CN112394134B - 西咪替丁原料药的有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种西咪替丁原料药的有关物质的检测方法，采用反相高效液相色谱法，以磷酸盐缓冲液与乙腈作为流动相进行梯度洗脱分离，检测波长为210～230nm。本方法实现了原料药中西咪替丁及其相关杂质的分离，检测速度快、专属性强、灵敏度高、重复性好、成本低，是西咪替丁原料药质量控制的有效检测方法，有利于准确快速的控制西咪替丁原料药的内在质量，确保药品安全有效。

Description

西咪替丁原料药的有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种西咪替丁原料药的有关物质检测方法。
背景技术
西咪替丁(cimetidine，甲氰脒胍)是1975年上市的可选择性H2受体拮抗剂，有显著抑制胃酸分泌的作用，能明显抑制基础和夜间胃酸分泌，也能抑制由组胺、分肽胃泌素、胰岛素和食物等刺激引起的胃酸分泌，并使其酸度降低，对因化学刺激引起的腐蚀性胃炎有预防和保护作用，对应激性胃溃疡和上消化道出血也有明显疗效。用于治疗十二指肠溃疡、胃溃疡、上消化道出血，慢性结肠炎，带状疱疹，慢性荨麻疹等症。对抗病毒及免疫增强有一定的作用。
西咪替丁的中文化学名为N'-甲基-N"-[2[[(5-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基]硫代]乙基]-N-氰基呱，分子式为C10H16N6S，结构式为：
Figure GDA0003795061680000011
自西咪替丁问世多年来，各国专利文献相继报道了多种不同的工艺路线，其目的在于缩短反应步骤，改进工艺条件，提高收率，从而降低成本。其合成路线大体可分为三种：一、直线顺序法，二、会聚法，三、反向直线顺序法。目前国内西咪替丁原料药合成主要采用的是直线顺序法，工艺合成步骤大致是：(a)4-甲基咪唑与半胱胺盐酸盐缩合得到一缩物(杂质J)；(b)一缩物与氰亚胺荒酸二甲酯缩合得到二缩物(杂质A)；(c)二缩物与一甲胺发生胺化得到西咪替丁。目前，各主要国家药典[主要是中国药典(2015版)、美国药典(USP40)、欧洲药典(EP9.0)、日本药典(JP14)]关于西咪替丁原料药的质量标准中，欧洲药典(EP9.0)中对特定杂质和非特定杂质详细列出且限度要求最严。根据上述合成工艺路线中所用到的起始物料、中间体及可能产生的副产物并结合欧洲药典(EP9.0)中所规定的特定杂质及非特定杂质，汇总了西咪替丁原料药质量控制中可直接通过高相液相色谱法控制的起始物料、中间体、合成副产物、降解产物。如下表：
Figure GDA0003795061680000021
Figure GDA0003795061680000031
对主要国家药典(主要是中国药典(2015版)、美国药典(USP40)、欧洲药典(EP9.0)、日本药典(JP14))中对于西咪替丁原料药质量标准中有关物质检查项下规定进行比较发现：中国药典(2015版)、美国药典(USP40)、欧洲药典(EP9.0)中均使用了HPLC法对西咪替丁原料药有关物质进行检测，日本药典(JP14)中使用薄层色谱法进行检测。薄层色谱法准确度较差，缺点明显；中国药典(2015版)、美国药典(USP40)、欧洲药典(EP9.0)均使用己烷磺酸钠缓冲液-甲醇体系作为流动相，缓冲液中均加入了磷酸调节pH值，欧洲药典(EP9.0)中还加入了扫尾剂二乙胺。由于流动相中添加了离子对试剂己烷磺酸钠，导致色谱柱不耐用、方法重现性差；结合前期对欧洲药典(EP9.0)中有关物质检查方法的重现结果来看，其所需检测时间较长(＞130min)，且杂质C与杂质D之间分离度较差，需对色谱条件进行优化，以获得耐用性好、准确度高、检测速度快、成本低的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用高效液相色谱分离测定西咪替丁及其相关杂质的分离，实现对西咪替丁原料药有关物质的快速、准确、低成本检测。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
西咪替丁原料药的有关物质的检测方法，采用反相高效液相色谱法，采用反相高效液相色谱柱，以流动相A：磷酸盐缓冲液与流动相B：乙腈作为流动相进行梯度洗脱，检测波长为210～230nm。
优选的，所述流动相A的pH值为2.5～3.5磷酸盐缓冲液为每1000ml中含磷酸二氢钾0.01mol和六氟磷酸钾0.02mol。
优选的，所述反相高效液相色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂或效能相当的填充剂，本发明一个具体的技术方案采用Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×150mm，5μm。
优选的，所述高效液相色谱法的梯度程序为：
Figure GDA0003795061680000041
优选的，对照品溶液、系统实用性溶液、供试品溶液的稀释液为流动相A。
优选的，所述供试品溶液的浓度为每1ml中约含西替丁0.4mg。
优选的，所述对照品溶液的浓度为每1ml中约西咪替丁0.8μg。
本发明所述的检测方法，高效液相色谱法流动相的流速为0.8～1.2ml/min，色谱柱柱温是20～40℃，检测器为紫外检测器，检测波长为210～230nm。
本发明所述的检测方法，理论塔板数以西咪替丁峰计算不低于10000，西咪替丁峰与相邻杂质峰的分离度大于4.0，各已知杂质之间的分离度不低于1.5。本发明一个具体操作如下：
精密称取西咪替丁原料药适量，加流动相A适量溶解并定量稀释每lml中约含0.4mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用流动相A稀释至每lml中约含0.8μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。精密量取对照溶液与供试品溶液各25μ1，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.2％)，总杂不得大于对照溶液主峰面积5倍(1.0％)。供试品溶液中任何小于对照溶液主峰面积0.1倍的峰忽略不计(0.02％)。
本发明的有益效果：
本发明对西咪替丁原料药及其相关杂质进行了定位与分离，杂质I、4-甲基咪唑、杂质G、杂质E、杂质J、杂质D、杂质C、西咪替丁、杂质B、杂质A、氢亚胺荒酸二甲酯、杂质H、杂质F依次出峰，各峰之间的分离度均在1.5以上。本发明提供了一种检测速度快、成本低、专属性强、灵敏度高、重复性好的西咪替丁的有关物质检测方法，有利于准确快速的控制西咪替丁原料药的内在质量，确保药品安全有效。
附图说明
图1为实施例1中系统适用性溶液的HPLC图。
图2为实施例2中供试品溶液的HPLC图。
图3为实施例3中系统适用性溶液的HPLC图。
图4为实施例4中使用色谱柱1时系统适用性溶液的HPLC图。
图5为实施例4中使用色谱柱2时系统适用性溶液的HPLC图。
图6为实施例5中磷酸盐缓冲液pH为2.3时系统适用性溶液的HPLC图。
图7为实施例5中磷酸盐缓冲液pH为2.8时系统适用性溶液的HPLC图。
图8为实施例5中磷酸盐缓冲液pH为3.5时系统适用性溶液的HPLC图。
图9为实施例6中使用梯度程序1进行洗脱时系统适用性溶液的HPLC图。
图10为实施例6中使用梯度程序2进行洗脱时系统适用性溶液的HPLC图。
图11为实施例6中使用梯度程序3进行洗脱时系统适用性溶液的HPLC图。
图12为实施例7中磷酸盐缓冲液pH为2.5时系统适用性溶液的HPLC图。
图13为实施例7中磷酸盐缓冲液pH为2.8时系统适用性溶液的HPLC图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例、对比例和试验例对本发明进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例1
鉴于中国药典(2015版)、美国药典(USP40)、日本药典(JP14)对于西咪替丁原料药中杂质限度均只规定了单杂及总杂而欧洲药典(EP9.0)中还对西咪替丁原料药的特定杂质(杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H)和非特定杂质(杂质A、杂质I、杂质J)的限度进行了规定，且中国药典(2015版)、美国药典(USP40)、欧洲药典(EP9.0)中均采用高效液相色谱法对对西咪替丁原料药有关物质进行检查，流动相体系及采集时间基本一致，故拟采用欧洲药典(EP9.0)中原料药有关物质检查色谱条件进样测试。
实施例1
液相色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器
色谱柱：YMC-PACK ODS-AQ(4.6×250mm，5μm)。
流动相A：己烷磺酸钠缓冲液(每1000ml中含己烷磺酸钠1.1g和二乙胺0.4ml，并用磷酸调pH至2.8)-甲醇(78:25，V/V)。
流动相B：甲醇。
按下表进行梯度洗脱：
Figure GDA0003795061680000061
柱温：30℃。
检测波长：220nm。
流速：1.1ml/min。
进样体积：50μl。
实验步骤：
流动相A：取己烷磺酸钠1.1g、三乙胺0.4ml加水1000ml溶解后用磷酸调pH至2.8，抽滤。取滤液780ml加甲醇250ml混合即得。
各杂质储备液：取杂质B、C、D、E、F、G、H各2mg分别置100ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀即得；另取杂质A、I、J各1mg分别置100ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
各杂质定位溶液：精密移取各杂质储备液各1ml分别置于25ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀即得。
系统适用性溶液：取西咪替丁原料药10mg，置25ml量瓶中，加入各杂质储备液各1ml，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
取各杂质定位溶液、系统适用性溶液各50μl分别注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。系统适用性溶液色谱图如图1所示，结果显示在此色谱条件下，杂质G、杂质I、杂质E、杂质J、西咪替丁、杂质D、杂质C、杂质B、杂质H、杂质A、杂质F依次出峰，主峰稍有拖尾；杂质D与杂质C之间的分离度仅为1.35，分离度较差；且在此色谱条件下，基线波动较大，梯度峰较多较杂；分析时间长达130min，检测速度较慢。由于杂质较多，部分峰对应的杂质名称未在图谱中进行标注，系统适用性溶液中各组分保留时间及与相邻组分的最小分离度统计如下表1。
表1系统适用性溶液的组分表
化合物名 保留时间(min) 分离度
杂质G 3.867 9.69
杂质I 5.563 8.38
杂质E 6.733 1.94
7.122 1.60
7.592 1.60
11.142 1.58
12.041 1.58
16.388 1.76
杂质J 17.298 1.76
西咪替丁 18.689 2.12
杂质D 31.843 1.35
杂质C 33.097 1.35
杂质B 37.082 2.86
杂质H 40.028 2.57
杂质A 42.953 2.57
46.915 1.60
49.301 1.60
杂质F 83.968 16.3
101.818 16.3
。
实施例2色谱条件优化
鉴于在实施例1的色谱条件下主峰稍有拖尾，杂质D与杂质C之间的分离度较差，且在此色谱条件下，基线波动较大，梯度峰较多较杂；分析时间较长，检测速度较慢。因此拟对色谱条件进行优化。
液相色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器。
色谱柱：YMC-PACK ODS-AQ(4.6×250mm，5μm)。
流动相：六氟磷酸钾缓冲液(0.01mol/L，pH2.8)-甲醇(85:15，V/V)。
采用等度洗脱。
柱温：30℃。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
进样体积：50μl。
实验步骤：
流动相A：取六氟磷酸钾1.84g、加水1000ml溶解后用磷酸调pH至2.8，抽滤。取滤液850ml加甲醇150ml混合即得。
供试品溶液：取西咪替丁原料药10mg，置25ml量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
取供试品溶液50μl注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。供试品溶液色谱图如图2所示，结果显示在此色谱条件下，西咪替丁保留时间为15.2min，主峰前有多个杂质峰无法分离，主峰后的杂质峰展宽明显，检测灵敏度低。
实施例3色谱条件优化
鉴于在实施例2的色谱条件下主峰前有多个杂质峰无法分离，主峰后杂质峰展宽明显，检测灵敏度低。因此拟对色谱条件进行优化。
液相色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器。
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×150mm，5μm)。
流动相A：磷酸盐缓冲液(每1000ml中含磷酸二氢钾0.01mol和六氟磷酸钾0.02mol，磷酸调pH至2.8)。
流动相B：乙腈。
按下表进行梯度洗脱:
Figure GDA0003795061680000081
Figure GDA0003795061680000091
柱温：30℃。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
进样体积：50μl。
实验步骤：
流动相A：取六氟磷酸钾3.68g、磷酸二氢钾1.36g加水1000ml溶解后用磷酸调pH至2.8，抽滤，即得。
各杂质储备液：取杂质B、C、D、E、F、G、H各2mg置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得；另取杂质A、I、J各1ml置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
系统适用性溶液：取西咪替丁原料药10mg，置25ml量瓶中，加入各杂质储备液各1ml，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
取系统适用性溶液50μl注入液相色谱仪，采用上述色谱条件检测，记录色谱图。系统适用性溶液色谱图如图3所示，结果显示在此色谱条件下，杂质I、杂质G、杂质E、杂质J、西咪替丁、杂质D、杂质C、杂质B、杂质A、杂质H、杂质F依次出峰，杂质B与西咪替丁原料药中未知杂质(杂质1)分离度为0.89，分离度较差外；其他各杂质及主峰之间的分离度均在1.5以上，分离度较好。由于杂质较多，部分峰对应的杂质名称未在图谱中进行标注，系统适用性溶液中各组分保留时间及与相邻组分的最小分离度统计如下表2。
表2系统适用性溶液的组分表
Figure GDA0003795061680000092
Figure GDA0003795061680000101
实施例4色谱柱筛选
鉴于在实施例3的色谱条件下杂质B与西咪替丁原料药中未知杂质2无法有效分离。因此需继续对色谱条件进行优化，拟在此基础上对比不同色谱柱中系统适用性溶液中主峰及各杂质的出峰情况，筛选合适的色谱柱。
液相色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器。
色谱柱：分别使用下列两根色谱柱进样考察
色谱柱1：Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm，5μm)。
色谱柱2：ZORBAX SB-C18(4.6×150mm，5μm)。
流动相A：磷酸盐缓冲液(每1000ml中含磷酸二氢钾0.01mol和六氟磷酸钾0.02mol，磷酸调pH至2.8)。
流动相B：乙腈。
按下表进行梯度洗脱:
Figure GDA0003795061680000102
柱温：30℃。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
进样体积：50μl。
实验步骤：
流动相A：取六氟磷酸钾3.68g、磷酸二氢钾1.36g加水1000ml溶解后用磷酸调pH至3.5，抽滤，即得。
各杂质储备液：取杂质B、C、D、E、F、G、H各2mg置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得；另取杂质A、I、J各1ml置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
系统适用性溶液：取西咪替丁原料药10mg，置25ml量瓶中，加入各杂质储备液各1ml，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
取系统适用性溶液50μl注入液相色谱仪，采用上述三根色谱柱分别进样检测，记录色谱图。色谱柱1中系统适用性溶液色谱图如图4所示。色谱柱2中系统适用性溶液色谱图如图5所示。与实施例3结果对比，结果显示使用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×150mm，5μm)色谱柱时系统适用性溶液图谱中西咪替丁主峰及各杂质峰之间的分离情况远优于色谱柱1、色谱柱2。但是用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×150mm，5μm)色谱柱时系统适用性溶液图谱中杂质D与原料药中带入的未知杂质2无法有效分离。
实施例5缓冲盐pH值筛选
鉴于在实施例3、实施例4的色谱条件下杂质B与西咪替丁原料药中未知杂质2无法有效分离。因此需继续对色谱条件进行优化，拟在此基础上对比使用不同pH值的缓冲液作为流动相A时系统适用性溶液中主峰及各杂质的出峰情况，筛选合适pH值的缓冲液作为流动相A。
液相色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器。
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×150mm，5μm)。
流动相A：磷酸盐缓冲液(每1000ml中含磷酸二氢钾0.01mol和六氟磷酸钾0.02mol)，分别用磷酸调节pH值至2.3、2.8和3.5并分别进样测试。
流动相B：乙腈。
按下表进行梯度洗脱:
Figure GDA0003795061680000121
柱温：30℃。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
进样体积：50μl。
实验步骤：
流动相A：取六氟磷酸钾3.68g、磷酸二氢钾1.36g加水1000ml溶解后均分为3份。分别用磷酸调pH至2.3、2.8和3.5，抽滤，即得。
各杂质储备液：取杂质B、C、D、E、F、G、H各2mg置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得；另取杂质A、I、J各1ml置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
系统适用性溶液：取西咪替丁原料药10mg，置25ml量瓶中，加入各杂质储备液各1ml，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
取系统适用性溶液50μl注入液相色谱仪，采用上述三种不同pH值缓冲盐作为流动相A分别进样检测，记录色谱图。如图6、图7、图8，由于杂质较多，部分峰对应的杂质名称未在图谱中进行标注，系统适用性溶液中各组分保留时间及与相邻组分的最小分离度统计如下表3、表4、表5。结果显示：降低缓冲盐的pH值为2.3后杂质B与未知杂质2之间的分离度为1.65，分离情况有所改善；其他各杂质及主峰之间的分离度均在1.5以上，分离度较好。各杂质及主峰保留时间及与相邻峰的最小分离度统计如下表3所示，拟进一步对梯度洗脱程序进行优化。
表3磷酸盐缓冲液pH为2.3时系统适用性溶液的组分表
Figure GDA0003795061680000122
Figure GDA0003795061680000131
表4磷酸盐缓冲液pH为2.8时系统适用性溶液的组分表
化合物名 保留时间(min) 分离度
杂质I 3.089 1.72
杂质G 3.567 1.72
杂质E 5.4 2.45
杂质J 6.207 2.45
杂质D 14.695 3.77
杂质C 16.825 1.81
西咪替丁 18.223 1.81
未知杂质1 29.542 3.08
未知杂质2 31.708 0.89
杂质B 32.362 0.89
杂质A 34.133 2.01
未知杂质3 35.446 2.01
杂质H 38.015 4.15
杂质F 44.484 9.86
未知杂质4 58.025 18.1
。
表5磷酸盐缓冲液pH为3.5时系统适用性溶液的组分表
Figure GDA0003795061680000132
Figure GDA0003795061680000141
实施例6梯度洗脱程序优化
鉴于在实施例4、实施例5中已对色谱柱和缓冲盐pH值进行了优选，优选后色谱条件下系统适用性溶液图谱如图8，组分表如上表5，尝试进一步优化梯度洗脱程序，以使主峰与各杂质，及各杂质之间分离情况更好，提高色谱条件的耐用性，同时考虑到西咪替丁合成起始物料4-甲基咪唑、氰亚胺荒酸二甲酯可能在当前色谱条件下进行控制，拟加入其中一并研究。
液相色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器。
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×150mm，5μm)。
流动相A：磷酸盐缓冲液(每1000ml中含磷酸二氢钾0.01mol和六氟磷酸钾0.02mol，用磷酸调节pH值至2.3)。
流动相B：乙腈。
分别采用下列梯度程序进行洗脱。
梯度洗脱程序1：
Figure GDA0003795061680000142
梯度洗脱程序2：
Figure GDA0003795061680000151
梯度洗脱程序3：
Figure GDA0003795061680000152
柱温：30℃。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
进样体积：50μl。
实验步骤：
流动相A：取六氟磷酸钾3.68g、磷酸二氢钾1.36g加水1000ml溶解，用磷酸调pH至2.3，抽滤，即得。
各杂质储备液：取4-甲基咪唑、氰亚胺荒酸二甲酯、杂质B、C、D、E、F、G、H各2mg置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得；另取杂质A、I、J各1ml置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
系统适用性溶液：取西咪替丁原料药10mg，置25ml量瓶中，加入各杂质储备液各1ml，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
取系统适用性溶液50μl注入液相色谱仪，采用上述三种不同梯度洗脱程序分别进样检测，记录色谱图。如图9、图10、图11，由于杂质较多，部分峰对应的杂质名称未在图谱中进行标注，系统适用性溶液中各组分保留时间及与相邻组分的最小分离度统计如下表6、表7、表8。结果显示：在采用梯度洗脱程序1、梯度洗脱程序2系统适用性溶液图谱中4-甲基咪唑与杂质G出峰位置重合，杂质H与氰亚胺荒酸二甲酯出峰位置重合；在采用梯度洗脱程序3系统适用性溶液图谱中除杂质H与氰亚胺荒酸二甲酯之间分离度为1.03，分离度较差外，其他各杂质及主峰之间的分离度均能达到1.5以上，拟在此基础上对比使用不同pH值的缓冲液作为流动相A时系统适用性溶液中主峰及各杂质的出峰情况，筛选合适pH值的缓冲液作为流动相A。
表6使用梯度程序1进行洗脱时系统适用性溶液的组分表
化合物名 保留时间(min) 分离度
杂质I 2.969 1.42
杂质G 3.416 1.42
杂质E 4.962 2.35
杂质J 5.731 2.35
杂质D 13.104 3.48
杂质C 15.079 2.32
西咪替丁 16.857 2.32
未知杂质1 27.096 2.34
未知杂质2 28.48 1.65
杂质B 29.481 1.65
杂质A 30.978 1.64
未知杂质3 31.893 1.64
杂质H 34.142 4.31
杂质F 38.766 8.50
未知杂质4 49.896 16.8
。
表7使用梯度程序2进行洗脱时系统适用性溶液的组分表
Figure GDA0003795061680000161
Figure GDA0003795061680000171
表8使用梯度程序3进行洗脱时系统适用性溶液的组分表
化合物名 保留时间(min) 分离度
杂质I 3.25 2.30
4-甲基咪唑 3.757 2.30
杂质G 4.504 3.17
杂质J 6.016 3.33
杂质E 7.103 3.33
杂质D 16.214 5.35
杂质C 19.119 4.21
西咪替丁 22.122 4.21
未知杂质1 32.529 1.50
未知杂质2 33.435 1.50
杂质B 34.881 2.27
杂质A 36.541 2.36
未知杂质3 37.975 2.36
氰亚胺荒酸二甲酯 39.884 1.03
杂质H 40.611 1.03
杂质F 45.128 7.60
。
实施例7缓冲盐pH值筛选
鉴于在实施例6中对梯度洗脱程序进行了优选，并结合实施例5中对缓冲盐筛选的结果，尝试在更改梯度洗脱程序后再次筛选合适pH值的缓冲液作为流动相A。
液相色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器。
液相色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器。
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×150mm，5μm)。
流动相A：磷酸盐缓冲液(每1000ml中含磷酸二氢钾0.01mol和六氟磷酸钾0.02mol)，分别用磷酸调节pH值至2.5和2.8并分别进样测试。
流动相B：乙腈
按下表进行梯度洗脱:
Figure GDA0003795061680000181
柱温：40℃。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
进样体积：50μl。
实验步骤：
流动相A：取六氟磷酸钾3.68g、磷酸二氢钾1.36g加水1000ml溶解，均分为2份，每份500ml，分别用磷酸调pH至2.5和2.8，抽滤，即得。
各杂质储备液：取4-甲基咪唑、氰亚胺荒酸二甲酯、杂质B、C、D、E、F、G、H各2mg置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得；另取杂质A、I、J各1ml置100量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
系统适用性溶液：取西咪替丁原料药10mg，置25ml量瓶中，加入各杂质储备液各1ml，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
取系统适用性溶液50μl注入液相色谱仪，采用上述两种不同pH值缓冲盐作为流动相A分别进样检测，记录色谱图。如图12、图13，由于杂质较多，部分峰对应的杂质名称未在图谱中进行标注，系统适用性溶液中各组分保留时间及与相邻组分的最小分离度统计如下表9、表10。结果显示：在其他条件不改变的条件下，磷酸盐缓冲液pH在2.3～2.8的范围内变动时，调高磷酸盐缓冲液pH，氰亚胺荒酸二甲酯与杂质H之间的分离度变好，杂质H与杂质F之间分离度变差。当磷酸盐缓冲液pH为2.8时，主峰与相邻杂质峰之间的最小分离度为6.46，各杂质峰之间的最小分离度为1.72，分离情况最好，选择该色谱条件作为西咪替丁原料药有关物质检查色谱条件。
表9磷酸盐缓冲液pH为2.5时系统适用性溶液的组分表
化合物名 保留时间(min) 分离度
杂质I 2.998 2.05
4-甲基咪唑 3.427 2.05
杂质G 4.204 2.46
杂质J 4.800 2.46
杂质E 5.889 3.99
杂质D 12.09 5.09
杂质C 14.412 5.09
西咪替丁 18.838 7.87
未知杂质1 26.948 3.74
未知杂质2 29.014 3.63
杂质B 30.959 2.17
杂质A 32.163 2.17
未知杂质3 34.464 3.64
氰亚胺荒酸二甲酯 36.882 1.58
杂质H 37.944 1.58
杂质F 38.972 1.90
未知杂质4 53.016 25.19
。
表10磷酸盐缓冲液pH为2.8时系统适用性溶液的组分表。
化合物名 保留时间(min) 分离度
杂质I 3.032 2.05
4-甲基咪唑 3.465 2.05
杂质G 4.224 2.87
杂质J 4.924 2.87
杂质E 6.022 3.91
杂质D 12.485 5.14
杂质C 14.874 5.14
西咪替丁 19.148 6.46
未知杂质1 27.644 3.16
未知杂质2 29.385 3.16
杂质B 31.334 2.17
杂质A 32.546 2.17
未知杂质3 34.837 3.33
氰亚胺荒酸二甲酯 36.981 1.72
杂质H 38.095 1.72
杂质F 39.566 2.69
未知杂质4 53.275 24.6
。

Claims (3)

1.西咪替丁原料药的有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，采用反相高效液相色谱柱，以流动相A：磷酸盐缓冲液与流动相B：乙腈作为流动相进行梯度洗脱，检测波长为210～230nm；所述磷酸盐缓冲液为每1000ml中含磷酸二氢钾0.01mol和六氟磷酸钾0.02mol，pH2.5-2.8；所述反相高效液相色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×150mm，5μm，梯度洗脱程序为：
Figure FDA0003856535450000011
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相流速为0.8～1.2ml/min，色谱柱柱温为30～40℃，检测波长为220nm。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法的理论塔板数以西咪替丁峰计算不低于10000，西咪替丁峰与相邻杂质峰的分离度大于4.0，各已知杂质之间的分离度不低于1.5。
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