CN112394179A

CN112394179A - Fmc63 car-t细胞免疫原性elisa检测试剂盒

Info

Publication number: CN112394179A
Application number: CN202110059329.5A
Authority: CN
Inventors: 葛平菊; 苗景赟; 王恒玲; 焦秋伶
Original assignee: Beijing Baipusai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Baipusai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2041-01-18
Also published as: CN112394179B

Abstract

本发明提供一种FMC63 CAR‑T细胞免疫原性ELISA检测试剂盒。本发明利用重组表达的FMC63 scFv蛋白以及生物素标记的FMC63 scFv蛋白检测血清样本中FMC63 CAR‑T的抗药抗体，以兔抗FMC63 scFv蛋白多抗表示临床FMC63 CAR‑T产生的抗药抗体滴度。以此开发出的检测试剂盒能准确灵敏地检测抗药抗体的滴度，样品前处理简单，耗时少，能同时检测大量样品，检测成本低，使用的免疫亲和柱纯化的兔多抗，亲和力高，且能表征临床抗药抗体产生的状态，相较单克隆抗体更具代表性。试剂盒中的检测试剂无放射性污染，该试剂盒对解决大批量临床样本检测具有重要意义。

Description

FMC63 CAR-T细胞免疫原性ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体地说，涉及一种FMC63 CAR-T细胞免疫原性ELISA检测试剂盒。

背景技术

近年来，嵌合抗原受体（CAR-T）细胞疗法在恶性肿瘤的治疗领域取得了显著性的治疗效果。同时，与其相对应的临床实验也在迅速开展，以探索出CAR-T疗法潜在的应用场景。

CAR-T（Chimeric antigen receptor T cell，嵌合抗原受体T细胞）疗法，是指通过基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞，使T细胞直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而被激活，通过释放穿孔素、颗粒酶素B等直接杀伤肿瘤细胞，同时还通过释放细胞因子募集人体内源性免疫细胞杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的，而且还可形成免疫记忆T细胞，从而获得特异性的抗肿瘤长效机制。

CD19靶点是CAR-T细胞治疗中最常见的靶点。据ClinicalTrials.gov统计，迄今已进行了600多项CAR-T细胞临床试验，其中大部分使用靶向CD19的特异性CAR-T细胞治疗白血病或淋巴瘤患者。

FMC63是一种靶向人CD19的鼠源单克隆抗体，其scFv序列已被广泛运用在Anti-CD19 CAR的构造中，包括已上市的两款靶向CD19的CAR-T细胞药物Kymriah和Yescarta。在CAR-T产品的开发过程中，其在临床安全性研究需要得到重视，其特异性抗原识别结构域在临床上是否会产生免疫原性，产生抗药抗体，有待进一步研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种FMC63 CAR-T细胞免疫原性ELISA检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供所述试剂盒中FMC63 CAR-T细胞免疫原性检测中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种FMC63 CAR-T细胞免疫原性ELISA检测试剂盒，其中，FMC63 CAR-T细胞是指以CD19为靶点，且表达FMC63的CAR-T细胞。

所述试剂盒至少包含：预包被FMC63 scFv蛋白的酶标板、生物素标记的FMC63scFv蛋白、阳性对照、HRP标记的链霉亲和素、洗涤液、样品稀释液、显色液和反应终止液。

其中，所述阳性对照为抗FMC63 scFv蛋白多克隆抗体；

所述洗涤液为：20mM Tris，150mM NaCl，0.5% v/v Tween-20，pH7.4；

所述稀释液为：含0.5%牛血清白蛋白的洗涤液；

所述显色液为：50 mM Na₂HPO₄·12H₂O，25 mM柠檬酸，40 mg/mL四甲基联苯胺（TMB），3%H₂O₂，pH5.5；

所述反应终止液为1 M硫酸溶液。

其中，生物素标记的FMC63 scFv蛋白、HRP标记的链霉亲和素、抗FMC63 scFv蛋白多克隆抗体均以冻干粉形式存在于试剂盒中。

优选地，所述阳性对照为兔抗FMC63多克隆抗体，其制备方法包括：将HEK293细胞表达的FMC63免疫新西兰大白兔，采集血清，经免疫亲和柱纯化得到多克隆抗体。

优选地，酶标板上包被的FMC63 scFv蛋白的浓度为1ug/mL。

优选地，所述预包被FMC63 scFv蛋白的酶标板的制备方法为：将含有FMC63 scFv蛋白的包被液加至96孔板中，于4℃包被过夜，用洗涤液洗板后，用封闭液进行封闭。

其中，所述包被液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，具体成分为：15 mM Na₂CO₃，35 mMNaHCO₃，pH9.6。

优选地，所述生物素标记的FMC63中，生物素与FMC63的摩尔比为1-2:1，其使用浓度为2ug/mL。

本发明中，所述生物素标记的FMC63是通过化学方法将生物素标记到FMC63 scFv蛋白的赖氨酸上，也可以将生物素替换成FITC，PE，HRP标记等。

优选地，所述HRP标记的链霉亲和素购自ThermoFisher。

本发明中，FMC63 scFv蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明中使用的FMC63 scFv蛋白是利用人HEK293细胞表达的FMC63 scFv蛋白。

本发明试剂盒的存储条件为：2-8℃（优选4℃）存放12个月以上。

第二方面，本发明提供所述试剂盒中FMC63 CAR-T细胞免疫原性检测中的应用。

本发明试剂盒的检测分析原理为：酶标板上的每个实验孔与阳性对照孔均包被有等量的FMC63 scFv蛋白，设置两个阴性孔（不含有FMC63 scFv蛋白），加入待测样本和兔抗FMC63 scFv多抗，洗板后加入生物素标记的FMC63 scFv蛋白，加入HRP-链霉亲和素后，显色反应越深，说明血清样本中含有抗FMC63 scFv的抗体越多。根据已知的兔抗FMC63 scFv多抗浓度及其对应的OD值（酶标仪测定），绘制参考曲线，即可推算出待测样本中抗FMC63scFv抗体的滴度。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

（一）本发明利用重组表达的FMC63 scFv以及生物素标记的FMC63 scFv检测血清样本中FMC63 CAR-T免疫原性，以兔抗FMC63 scFv多抗表示临床FMC63 CAR-T产生的抗药抗体滴度。以此开发出的检测试剂盒能准确灵敏地检测抗药抗体的滴度，样品前处理简单，耗时少，能同时检测大量样品，检测成本低，使用的免疫亲和柱纯化的兔多抗，亲和力高，且能表征临床抗药抗体产生的状态，相较单克隆抗体更具代表性。

（二）本发明用于包被酶标板的蛋白为FMC63 scFv蛋白，由人HEK293细胞表达，维持了天然蛋白结构。

（三）酶标板上FMC63 scFv蛋白的包被量，以及生物素标记的FMC63 scFv蛋白用量均采用棋盘法，以灵敏度、检测范围为指标进行优化。

（四）本发明采用桥连ELISA方法进行临床上FMC63 CAR-T免疫原性的检测。并进行灵敏度、特异性、准确性和精密度的优化。

（五）试剂盒中的检测试剂无放射性污染，对人体安全，且对环境友好，该试剂盒对解决大批量临床样本检测具有重要意义。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中兔抗FMC63多抗参考品抑制曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1 FMC63 CAR-T细胞免疫原性ELISA检测试剂盒的制备

本实施例中，FMC63 CAR-T细胞免疫原性ELISA检测试剂盒包含如下成分：

（1）预包被FMC63 scFv的蛋白酶标板（FMC63的包被浓度为1ug/mL），规格为96孔板；

预包被FMC63 scFv蛋白的酶标板的制备方法为：将含有FMC63 scFv蛋白的包被液加至96孔板中，于4℃包被过夜，用洗涤液洗板后，用封闭液进行封闭，洗剂后烘干密封保存。

其中，包被液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，具体成分为：15 mM Na₂CO₃，35 mMNaHCO₃，pH9.6。

（2）生物素（Biotin）标记的FMC63 scFv蛋白（生物素与FMC63 scFv蛋白的摩尔比为1:1），规格为30 ug，形式为冻干粉。

（3）兔抗FMC63 scFv蛋白多抗，规格为20 ug，形式为冻干粉。

（4）HRP标记的链霉亲和素购自ThermoFisher，规格为10ug，形式为冻干粉。

（5）浓缩（10×）洗涤液：20mM Tris，150mM NaCl，0.5% v/v Tween-20，pH7.4，规格为60 mL。

（6）稀释液（样品稀释液）：含0.5%牛血清白蛋白的浓缩洗涤液。

（7）单组分TMB显色液：50 mM Na₂HPO₄·12H₂O，25 mM柠檬酸，40 mg/mL四甲基联苯胺（用DMSO溶解），3% H₂O₂，pH5.5（用NaOH调pH为5.5），规格为12 mL；

（8）反应终止液：1 M硫酸溶液，规格为7 mL。

实施例2 试剂盒的操作及结果计算

取实施例1的试剂盒，拆开真空包装袋并取出酶标板，在室温下平衡5分钟备用。用样品稀释液配制浓度为20000ng/ml，10000ng/ml，5000ng/ml，2500ng/ml，1250ng/ml，625ng/ml，312.5ng/ml，156.25ng/ml，78.125ng/ml，39.0625ng/ml，19.53125ng/ml，9.765625ng/ml，0ng/mL的兔抗FMC63 scFv多抗作为参考液，以及100μL处理好的血清样品（将血清样品用样品稀释液进行稀释，稀释比例为1:10）加到各孔中，参考样品和临床样品做3个重复。洗板后加入稀释到2ug/mL的生物素（Biotin）标记的FMC63 scFv蛋白，100μL/孔，37℃孵育60分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的洗剂液洗3次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；取稀释到0.4ug/ml的HRP标记的链霉亲和素加入到板孔中，100μL/孔，用稀释好的洗剂液洗3次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；取单组分TMB显色液，每孔加100μL，在暗处显色10~15分钟，然后每孔加入50μl的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值。

将参考品浓度值为横坐标，检测OD值为纵坐标，采用四参数拟合方程：y = (A -D) / [1 + (x/C)^B] + D作为FMC63 CAR-T检测参考曲线。测得曲线的四参数分别为：A =2.68，B =2.189，C = 536.5，D = 0.03。R²=0.9993（图1）。

其中，A:曲线上渐近线估值；

D:曲线下渐近线估值；

B:曲线的斜率；

C:最大结合一半时对应的剂量。

实施例3 试剂盒加速实验

将实施例1的试剂盒放置于37℃保存，分别取0、7、14、21、28d的试剂盒，以抗FMC63兔多抗参考品绘制拟合曲线，计算不同时间曲线的EC₅₀值。不同时间测定结果见表1：

从以上结果可以看出，EC₅₀值变化不大，试剂盒在4℃下至少可保存12个月以上。

实施例4 试剂盒组分冻融实验

将实施例1试剂盒中的组分，按照大于5ug每管进行分装，放置于-20℃保存，分别冻融1、2、3次，以抗FMC63兔多抗参考品绘制拟合曲线，计算不同时间曲线的EC₅₀值。不同时间测定结果见表2：

从以上结果可以看出，EC₅₀值变化不大，试剂盒中冻干粉组分在-20℃下冻融三次对活性无影响。

实施例5 试剂盒基质影响实验

利用实施例1试剂盒可以检测血清中抗FMC63 CAR-T抗体，验证不同血清基质（含0%、10%、20%、50%人血清的缓冲液以及100%人血清）对EC₅₀值的干扰。以抗FMC63兔多抗参考品绘制拟合曲线，计算不同基质中曲线的EC₅₀值。不同基质测定结果见表3：

从以上结果可以看出，EC₅₀值变化不大，试剂盒在不同基质中检测无影响，但是根据免疫原性指导原则，样品稀释比例建议1:10-1:100，因此考虑灵敏度建议最低稀释比例为1:10。

实施例6 试剂盒精密度实验

利用实施例1试剂盒可以检测血清中抗FMC63 CAR-T抗体，按照试剂盒操作步骤，连续6个分析批，每个分析批中至少2个重复。以抗FMC63兔多抗参考品绘制拟合曲线，计算1:10血清中曲线的EC₅₀值。测定结果见表4：

从以上结果可以看出，不同天数EC₅₀值变化不大，说明试剂盒精密度良好。

实施例7 试剂盒准确度实验

利用实施例1试剂盒可以检测血清中抗FMC63 CAR-T抗体，按照试剂盒操作步骤，设置5ug/ml、2.5ug/ml、0.6ug/ml高、中、低三个浓度，以抗FMC63兔多抗参考品绘制拟合标准曲线，计算不同质控浓度的值。不同质控值结果见表5：

从以上结果可以看出，试剂盒准确度良好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京百普赛斯生物科技股份有限公司

<120> FMC63 CAR-T细胞免疫原性ELISA检测试剂盒

<130> KHP211110139.9YS

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

130 135 140

Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr

145 150 155 160

Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr

165 170 175

Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser

180 185 190

Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

195 200 205

Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala

210 215 220

Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly

225 230 235 240

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Lys Ala

245

Claims

1.FMC63 CAR-T细胞免疫原性ELISA检测试剂盒，其特征在于，FMC63 CAR-T细胞是指以CD19为靶点，且表达FMC63的CAR-T细胞；

所述试剂盒至少包含：预包被FMC63 scFv蛋白的酶标板、生物素标记的FMC63 scFv蛋白、阳性对照、HRP标记的链霉亲和素、洗涤液、样品稀释液、显色液和反应终止液；

其中，所述阳性对照为抗FMC63 scFv蛋白多克隆抗体；

所述洗涤液为：20mM Tris，150mM NaCl，0.5% v/v Tween-20，pH7.4；

所述稀释液为：含0.5%牛血清白蛋白的洗涤液；

所述显色液为：50 mM Na₂HPO₄·12H₂O，25 mM柠檬酸，40 mg/mL四甲基联苯胺，3% H₂O₂，pH5.5；

所述反应终止液为1 M硫酸溶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为兔抗FMC63 scFv蛋白多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，酶标板上包被的FMC63 scFv蛋白的浓度为1ug/mL。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述预包被FMC63 scFv蛋白的酶标板的制备方法为：将含有FMC63 scFv蛋白的包被液加至96孔板中，于4℃包被过夜，用洗涤液洗板后，用封闭液进行封闭；

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的FMC63 scFv蛋白中，生物素与FMC63的摩尔比为1-2:1，其使用浓度为2ug/mL。

6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述FMC63 scFv蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。