骨细胞，可诱导分化为增殖软骨细胞，至肥大软骨细胞，最终可成骨) 分泌型DDRGK1重组蛋白作用96小时PCR(未使用ITS分化培养)，由图9可以发现：

a.内质网应激通路(ER-Stress通路)被抑制；

b.软骨分化maker SOX9可能增加；

c.PTC(增殖软骨细胞maker减少)；

d.IHH(前肥大和肥大软骨细胞maker增加)；

e.OPN(表达量太低，未出现成骨分化)；

f.Col10a1(肥大软骨细胞maker增加)；

g.p53(增殖maker增加)；

h.BAX(凋亡maker减少)。

由此说明，分泌型DDRGK1通过ER-Stress通路诱导ATDC5分化至肥大软骨细胞(给予更长时间诱导可能诱导至终末分化，最终成骨)。

⑧重组人分泌型DDRGK1对小鼠骨髓间充质干细胞(m-BMSC)成骨分化的作用

由图10上图可知，重组人分泌型DDRGK1作用下的m-BMSC的ALP染色较对照组显著增加。由图10下图可知，重组人分泌型DDRGK1作用下的m-BMSC的茜素红染色较对照组显著增加。

由此说明，重组人分泌型DDRGK1可促进小鼠骨髓间充质干细胞(m-BMSC)成骨分化。

⑨重组人分泌型DDRGK1对人骨髓间充质干细胞(h-BMSC)成骨分化的作用

由图11左图可知，重组人分泌型DDRGK1作用下的h-BMSC的ALP染色较对照组显著增加。由图11右图可知，重组人分泌型DDRGK1作用下的h-BMSC的茜素红染色较对照组显著增加。

由此说明，重组人分泌型DDRGK1可促进人骨髓间充质干细胞(h-BMSC)成骨分化。

⑩重组人分泌型DDRGK1对小鼠MC3T3-E1细胞系成骨分化的作用

由图12上图可知，重组人分泌型DDRGK1作用下的MC3T3-E1的ALP染色较对照组显著增加。由图12下图可知，重组人分泌型DDRGK1作用下的MC3T3-E1的茜素红染色较对照组显著增加。

由此说明，重组人分泌型DDRGK1可促进小鼠MC3T3-E1成骨分化。

重组人分泌型DDRGK1对小鼠骨髓间充质干细胞(m-BMSC)成骨标志mRNA的PCR检测

重组人分泌型DDRGK1重组蛋白作用m-BMSC的0,3,7天PCR，由图13可知：

刺激至第7天，重组人分泌型DDRGK1作用下m-BMSC的ALP显著上升；

刺激至第7天，重组人分泌型DDRGK1作用下m-BMSC的Col-1显著上升；

刺激至第7天，重组人分泌型DDRGK1作用下m-BMSC的RUNX-2显著上升；

刺激至第7天，重组人分泌型DDRGK1作用下m-BMSC的OCN显著上升。

由此可知：重组人分泌型DDRGK1可促进小鼠骨髓间充质干细胞(m-BMSC)成骨分化标志mRNA的表达。

重组人分泌型DDRGK1对小鼠MC3T3-E1细胞系成骨标志mRNA的PCR检测

重组人分泌型DDRGK1重组蛋白作用m-BMSC的0,3,7,14,21天PCR，由图14可知：

刺激至第7天，重组人分泌型DDRGK1作用下MC3T3-E1的ALP显著上升；

刺激至第7天，重组人分泌型DDRGK1作用下MC3T3-E1的Col-1显著上升；

刺激至第7天，重组人分泌型DDRGK1作用下MC3T3-E1的OCN显著上升；

刺激至第7天，重组人分泌型DDRGK1作用下MC3T3-E1的RUNX2显著上升；

由此说明，重组人分泌型DDRGK1可促进小鼠MC3T3-E1细胞系成骨分化标志mRNA的表达。

重组人分泌型DDRGK1对小鼠颅骨缺损模型的修复

Micro-CT显示(图15)：重组人分泌型DDRGK1作用下，颅骨较对照组出现显著性修复现象。由此说明，重组人分泌型DDRGK1可促进小鼠颅骨缺损的修复。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院

<120> 一种重组人分泌型DDRGK1的应用

<130> 1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Ala Ser Ala Gly Gln Glu Pro Leu His Asn Glu Glu Leu Ala Gly Ala

1 5 10 15

Gly Arg Val Ala Gln Pro Gly Pro Leu Glu Pro Glu Glu Pro Arg Ala

20 25 30

Gly Gly Arg Pro Arg Arg Arg Arg Asp Leu Gly Ser Arg Leu Gln Ala

35 40 45

Gln Arg Arg Ala Gln Arg Val Ala Trp Ala Glu Ala Asp Glu Asn Glu

50 55 60

Glu Glu Ala Val Ile Leu Ala Gln Glu Glu Glu Gly Val Glu Lys Pro

65 70 75 80

Ala Glu Thr His Leu Ser Gly Lys Ile Gly Ala Lys Lys Leu Arg Lys

85 90 95

Leu Glu Glu Lys Gln Ala Arg Lys Ala Gln Arg Glu Ala Glu Glu Ala

100 105 110

Glu Arg Glu Glu Arg Lys Arg Leu Glu Ser Gln Arg Glu Ala Glu Trp

115 120 125

Lys Lys Glu Glu Glu Arg Leu Arg Leu Glu Glu Glu Gln Lys Glu Glu

130 135 140

Glu Glu Arg Lys Ala Arg Glu Glu Gln Ala Gln Arg Glu His Glu Glu

145 150 155 160

Tyr Leu Lys Leu Lys Glu Ala Phe Val Val Glu Glu Glu Gly Val Gly

165 170 175

Glu Thr Met Thr Glu Glu Gln Ser Gln Ser Phe Leu Thr Glu Phe Ile

180 185 190

Asn Tyr Ile Lys Gln Ser Lys Val Val Leu Leu Glu Asp Leu Ala Ser

195 200 205

Gln Val Gly Leu Arg Thr Gln Asp Thr Ile Asn Arg Ile Gln Asp Leu

210 215 220

Leu Ala Glu Gly Thr Ile Thr Gly Val Ile Asp Asp Arg Gly Lys Phe

225 230 235 240

Ile Tyr Ile Thr Pro Glu Glu Leu Ala Ala Val Ala Asn Phe Ile Arg

245 250 255

Gln Arg Gly Arg Val Ser Ile Ala Glu Leu Ala Gln Ala Ser Asn Ser

260 265 270

Leu Ile Ala Trp Gly Arg Glu Ser Pro Ala Gln Ala Pro Ala

275 280 285

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Ala

1 5 10 15

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

His His His His His His His His

1 5

Claims (3)

1.一种重组人分泌型DDRGK1的应用，其特征在于：应用于制备治疗骨缺损的药物；所述重组人分泌型DDRGK1为切除1-28位点的DDRGK1蛋白从定位为细胞膜转变成分泌型的蛋白；所述切除1-28位点的DDRGK1蛋白序列如SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物以重组人分泌型DDRGK1为活性成分，配以药学上可接受的辅助性成分制备成制剂使用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述制剂选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。

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