CN114306573A

CN114306573A - 一种可促进成骨的受体qsox1的应用

Info

Publication number: CN114306573A
Application number: CN202111597966.4A
Authority: CN
Inventors: 赵杰; 杨骁�; 周唐峻; 夏莹; 戎柯纬; 曹贤坤; 秦安; 曹禹
Original assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明涉及一种可促进成骨的受体QSOX1的应用，本发明经过实验论证，QSOX1可作为受体与分泌型DDRGK1结合，发挥治疗骨折或骨缺损的作用，为骨相关疾病的治疗打开了新的思路并拓展了受体调控在临床的进一步应用。

Description

一种可促进成骨的受体QSOX1的应用

技术领域

本发明属于骨相关疾病领域，特别涉及一种可促进成骨的受体QSOX1的应用。

背景技术

目前对于骨相关疾病的治疗多以手术治疗为主，但是手术的创伤过大常导致骨折的延迟愈合以及不愈合，对于这种情况常缺乏有效的促进成骨方案。不仅如此，对于骨质疏松，往往仅能通过药物对于破骨进行抑制，而缺乏促进成骨进而提升骨量的防治手段。

DDRGK1被认为是参与类泛素化过程的重要蛋白。其参与内质网应激导致的细胞凋亡 [Wu J,Lei G,Mei M,et al.A novel C53/LZAP-interacting protein regulatesstability of C53/LZAP and DDRGK domain-containing Protein 1(DDRGK1)andmodulates NF-kappaB signaling.The Journal of biological chemistry 2010；285:15126-36]。同时DDRGK1(118-216)与ASC1相互结合，在类泛素化系统蛋白相互作用下，实现ASC1的类泛素化，介导雌激素受体α(ERα)激活后的信号转录[Yoo HM, Kang SH,Kim JY,etal.Modification of ASC1 by UFM1 is crucial for ERalpha transactivation andbreast cancer development.Molecular cell 2014；56:261-74]。

QSOX1是可催化二硫键形成的蛋白，在成纤维细胞中可被分泌，在细胞外催化二硫键形成，稳定细胞外基质的网络[Ilani T,Alon A,Grossman I,et al.A secreteddisulfide catalyst controls extracellular matrix composition andfunction.Science.2013Jul 5；341(6141):74-6.]。而在肿瘤细胞中，敲除或者敲减QSOX1可大大增强肿瘤细胞的迁徙及侵袭能力[Sun J,Zhou C,Zhao Y,et al.Quiescinsulfhydryl oxidase 1promotes sorafenib-induced ferroptosis in hepatocellularcarcinoma by driving EGFR endosomal trafficking and inhibiting NRF2activation.Redox biology.2021May；41:101942.]。但至今无人关注QSOX1在成骨方向的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可促进成骨的受体QSOX1的应用，经过实验论证，QSOX1可作为受体与分泌型DDRGK1结合，发挥治疗骨折或骨缺损的作用，为骨相关疾病的治疗打开了新的思路并拓展了受体调控在临床的进一步应用。

本发明提供了一种可促进成骨的受体QSOX1的应用，应用于制备促进骨折愈合、改善骨质疏松疾病的药物。

所述受体QSOX1的蛋白序列如SEQ NO.1所示。

所述受体QSOX1与分泌型DDRGK1蛋白结合，促进骨髓间充质干细胞的成骨能力。

所述受体QSOX1与分泌型DDRGK1蛋白应用于制备治疗骨折或骨缺损的药物。

以所述受体QSOX1为活性成分，配以药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂使用。

优选的，所述制剂选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。

有益效果

本发明经过实验论证，QSOX1在MC3T3-E1细胞系中可作为膜上受体存在，同时，其可与分泌型DDRGK1蛋白结合，促进骨髓间充质干细胞的成骨能力并为未来的临床转化进一步构建实验基础，为骨相关疾病的治疗打开了新的思路并拓展了受体调控在临床的进一步应用。

附图说明

图1为QSOX1蛋白受体示意图。

图2为DDRGK1纯化表达图。

图3为可促进成骨的受体QSOX1可与分泌型DDRGK1蛋白结合的蛋白免疫印迹图(左)；以及DDRGK1类泛素化修饰QSOX1的蛋白免疫印迹图(右)。

图4为可促进成骨的受体QSOX1可与分泌型DDRGK1蛋白共定位的免疫荧光图。

图5为不同表达水平的受体QSOX1可与分泌型DDRGK1蛋白结合并刺激小鼠MC3T3-E1细胞系成骨分化的第7天ALP染色(左)及第21天茜素红染色(右)图：QOEC：QSOX1过表达对照组；QOEC+D：QSOX1过表达对照组加入分泌型DDRGK1蛋白；QOE：QSOX1 过表达组；QOE+D：QSOX1过表达组加入分泌型DDRGK1蛋白。

图6为不同表达水平的受体QSOX1对小鼠MC3T3-E1细胞系成骨标志mRNA的PCR检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)实验方法

①重组表达载体的构建和目的蛋白的表达

人源QSOX1基因(NCBI参考序列：NM_001004128.3)由金唯智生物公司经密码子优化后合成。如图1所示，PCR获得了人源QSOX11 cDNA片段(对应蛋白序列MRRCNSGSGPPPSLLLLLLWLLAVPGANAAPRSALYSPSDPLTLLQADTVRGAVLGSRSAWA VEFFASWCGHCIAFAPTWKALAEDVKAWRPALYLAALDCAEETNSAVCRDFNIPGFPTVRF FKAFTKNGSGAVFPVAGADVQTLRERLIDALESHHDTWPPACPPLEPAKLEEIDGFFARNNE EYLALIFEKGGSYLGREVALDLSQHKGVAVRRVLNTEANVVRKFGVTDFPSCYLLFRNGSV SRVPVLMESRSFYTAYLQRLSGLTREAAQTTVAPTTANKIAPTVWKLADRSKIYMADLESA LHYILRIEVGRFPVLEGQRLVALKKFVAVLAKYFPGRPLVQNFLHSVNEWLKRQKRNKIPYS FFKTALDDRKEGAVLAKKVNWIGCQGSEPHFRGFPCSLWVLFHFLTVQAARQNVDHSQEA AKAKEVLPAIRGYVHYFFGCRDCASHFEQMAAASMHRVGSPNAAVLWLWSSHNRVNARL AGAPSEDPQFPKVQWPPRELCSACHNERLDVPVWDVEATLNFLKAHFSPSNIILDFPAAGSA ARRDVQNVAAAPELAMGALELESRNSTLDPGKPEMMKSPTNTTPHVPAEGPEASRPPKLHP GLRAAPGQEPPEHMAELQRNEQEQPLGQWHLSKRDTGAALLAESRAEKNRLWGPLEVRR VGRSSKQLVDIPEGQLEARAGRGRGQWLQVLGGGFSYLDISLCVGLYSLSFMGLLAMYTY FQAKIRALKGHAGHPAA)，该片段经AscI/NotI双酶切后克隆到实验室改造的pCDNA3.4质粒上，基因序列N端连接出膜信号肽MKTIIALSYIFCLVFA，C端连接TEV酶切位点 ENLYFQG和纯化标签HHHHHHHH。

Expi293F细胞于37℃，110rpm，5％CO₂的条件下进行悬浮培养，当细胞数达到每毫升 2.5×106密度后进行转染。使用1mg表达质粒DNA转染1L细胞，其中表达质粒和转染试剂PEI MAX以1:3的比例(w/w)在100ml新鲜培养基中预混合，孵育30分钟后全部加入 1LExpi293F细胞中继续保持原条件进行悬浮培养，在转染72小时后收集细胞培养物上清液进行蛋白纯化。

②蛋白纯化

对所述细胞培养物以1500g转速离心10分钟并收集上清液，然后将所得上清液以5000g 转速再次离心20分钟并收集上清。取2mL Ni Smart Beads 6FF纯化介质装入纯化空柱，首先用约20个柱体积的去离子水清洗该纯化介质，然后用约20个柱体积的缓冲液(20mMHepes pH 8.0,150mM NaCl,10％Glycerol)对该纯化介质进行预平衡。此后，以约0.5ml/min的流速将上清液加载至预平衡的纯化介质。待上清液全部穿流完毕以后，用约20个柱体积的缓冲液洗涤该纯化介质。最后，使用约3个柱体积的缓冲液将介质重悬至离心管中，并向其中加入约0.4mg的TEV蛋白酶，置于旋转摇床上进行4℃过夜酶切处理。

将所述离心管中过夜酶切的样品重新加载至空的纯化柱容器中并收集该酶切处理后的穿流液，然后用约2个柱体积的缓冲液分两份缓慢流过纯化介质并采集穿流液，最后合并全部穿流液。将合并后的穿流液浓缩至1ml并将样品经SPINX离心过滤器过滤，然后用分子排阻层析柱(Superdex 200Increase 10/300GL,GE Healthcare)进行进一步分离纯化，如图2所示。分子排阻层析柱预先装于4℃下的AKTA PURE仪器上并使用20mM Hepes pH8.0,150mM NaCl作为流动相进行预平衡。经SDS-PAGE检验蛋白纯度后，收集包含DDRGK1蛋白的级分(fplc对应的蛋白出峰位置)进行后续实验。

③蛋白免疫共沉淀法

使用PBS清洗control，HA-QSOX1过表达和Flag-DDRGK1过表达293T工具细胞3遍，每皿细胞中加入1.2mlNETT细胞裂解液(Beyotime,Shanghai,China)，已经预加入12ul的蛋白酶抑制剂，蛋白磷酸酶抑制剂A+B及PMSF(Roche,Grenzach,Germany)裂解细胞形成蛋白匀浆。取200ul蛋白上清加入50ul蛋白loading-buffer(5X)以99摄氏度的温度烈煮10min，取剩余的1000μl蛋白上清加入30μl Flag磁珠(Sigma-Aldrich,St Louis,MO,U.S.A)，放于4℃摇床过夜。第二天以磁铁吸附磁珠后去上清，使用加入蛋白酶抑制剂，蛋白磷酸酶抑制剂A+B 及PMSF(Roche,Grenzach,Germany)的TBS清洗磁珠3遍，加入40μl 1X loadingBUFFER 99 摄氏度高温烈煮磁珠5分钟，磁铁吸附磁珠后取上清点样，与Input组用10％或12.5％的 SDS-PAGE凝胶对提取的蛋白质进行等量(20-30μg)分离，并用0.22μm PVDF膜(Merck Millipore)电印迹分离蛋白质。在室温下用5％BSA-PBS封闭膜1小时，然后在4℃下与一级抗体(在5％BSA-PBS中稀释1:1000)孵育过夜(至少16小时)。抗Flag(CST；兔单克隆抗体)，HA(CST；兔单克隆抗体),QSOX1(PROTEINTECH；兔mAb)，DDRGK1 (PROTEINTECH；兔mAb)，Myc(CST；兔mAb)和β-肌动蛋白(CST；兔单克隆抗体)。然后在Tris缓冲盐水-Tween20(TBST)中广泛冲洗膜，随后用抗兔IgG(H+L)及抗鼠IgG (H+L)(DyLight)培养^TM8004×PEG结合物；细胞信号技术)二级抗体(1:5000稀释度) 室温下黑暗1小时。再次在TBST中广泛冲洗膜，并在LI-COR Odyssey荧光成像系统(美国东北林肯市LI-COR Biosciences)上检测到蛋白质免疫反应性。蛋白质免疫反应谱带强度的半定量分析采用imageproplus6.0软件测量，内参为β-actin。

④成骨分化

使用小鼠MC3T3-E1细胞系成骨诱导分化培养基试剂盒(Cyagen)，按照试剂盒要求小鼠 MC3T3-E1细胞系成骨诱导分化培养基。培养孔板表面包被0.1％明胶，小鼠MC3T3-E1细胞系按照2×10⁴cells/cm²接种于孔板中，加入成骨诱导分化完全培养基，同时给予不同浓度重组人分泌型DDRGK1。每隔3天换用新鲜的成骨诱导分化完全培养基换液。诱导7天后，ALP 染色。诱导21天后，进行阿尔新蓝染色。

⑤免疫荧光法

免疫荧光检测时，将MC3T3-E1细胞培养在共聚焦小皿上并用4％的PFA固定，然后在 37℃的抗原回收缓冲液(Roche)中孵育30分钟。冷却至室温后，将载玻片浸入PBS(pH7.4) 中，洗涤3次，每次5分钟。在切片中加入自荧光猝灭剂5min，室温下用阻断缓冲液阻断30min。随后在4℃的湿箱中用一级抗体孵育切片过夜。一级抗体以1:100稀释使用，包括抗 QSOX1(PROTEINTECH；兔mAb)，DDRGK1(PROTEINTECH；兔mAb)。第二天，用 PBS冲洗切片，然后用Alexa-fluor594结合二级抗体(抗兔，1:500；细胞信号技术)在室温下黑暗中孵育50分钟。切片用PBS洗涤，然后用DAPI溶液(美国密苏里州圣路易斯市 Sigma-Aldrich)在黑暗中孵育10分钟以染色细胞核。切片进行最终PBS洗涤，风干，然后用抗荧光猝灭片密封。数字荧光图像是在徕卡DM4000 B表观荧光显微镜(Leica Microsystems)下拍摄。

⑥qPCR检测法

使用小鼠MC3T3-E1细胞系成骨诱导分化培养基培养MC3T3-E1 QSOX1对照组及过表达组细胞系。培养孔板表面包被0.1％明胶，小鼠MC3T3-E1细胞系按照2×10⁴cells/cm²接种于孔板中，加入成骨诱导分化完全培养基，同时给予重组人分泌型DDRGK1。每隔3天换用新鲜的成骨诱导分化完全培养基换液。诱导7天后，根据说明书说明，使用TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)从组织和细胞中分离总RNA。利用cDNA合成试剂盒(Takara Bio，Otsu，Japan)从提取的rna中反转录第一链互补dna(cDNA)。采用GoTaq一步法RT-qPCR系统(美国威斯康星州麦迪逊市普罗梅加)和琼脂糖凝胶电泳(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯Bio-Rad Laboratories)检测相对mRNA表达。使用TB绿色预混料Ex-Taq试剂盒(Takara Bio)在Applied Biosystems QuantStudio 6Flex实时PCR系统(ThermoFisher Scientific)上进行实时qPCR。使用NCBI BLAST和表2中提供的序列设计特定引物对。以 GAPDH或β-actin基因表达作为内对照。靶基因表达水平用2-ΔCT法测定。将实验组靶基因的平均CT值归一化为GAPDH或β-actin的CT值，得到ΔCT值。然后将其进一步标准化以获得ΔΔCT。

(2)实验结果

①可促进成骨的受体QSOX1可与分泌型DDRGK1蛋白结合

图3左显示，HA-QSOX1可与Flag-DDRGK1结合(第3泳道)。图3右显示，Flag-DDRGK1可对QSOX1进行类泛素化修饰，这种修饰与DDRGK1的表达水平有关(第2，3泳道)。

②可促进成骨的受体QSOX1可与分泌型DDRGK1在内质网膜上共定位

由图4可知，受体QSOX1与分泌型DDRGK1均在内质网膜上表达并定位，并且两者在内质网周围结合，发挥相应成骨促进作用。

③可促进成骨的受体QSOX1对小鼠MC3T3-E1细胞系成骨分化的作用

由图5左图可知，可促进成骨的受体QSOX1过表达组ALP染色较对照组显著增加，并且加入分泌型DDRGK1蛋白与可促进成骨的受体QSOX1结合时，ALP染色增加更明显。由图5右图可知，可促进成骨的受体QSOX1过表达组AR染色较对照组显著增加，并且加入分泌型DDRGK1蛋白与可促进成骨的受体QSOX1结合时，AR染色增加更明显。

由此说明，受体QSOX1可促进小鼠MC3T3-E1细胞系成骨分化。

④可促进成骨的受体QSOX1对小鼠MC3T3-E1细胞系成骨标志mRNA的PCR检测

可促进成骨的受体QSOX1过表达作用小鼠MC3T3-E1的0,3,5天PCR，由图6可知：刺激至第3,5天，受体QSOX1过表达的细胞系ALPL，Col1a1,RUNX2,OCN,OPN,Osterix基因表达水平出现明显差异；由此说明，受体QSOX1过表达可改变小鼠MC3T3-E1细胞系成骨分化标志mRNA的表达。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院

<120> 一种可促进成骨的受体QSOX1的应用

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 747

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Arg Arg Cys Asn Ser Gly Ser Gly Pro Pro Pro Ser Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Trp Leu Leu Ala Val Pro Gly Ala Asn Ala Ala Pro Arg

20 25 30

Ser Ala Leu Tyr Ser Pro Ser Asp Pro Leu Thr Leu Leu Gln Ala Asp

35 40 45

Thr Val Arg Gly Ala Val Leu Gly Ser Arg Ser Ala Trp Ala Val Glu

50 55 60

Phe Phe Ala Ser Trp Cys Gly His Cys Ile Ala Phe Ala Pro Thr Trp

65 70 75 80

Lys Ala Leu Ala Glu Asp Val Lys Ala Trp Arg Pro Ala Leu Tyr Leu

85 90 95

Ala Ala Leu Asp Cys Ala Glu Glu Thr Asn Ser Ala Val Cys Arg Asp

100 105 110

Phe Asn Ile Pro Gly Phe Pro Thr Val Arg Phe Phe Lys Ala Phe Thr

115 120 125

Lys Asn Gly Ser Gly Ala Val Phe Pro Val Ala Gly Ala Asp Val Gln

130 135 140

Thr Leu Arg Glu Arg Leu Ile Asp Ala Leu Glu Ser His His Asp Thr

145 150 155 160

Trp Pro Pro Ala Cys Pro Pro Leu Glu Pro Ala Lys Leu Glu Glu Ile

165 170 175

Asp Gly Phe Phe Ala Arg Asn Asn Glu Glu Tyr Leu Ala Leu Ile Phe

180 185 190

Glu Lys Gly Gly Ser Tyr Leu Gly Arg Glu Val Ala Leu Asp Leu Ser

195 200 205

Gln His Lys Gly Val Ala Val Arg Arg Val Leu Asn Thr Glu Ala Asn

210 215 220

Val Val Arg Lys Phe Gly Val Thr Asp Phe Pro Ser Cys Tyr Leu Leu

225 230 235 240

Phe Arg Asn Gly Ser Val Ser Arg Val Pro Val Leu Met Glu Ser Arg

245 250 255

Ser Phe Tyr Thr Ala Tyr Leu Gln Arg Leu Ser Gly Leu Thr Arg Glu

260 265 270

Ala Ala Gln Thr Thr Val Ala Pro Thr Thr Ala Asn Lys Ile Ala Pro

275 280 285

Thr Val Trp Lys Leu Ala Asp Arg Ser Lys Ile Tyr Met Ala Asp Leu

290 295 300

Glu Ser Ala Leu His Tyr Ile Leu Arg Ile Glu Val Gly Arg Phe Pro

305 310 315 320

Val Leu Glu Gly Gln Arg Leu Val Ala Leu Lys Lys Phe Val Ala Val

325 330 335

Leu Ala Lys Tyr Phe Pro Gly Arg Pro Leu Val Gln Asn Phe Leu His

340 345 350

Ser Val Asn Glu Trp Leu Lys Arg Gln Lys Arg Asn Lys Ile Pro Tyr

355 360 365

Ser Phe Phe Lys Thr Ala Leu Asp Asp Arg Lys Glu Gly Ala Val Leu

370 375 380

Ala Lys Lys Val Asn Trp Ile Gly Cys Gln Gly Ser Glu Pro His Phe

385 390 395 400

Arg Gly Phe Pro Cys Ser Leu Trp Val Leu Phe His Phe Leu Thr Val

405 410 415

Gln Ala Ala Arg Gln Asn Val Asp His Ser Gln Glu Ala Ala Lys Ala

420 425 430

Lys Glu Val Leu Pro Ala Ile Arg Gly Tyr Val His Tyr Phe Phe Gly

435 440 445

Cys Arg Asp Cys Ala Ser His Phe Glu Gln Met Ala Ala Ala Ser Met

450 455 460

His Arg Val Gly Ser Pro Asn Ala Ala Val Leu Trp Leu Trp Ser Ser

465 470 475 480

His Asn Arg Val Asn Ala Arg Leu Ala Gly Ala Pro Ser Glu Asp Pro

485 490 495

Gln Phe Pro Lys Val Gln Trp Pro Pro Arg Glu Leu Cys Ser Ala Cys

500 505 510

His Asn Glu Arg Leu Asp Val Pro Val Trp Asp Val Glu Ala Thr Leu

515 520 525

Asn Phe Leu Lys Ala His Phe Ser Pro Ser Asn Ile Ile Leu Asp Phe

530 535 540

Pro Ala Ala Gly Ser Ala Ala Arg Arg Asp Val Gln Asn Val Ala Ala

545 550 555 560

Ala Pro Glu Leu Ala Met Gly Ala Leu Glu Leu Glu Ser Arg Asn Ser

565 570 575

Thr Leu Asp Pro Gly Lys Pro Glu Met Met Lys Ser Pro Thr Asn Thr

580 585 590

Thr Pro His Val Pro Ala Glu Gly Pro Glu Ala Ser Arg Pro Pro Lys

595 600 605

Leu His Pro Gly Leu Arg Ala Ala Pro Gly Gln Glu Pro Pro Glu His

610 615 620

Met Ala Glu Leu Gln Arg Asn Glu Gln Glu Gln Pro Leu Gly Gln Trp

625 630 635 640

His Leu Ser Lys Arg Asp Thr Gly Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ser Arg

645 650 655

Ala Glu Lys Asn Arg Leu Trp Gly Pro Leu Glu Val Arg Arg Val Gly

660 665 670

Arg Ser Ser Lys Gln Leu Val Asp Ile Pro Glu Gly Gln Leu Glu Ala

675 680 685

Arg Ala Gly Arg Gly Arg Gly Gln Trp Leu Gln Val Leu Gly Gly Gly

690 695 700

Phe Ser Tyr Leu Asp Ile Ser Leu Cys Val Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

705 710 715 720

Phe Met Gly Leu Leu Ala Met Tyr Thr Tyr Phe Gln Ala Lys Ile Arg

725 730 735

Ala Leu Lys Gly His Ala Gly His Pro Ala Ala

740 745

Claims

1.一种可促进成骨的受体QSOX1的应用，其特征在于：应用于制备促进骨折愈合、改善骨质疏松疾病的药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述受体QSOX1的蛋白序列如SEQ NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述受体QSOX1与分泌型DDRGK1蛋白结合，促进骨髓间充质干细胞的成骨能力。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述受体QSOX1与分泌型DDRGK1蛋白应用于制备治疗骨折或骨缺损的药物。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：以所述受体QSOX1为活性成分，配以药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂使用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述制剂选自注射液、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。