CN112391416A - 乙二醛酶spg的功能及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种乙二醛酶SPG及其功能和应用。本发明揭示了乙二醛酶SPG是一种能够催化具有邻位羟基酮结构的化合物异构、脱水、环氧化的酶。SPG能够催化天然产物的芳香化反应、异构化反应、脱水反应和环氧化反应。同时，乙二醛酶SPG的同源物，包括乙二醛酶I家族蛋白，包括人类乙二醛酶GLO1，也能够不依赖GSH而进行催化反应。所述SPG还可以以其特异性的催化功能对特定底物发挥解毒作用。因此，SPG在生物毒素降解、抗病作物工程和芳香剂设计方面具有广阔的应用前景。

Description

乙二醛酶SPG的功能及应用

技术领域

本发明属于植物学以及分子生物学领域，更具体地，本发明涉及乙二醛酶SPG或其同源物的功能及应用。

背景技术

植物中存在很多芳香化的化合物，包括芳香族氨基酸、黄酮类化合物和一些生物碱等，这些芳香化的化合物大多从芳香族氨基酸得到苯环，或者由聚酮合酶PKS催化而来。酶促芳香化反应形成苯环，对于芳香化化学物质的合成具有重要应用价值。棉酚是一种倍半萜类化合物，是棉属植物中具有芳香化苯环结构的植保素，在抵御病菌、害虫和食草动物侵食等方面发挥重要作用。棉酚的生物合成途径研究一直为人们所重视，但由于缺乏相关的转录组数据，该途径进展较为缓慢。截止到目前，已经有一些棉酚生物合成途径的基因被分离鉴定。杜松烯合酶CDN是一个倍半萜环化酶，催化FPP形成杜松烯。三个细胞色素P450单加氧酶CYP706B1、CYP82D113和CYP71BE79 分别在杜松烯的骨架上进行羟化反应；脱氢酶DH1催化产生7-羰基-杜松烯 [1]。棉酚是如何被芳构化的，还是一个未解之谜。

甲基乙二醛(Methyglyoxal，MG)，也称为丙酮醛，含有两个活性羰基，是一种对细胞具有毒性的化合物，是糖酵解过程中产生的固有的毒性副产物，对所有以糖为能量来源的生物都是不可避免的[2]。生物体在长期的进化过程中产生了MG解毒系统，名为乙二醛酶系统。乙二醛酶系统由两个酶组成，乙二醛酶I(Glyoxalase I，GLO1，GLXI，EC 4.4.1.5)和乙二醛酶II(Glyoxalase II，GLO2，GLXII，EC 3.1.2.6)。MG和还原性谷胱甘肽GSH通过非酶促反应生成硫代半缩醛，经GLXI催化生成S-D-乳酰谷胱甘肽，随后GLXII催化 S-D-乳酰谷胱甘肽生成无毒的D-乳酸，并释放还原性谷胱甘肽以重复利用，从而达到解毒的作用[3]。其中GLXI是反应中的限速酶，在MG的代谢解毒方面起到重要作用，植物中GLXI家族成员众多，是否存在其它的催化功能还是未知。

真菌毒素是由镰刀菌、青霉菌和交链孢菌等感染植物和农作物形成的真菌次生代谢产物，污染粮油食品、畜牧饲料和水果蔬菜等，严重影响食品安全和人畜健康。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)及其酰基化衍生物3ADON和15ADON是最主要的真菌毒素，对谷物污染十分严重。其性质稳定，毒性高，被国际癌症研究机构IARC列为第三类致癌物，已被联合国粮农组织FAO和世界卫生组织WHO确定为最危险的天然食品污染物之一。采用生物学脱毒技术降解真菌毒素，具有绿色高效的优势，受到国际高度重视，但是此类研究目前进展缓慢。

综上，本领域中，以上各个方面的研究亟待进一步优化和提高。

发明内容

本发明的目的在于提供乙二醛酶SPG或其同源物的功能及应用。

在本发明的第一方面，提供乙二醛酶SPG或其同源物的用途，用于催化具有邻位羟基酮结构的环状化合物发生芳香化反应、异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应；或用于制备催化具有邻位羟基酮结构的环状化合物发生芳香化反应、异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应的制剂。

在一个优选例中，所述的环状化合物化合物为单环化合物或多环化合物 (包括双环化合物，如包含2～10个环)。

在另一优选例中，所述的邻位羟基酮结构包括：

其中X为环结构，如4～7元环，更佳地5～6元环。

在另一优选例中，所述的芳香化反应或异构化反应包括：形成苯环、增加环结构中的不饱和键数量、改变环结构中的不饱和键的位置、或改变环结构或其上基团的光学构象或手性。

在另一优选例中，所述的具有邻位羟基酮结构的环状化合物包括：3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼或其类似物，其经乙二醛酶SPG或其同源物催化发生芳香化反应和/或异构化反应，生成脱氧半棉酚(deoxyhemigossypol，dHG)或其类似物；或，8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯或其类似物，其经乙二醛酶SPG 或其同源物催化发生异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应，生成呋喃卡拉曼(furocalamen)或其类似物；或乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3A-DON)或其类似物，其经乙二醛酶SPG催化发生异构化反应，生成异构化乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇或其类似物。

在另一优选例中，所述的3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼和8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯为参与棉酚生物合成的中间物质，从而，所述的乙二醛酶SPG或其同源物被用于棉酚生物合成中。

在另一优选例中，所述乙二醛酶SPG包括：(a)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如 1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有(a)多肽功能的多肽；或(d)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:2的片段；较佳地，所述乙二醛酶SPG的编码基因的ID包括：Gh_A03G0247，Gh_A03G0248，Gh_D03G1320，Gh_D03G1321， Gh_D03G1322，Gorai.003G145000.1，Gorai.003G145100.1， Gorai.003G145200.1，Ga_01G2453，Ga_01G2453，GB_A03G0384， GB_A03G0385，GB_A03G0386，GB_D03G1602，GB_D03G1603， GB_D03G1604。

在另一优选例中，所述乙二醛酶SPG的同源物包括：乙二醛酶I(GLXI)，乙二醛酶GLO1；较佳地，所述的乙二醛酶I包括GhGLXI，CrGLXI，SmGLXI， OSGLXI，AtGLXI，DzGLXI，DmGLXI，DrGLXI；较佳地，所述的乙二醛酶GLO1包括HsGLO1。

在另一优选例中，所述的乙二醛酶SPG的同源物还包括所述乙二醛酶I 或乙二醛酶GLO1的变体，如与其任一的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有它们的功能的多肽。

在本发明的另一方面，提供乙二醛酶SPG的用途，用于降低或解除毒素脱氧雪腐镰刀菌醇(DON)的酰基化衍生物的毒性。

在本发明的另一方面，提供一种催化具有邻位羟基酮结构的环状化合物发生芳香化反应、异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应的方法，包括：以乙二醛酶SPG或其同源物处理所述具有邻位羟基酮结构的环状化合物。

在一个优选例中，所述的环状化合物化合物为单环化合物或多环化合物 (包括双环化合物，如包含2～10个环)；或，所述的邻位羟基酮结构包括：

其中X为环结构(如4～7元环，更佳地5～6元环)。

在另一优选例中，所述的芳香化反应或异构化反应包括：形成苯环、增加环结构中的不饱和键数量、改变环结构中的不饱和键的位置、或改变环结构或其上基团的光学构象或手性。

在另一优选例中，所述的具有邻位羟基酮结构的环状化合物包括：3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼，其经催化发生芳香化反应和/或异构化反应，生成脱氧半棉酚(deoxyhemigossypol，dHG)；或，8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯，其经催化发生异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应，生成呋喃卡拉曼 (furocalamen)；或乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3A-DON)，其经催化发生异构化反应，生成异构化乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇。

在本发明的另一方面，提供一种降低或解除脱氧雪腐镰刀菌醇(DON)或其酰基化衍生物的毒性的方法，包括以乙二醛酶SPG来处理。

在本发明的另一方面，提供一种提高乙二醛酶SPG在降低或解除甲基乙二醛(MG)毒性方面的能力的方法，包括对乙二醛酶SPG进行序列改造，使得其发生M69F/F101N突变、F101N/I121R突变或M69F/F101N/I121R，且其 Loop13中增加4个氨基酸GKMK(对应SEQ IDNO:2序列，在其153～154 位之间插入GKMK。

在本发明的另一方面，提供一种乙二醛酶SPG突变体，其具有降低或解除甲基乙二醛(MG)毒性方面的能力，其对应SEQ ID NO:2序列，发生 M69F/F101N突变、F101N/I121R突变或M69F/F101N/I121R，且其Loop13 中增加4个氨基酸GKMK。

在本发明的另一方面，提供一种合成棉酚的方法，包括：

(1)以法尼基二磷酸(FPP)为底物，以杜松烯合成酶(CDN)催化，获得(+)- δ-杜松烯；

(2)将(1)的产物，以P450单加氧酶CYP706B1催化，获得7-羟基-(+)- δ-杜松烯；

(3)将(2)的产物，以醇脱氢酶-1(DH1)催化，获得7-羰基-δ-杜松烯；

(4)将(3)的产物，以P450单加氧酶CYP82D113催化，获得8-羟基-7- 羰基-δ-杜松烯；

(5)将(4)的产物，以P450单加氧酶CYP71BE79催化，获得8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯；

(6)将(5)的产物，以乙二醛酶SPG进行催化，获得呋喃卡拉曼；

(7)将(6)的产物，以P450单加氧酶CYP736A196催化，获得2-羟基- 呋喃卡拉曼；

(8)将(7)的产物，以醇脱氢酶-1(DH1)催化，获得呋喃卡拉曼-2-酮；

(9)将(8)的产物，以2-酮戊二酸/Fe(ii)-依赖的双加氧酶-1催化，获得3- 羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼；

(10)将(9)的产物，以乙二醛酶SPG进行催化，获得脱氧半棉酚；

(11)将(10)的产物，自发反应获得半棉酚；

(12)将(11)的产物，以漆酶或过氧化物酶催化，获得棉酚。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、通过转录组分析及VIGS筛选到芳香化酶SPG。

a，SPG的表达与棉酚的积累呈正相关。SPG在无腺体棉和PGF抑制植株叶片中几乎不表达，而且能够受到激发子VdNEP的诱导。

b，SPG与棉酚途径其它已知基因的表达特征的相关性分析。

c，SPG在VIGS植株中的表达受到抑制。

d-i，SPG抑制植株叶片中半棉酚酮(d)、棉酚(e)、杀夜蛾素H1～H4(f-j) 含量显著下降。

图2、SPG和其它乙二醛酶I催化活性羰基醛的芳香化反应。

a，棉酚生物合成途径。SPG催化的步骤用浅色阴影表示。CDN：杜松烯合成酶；DH1：醇脱氢酶-1；2-ODD-1：2-酮戊二酸/Fe(ii)-依赖的双加氧酶-1。

b-d，LC-MS检测SPG和GLXI的酶活产物。测定了陆地棉(G.hirstum) 的乙二醛酶IGhGLXI、SPG和人乙二醛酶HsGLO1的活性。

e，酶学动力学测定。变性的蛋白质进行酶活实验作为实验的对照。

图3、SPG能够以3A-DON为底物进行催化反应。

a，SPG催化3A-DON(15)异构化反应的高效液相色谱图。

b，SPG催化3A-DON产生分子量为304的化合物。进行了三次生物学重复，得到相类似的结果。

c、不同浓度3A-DON和iso-3A-DON对小鼠成纤维细胞的毒性比较。每个值都是五个独立实验的结果。

d，S-D-乳糖谷胱甘肽的形成涉及到C2羰基转移到C3。

e，SPG催化3A-DON转化将双键从C9-C10转移到C8-C9，将C8羰基转移到C7。

f，化合物12到13的异构化涉及到羰基从C-2到C-3的转移，迫使 C1-C11双键转移到C1-C2，然后C-3羰基的烯醇化提供了环芳构化。

g，化合物5到9的转化涉及到两轮异构化转变，即C7羰基到C11， C6-C7双键到C7-C8，这可能涉及到活性袋中中间体的反弹，以重新与锌离子协调。然后，中间体的C8羟基攻击C11羰基，在C8和C11之间形成半缩醛，经过两次连续脱水，最终得到芳香环B。

图4、通过NMR对呋喃卡拉曼(化合物9)的结构进行鉴定。

图5、通过NMR对iso-3A-DON(化合物16)的结构进行鉴定。

图6、SPG丢失了GSH结合功能。

a，SPG与经典乙二醛酶I的序列比对。绿色表示的是SPG的蛋白序列，蓝色表示的陆地棉中乙二醛酶I GhGLXI的蛋白序列，其它黑色表示的是其它物种中的乙二醛酶I。

b，Docking实验表明SPG结合GSH的位点发生了改变。以结合了S-(N- 羟基-N-P-碘代苯甲酰-Bamoyl)谷胱甘肽(HIPC-GSH)底物的人GLO1蛋白结构(PDB ID:1QIN)为模板。

c-d，SPG对MG-GSH加合物(半硫代乙缩醛)失去了活性。基于图b对陆地棉乙二醛酶I GhGLXI(c)和SPG(d)相应位点进行互变，图c显示了 GhGLXI突变体的活性出现不同程度的丧失，而图d显示SPG突变体部分恢复了对半硫代乙缩醛的活性。活动(单位/L)表示为平均值±SE，n＝3。

e，SPG和GhGLXI基因的染色体定位。每个亚基因组在13号染色体上有一个GLXI，在3号染色体上有两个(A亚基因组)和四个(D亚基因组)SPG，这表明在祖先出生后有局部扩增。

f，卡通图显示SPG结构域丢失，叶绿体转运肽(绿色)的丢失和谷胱甘肽结合位点(红色)的替换。

图7、SPG定位于细胞质。

a-b，陆地棉GhGLXI的可变剪切模型。

c，相比于GhGLXI来说SPG丢失了N端的质体定位信号肽。

d，SPG的亚细胞定位，将SPG的C端融合YFP，将农杆菌注射烟草叶片，FM-64用来标注细胞膜。

具体实施方式

本发明揭示了一种乙二醛酶I(SPG)，其是一种能够催化具有邻位羟基酮结构的化合物异构、脱水、环氧化的酶。本发明的研究证明，SPG能够催化天然产物的芳香化反应、异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应。同时，乙二醛酶I(SPG)的同源物，包括乙二醛酶I(GLXI)家族蛋白，乙二醛酶GLO1，也能够不依赖GSH而进行催化反应。所述SPG还可以利用3A-DON为底物进行催化反应，生成分子量相同的低毒产物iso-3A-DON。因此，SPG在生物毒素降解、抗病作物工程和芳香剂设计方面具有广阔的应用前景。

如本文所用，所述的“乙二醛酶I(SPG)”、“乙二醛酶SPG”或“SPG”可互换使用，为具体SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或该序列其同源性较高 (如80％以上；较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳地95％以上；如98％以上或99％以上)的多肽(蛋白)。

如本文所用，所述的“乙二醛酶SPG同源物”是指与乙二醛酶SPG来自不同的物种，但是具有序列同源性(如40％以上；较佳地50％以上；更佳地 55％以上)的多肽(蛋白)。所述“同源物”包括在多个物种中乙二醛酶SPG的同源多肽，例如但不限于：乙二醛酶I(GLXI)，乙二醛酶GLO1。

乙二醛酶SPG及其同源物

本发明中，所述的乙二醛酶SPG可以是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。同时，也可以是来自同物种的同功能多肽，包括但不限于由下述基因ID所编码的多肽：Gh_A03G0247，Gh_A03G0248，Gh_D03G1320， Gh_D03G1321，Gh_D03G1322，Gorai.003G145000.1，Gorai.003G145100.1， Gorai.003G145200.1，Ga_01G2453，Ga_01G2453，GB_A03G0384， GB_A03G0385，GB_A03G0386，GB_D03G1602，GB_D03G1603， GB_D03G1604。

本发明中，所述的乙二醛酶SPG同源物可以包括包括乙二醛酶I(GLXI)，乙二醛酶GLO1；更具体地可以包括：GhGLXI，CrGLXI，SmGLXI，OSGLXI， AtGLXI，DzGLXI，DmGLXI，DrGLXI；HsGLO1。但是，由于乙二醛酶I 在许多物种中均保守性地存在，因此应理解，本发明中并不仅限于上述具体列举的乙二醛酶SPG同源物。

本发明中还包括具有与上述多肽具有相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地 1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/ 或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明还提供所述多肽的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

本发明中，也包括编码上述多肽的多核苷酸。编码乙二醛酶SPG或其同源物的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。编码乙二醛酶SPG或其同源物的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列) 以及非编码序列。

本发明中，也包括含有上述多核苷酸的表达载体以及宿主细胞，利用它们可以通过重组表达的方式获得活性的多肽。

功能和应用

在本发明的具体实施例中，本发明人通过生物信息学分析及病毒诱导的转基因沉默技术(VIGS)，筛选到本发明所述的乙二醛酶I(SPG)，其能够参与到棉酚的生物合成中。通过VIGS本发明人发现SPG抑制植株中棉酚、半棉酚酮及杀夜蛾素的含量急剧下降，证明SPG在棉花体内参与到了棉酚等萜类化合物的生物合成。通过体外酶活实验，本发明人发现SPG可以在不依赖于 GSH的前提下，催化棉花中两个具有邻位羟基酮结构的化合物(3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼和8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯)的芳香化，从而参与到了棉酚的生物合成过程中。本发明人首次发现，植物和动物，包括人类中的GLXI 都能催化棉花中天然产物的芳香化，而且也是不依赖于GSH的。

基于本发明人的新发现，本发明提供了乙二醛酶SPG或其同源物的用途，用于催化具有邻位羟基酮结构的环状化合物发生芳香化反应、异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应。同时，所述乙二醛酶SPG或其同源物也可被用于制备催化具有邻位羟基酮结构的环状化合物发生芳香化反应、异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应的制剂。

在包含有邻位羟基酮结构

的情况下，所述的环状化合物所包含的环的数量没有特别的限制，可以为单环化合物或多环化合物，如包含2～ 10个环，更具体地如3、4、5、6个环。所述的

结构中，X环可以为 4～7元环，更佳地5～6元环。

所述的芳香化反应又称为“芳构化反应”，主要指由烷烃或环烷烃转变为芳香烃或类似化合物的反应。

所述的异构化反应，是指化合物经由本发明中的乙二醛酶SPG或其同源物催化后，其立体结构(构型)发生了变化。

本发明中，所述的芳香化反应或异构化反应包括：形成苯环、增加环结构不饱和键数量、改变环结构中的不饱和键的位置、或改变环结构或其上基团的光学构象或手性。

在本发明的具体实施例中，论证了具有邻位羟基酮结构的环状化合物发生了所述的芳香化反应、异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应，包括：以 3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼为底物，其经乙二醛酶SPG催化发生芳香化反应和/或异构化反应，生成脱氧半棉酚(deoxylhemigossypol，dHG)；以8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯为底物，其经乙二醛酶SPG催化发生异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应，生成呋喃卡拉曼；或以乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇为底物，其经催化发生异构化反应，生成异构化乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇。应理解，上述实施例中论证的底物的类似物、衍生物或与这些底物具有相同母环结构的化合物，也可以被乙二醛酶SPG催化发生反应，也包含在本发明的范围内。

上述的底物中，所述的3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼和8,11-二羟基-7-羰基 -杜松烯为参与棉酚生物合成的中间物质。因此，所述的乙二醛酶SPG在棉酚生物合成中发挥催化作用。因此，乙二醛酶SPG或其同源物可被应用于棉酚的生物合成，包括体外合成或人工合成。

乙二醛酶SPG或其同源物催化含有邻位羟基酮结构的天然产物形成苯环的的芳香化反应，对芳香化化学物质的人工合成具有重要的应用价值。同时，其能够催化底物发生异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应，也具有显著的应用价值。

在本发明的具体实施例中，本发明人还通过寻找底物类似物，发现禾谷镰孢菌产生的毒素脱氧雪腐镰刀菌醇(DON)及其酰基化衍生物具有类似的邻位羟基酮的结构，体外酶活实验表明SPG可以利用3A-DON为底物进行催化反应，生成分子量相同的产物iso-3A-DON，还能够产生另外一个分子量为 304但是结构未知的化合物(预测可能为不稳定反化合物可)。动物细胞培养的毒性实验表明，iso-3A-DON毒性较3A-DON大大降低。进一步研究发现，其它物种中的GLXI并不能催化3A-DON的转化，因而这个活性可能是SPG 所独有的。

因此，本发明还提供了乙二醛酶SPG的用途，用于降低或解除毒素脱氧雪腐镰刀菌醇或其酰基化衍生物的毒性。SPG可以作为解毒制剂应用到食品真菌毒素的生物解毒，也可以用来培育具有禾谷镰孢菌抗性或抑制真菌毒素积累的农作物。

经典的GLXI在发挥功能时，都需要有GSH的参与，通过蛋白序列比对及蛋白质模拟。在本发明的具体实施例中，本发明人发现，SPG丢失了GSH 的结合位点，同时SPG也丢失了对MG的解毒活性。此外，与棉花中的GLXI 不同，SPG丢失了质体定位的信号肽，亚细胞定位实验表明SPG定位于细胞质中，与棉酚生物合成在细胞质中进行是相吻合的。本发明人还对SPG进行了改造，预测其一些可能与解毒功能相关的位点，并进行一一突变和验证，结果发现SPG丢失了对MG的解毒能力，但是将GSH结合位点进行置换后，某些突变体部分恢复了对MG的解毒能力。

因此，本发明还提供了一种提高乙二醛酶SPG在降低或解除甲基乙二醛 (MG)毒性方面的能力的方法，包括对乙二醛酶SPG进行序列改造，使得其发生M69F/F101N突变、F101N/I121R突变或M69F/F101N/I121R，且其Loop13 中增加4个氨基酸GKMK(在其153～154位之间)。本发明还提供了所制备的突变体多肽。本发明的这一发现，为改变乙二醛酶SPG的生物活性，用于进行MG解毒提供了新的途径。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、SPG参与棉酚的生物合成

a：SPG基因序列及蛋白序列

SPG基因ID：由于棉花在进化过程中发生过多次基因组加倍事件，因而 SPG同源基因有很多，在陆地棉(Gossypium hirsutum)中SPG的基因ID为： A亚基因组的Gh_A03G0247和Gh_A03G0248，D亚基因组的Gh_D03G1320， Gh_D03G1321和Gh_D03G1322。在雷蒙德氏棉中的ID为：Gorai. 003G145000.1、Gorai.003G145100.1、Gorai.003G145200.1。在亚洲棉中的基因ID为：Ga_01G2453和Ga_01G2453。在海岛棉中的基因ID为： GB_A03G0384、GB_A03G0385、GB_A03G0386、GB_D03G1602、GB_D03G1603 和GB_D03G1604。根据本领域公知知识，棉属植物中与SPG序列同源性在 90％以上，较佳地95％以上的蛋白被认为与SPG功能相同。

SPG(以Gh_D03G1322为例)核苷酸序列cDNA(SEQ ID NO:1)：

ATGGCGTCATTGGATTCAAAAGAATCACCTGCCAATAACCCAGGCCTTCATTTTCCCCCT GACGAAGCCACCAAAGGCTACATCATGCAGCAAACCATGTTTCGTATTAAGGATCCAAA ACGCACTCTTGAATTCTATAGTCGTGTTTTGGGCATGACGTTGCTTAACAAAGTGGATGTT CCATATATGAAAATGACATTGTATATGATGGGATATGAGGATGTTTCATCAGCTCCAACT GACCCAGTTGAGAAAACTATTTGGACATTTGGAAGACCAGCTACTATGGAACTGACACA CTTTTGGGGTACCGAAAACGATCCCGAGTTCAAAGGATATCACGATGGGAATTCGGAAC CTATTGGATTTGGGCACATCGGCCTTACCGTGGATGACTTGTACAAGGCATGCGAGAGAT TTGAAAGTCTTGGAGTGGAATTTGTCAAAAAACCAAGTGACGGTTTTGCATTCATCAAGG ATCCTGATGGTTATTGGATTGAAATCTTTGATTTGAAAGGAATTAGACAAATAGTTAACA GTTTAGCTTGA

SPG(以Gh_D03G1322为例)编码蛋白序列(SEQ ID NO:2)：

MASLDSKESPANNPGLHFPPDEATKGYIMQQTMFRIKDPKRTLEFYSRVLGMTLLNKVDVPY MKMTLYMMGYEDVSSAPTDPVEKTIWTFGRPATMELTHFWGTENDPEFKGYHDGNSEPIGF GHIGLTVDDLYKACERFESLGVEFVKKPSDGFAFIKDPDGYWIEIFDLKGIRQIVNSLA*

b：转录组分析发现SPG的表达与棉酚的积累呈正相关

棉酚基因的表达与棉酚的积累呈现正相关的特征，通过比较有腺体棉叶片(含有棉酚)和无腺体棉叶片(没有棉酚)的转录组，本发明人发现SPG同棉酚途径已知基因类似，都在无腺体棉叶片中几乎不表达。PGF是正调控棉花腺体发育和棉酚生物合成的bHLH类的转录因子[Ma，D.et al.Nat Commun 7，10456(2016)]，PGF抑制植株叶片中没有腺体，叶片中也不含有棉酚，本发明人发现SPG在PGF抑制植株叶片中也不表达。棉酚作为棉花最重要的植保素，能够受到真菌激发子VdNEP的诱导，本发明人发现 SPG同棉酚途径其它已知基因类似，也能够受到真菌激发子的诱导。如图1a所示。

通过相关性分析，本发明人发现SPG的表达特征与棉酚途径已知基因的表达特征的相关性非常高，如图1b所示，提示SPG参与棉酚生物合成。

c：构建SPG基因的病毒诱导的转基因沉默(VIGS)载体

PCR扩增300～500bp的基因特异片段(正向引物： GAGTAAGGTTACCGAATTCTCTAGATGCCAATAACCCAGGCCTTC(SEQ ID NO:7)，反向引物：CGCGTGAGCTCGGTACCGGATCCAACTCGGGATCGTTTTCGGT(SEQ ID NO:8))，正向引物引入BamHI酶切位点，反向引物引入 XbaI酶切位点装入pTRV2载体，利用同源重组的方法将SPG基因连接到 pTRV2载体(Biovector)上，将测序正确的载体转入农杆菌GV3101，28℃倒置培养2～3天。

d：将SPG基因VIGS载体转染棉花子叶

将测序正确的质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞，同时将包含pTRV1 载体的农杆菌划线(后续需要将装有基因片段的pTRV2载体农杆菌与pTRV1 农杆菌1/1混合后注射棉花子叶)，同时装有PDS基因(该基因为正对照)的 pTRV2农杆菌(SU)划线(SU与pTRV1农杆菌1/1混合注射棉花子叶后，可使叶片变黄，作为正对照)。挑取单克隆进行菌落PCR验证，将菌落PCR阳性的农杆菌克隆挑取至2mL选择抗性的液体LB培养基中，28℃培养过夜，至 OD值为2.5。同时将pTRV1和SU农杆菌小摇。将小摇的农杆菌，按照1:100 的比例，转接到50mL的选择抗性LB液体培养基中，继续在28℃震荡培养过夜。室温，8,000g离心10min，用等体积的重悬液(10mM MES，10mM MgCl₂，150μM acetosyringone，pH＝5.8)重悬，OD值调至1左右，室温放置至少3h，使菌体活化。将转有不同质粒的农杆菌重悬液与转有pTRV1载体的农杆菌重悬液以1：1(V/V)混合，用1mL注射器从棉花子叶背面注射进行转染。注射2～3周后观察正对照是否黄化，采取第二片真叶，液氮速冻，保存于-70℃。将SPG抑制植株的第二片真叶的RNA，进行qRT-PCR分析(表1)，发现SPG在VIGS植株叶片中表达量确实下调非常明显，如图1c所示。

表1、qRT-PCR所用引物

	序列(5’-3’)	序列编号
			His3-qPCR-F	GAAGCCTCATCGATACCGTC	SEQ ID NO:3
His3-qPCR-R	CTACCACTACCATCATGG	SEQ ID NO:4
			GhSPG-qPCR-F	ACGATCCCGAGTTCAAAGGA	SEQ ID NO:5
GhSPG-qPCR-R	CAAGTCATCCACGGTAAGGC	SEQ ID NO:6

e：HPLC检测SPG抑制植株叶片中棉酚及相关萜类化合物的含量

棉花叶片用液氮磨碎后每100mg材料加1ml叶片提取液，叶片提取液成分：乙腈:水:磷酸＝80:20:0.1。浸泡1小时，离心，上清用0.22μm滤头过滤，进行HPLC检测。

HPLC分析采用Agilent 1200系统，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18analytical column(150mm×4.6mm，5μm)反向C18分析柱。质谱检测采用安捷伦6120四级杆检测器，API-ES离子源，正离子模式，碎裂电压70V。HPLC 流动相：乙醇:甲醇:异丙醇:乙腈:水:乙酸乙酯:DMF:磷酸＝16.7:4.6:12.1: 20.2:37.4:3.8:5.1:0.1。流动相流速为1mL/min，进样量为10μL，柱温 40℃，检测时间50min。

经过HPLC的检测，发现在VIGS抑制SPG表达的株系中，棉酚、半棉酚酮及杀夜蛾素的含量均显著下降，结果如图1中d-i所示。说明SPG参与了棉花体内棉酚的生物合成。

实施例2、SPG基因克隆及原核表达载体构建和蛋白表达纯化

a：棉花总RNA的提取和cDNA反转录制备

取100mg棉花叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入1mL在65℃预热的 RNA提取试剂，立即涡旋剧烈震荡混匀，65℃放置30min。13,500g离心2 min。将上清液转移至新的2mL管中，加入0.6mL氯仿，13,500g，离心5 min，小心吸取上清至新的RNase-Free的离心管中。重复步骤3。上清转移至新的2mL管中，加入LiCl至终浓度为2M，-20℃放置3h。13,500g离心10min，倒掉废液，沉淀用70％的乙醇清洗两次，室温晾干后加入 RNase-Free ddH₂O。

RNA提取试剂：0.2M Tris，50mM EDTA，1M NaCl，1％CTAB，1％β-巯基乙醇，pH 8.0。

b：PCR扩增目的基因SPG及原核表达载体构建

用高保真酶

HS DNA Polymerase扩增SPG的全长cDNA片段(549bp)。PCR反应条件为：98℃，变性1分钟；98℃，变性10秒钟； 57℃，复性10秒；72℃，延伸40秒钟；72℃，5分钟；4℃保温。将 pET-32a载体用BamHI/SacI双酶切后，将SPG利用同源重组的方法连分别连接到pET-32a原核表达载体中。

c：原核表达

将测序正确的SPG的原核表达载体质粒转入BL21菌株，涂布于Amp 抗性的LB培养基上，37℃，倒置培养过夜。在96孔板中加入Amp抗性的 LB，挑取单克隆进行菌落PCR。PCR鉴定阳性的克隆加入到2mL抗性的液体LB(100μg/mL Ampr)中，37℃培养过夜。按照1:100的比例进行转接大摇，大摇体积可视情况而定，可定为100mL，37℃培养至OD600≈0.6(3h左右)。当OD600到达0.6左右时，加入IPTG到终浓度为0.5mM/L，转至18℃诱导蛋白表达，培养20h左右(培养箱需提前预冷)。吸取6mL过夜培养的菌液， 13,500g离心5min，沉淀悬浮于3mLbuffer[25mM Mopso，pH 7.0，5mM DTT，和10％甘油，5mM MgCl₂]中，利用one shot CellDisrupter System进行破碎，破碎压力20～25kpsi。4℃，13,500g，离心，取上清进行SDS-PAGE 电泳检测。

d：原核表达蛋白纯化

将100mL培养过夜的菌液分为2份，分装到2个50mL管中，13,500g 离心5min，收集肠杆菌细胞，分别重悬于5mL的Lysis buffer中，利用高压破碎仪进行低温破碎，将上清转入8mL管中。4℃，13,500g离心20min。此时可以装Ni-NAT agrose的小柱，一般100mL菌液可以使用1mL的Ni 柱，用10mL的Lysis buffer清洗Ni柱。将步骤2中的上清，过装好1mL Ni-NAT agrose的小柱。使用10mL的Wash buffer清洗Ni-NATagrose。使用2mL洗脱缓冲液(Elution buffer)将SPG蛋白从镍柱中洗脱，使用Bradford 法，以牛血清蛋白作参照，对SPG蛋白的浓度进行定量。

实施例3、SPG和同源乙二醛酶I的体外酶活实验和酶动力学分析

a：利用LC-MS检测SPG酶活体系的反应产物

SPG酶活体系：25mM HEPES，100μM ZnCl₂，5μg蛋白，100μM棉酚途径中间体底物，包括3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼 (3-hydro-furocalamen-2-one)和8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯 (8,11-dihydroxy-7-keto-(δ)-cadinene)。30℃反应两小时，利用乙酸乙酯进行萃取，抽干后溶于乙腈，过滤后进行HPLC-MS检测。当底物是乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3A-DON，详见实施例4)时，利用20μL甲醇将蛋白酶活体系中的蛋白去除，离心后取上清，过滤之后进行LC-MS分析。

以3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼或3A-DON为底物时的检测条件：HPLC 分析采用Agilent 1100系统，Agilent Eclipse XDB-C18semi-preparative column(250mm×9.4mm，5μm)反向C18分析柱。流动相为乙腈(B)和甲酸溶液(A)，甲酸浓度为0.1％，流动相流速为1mL/min，进样量为10μl。梯度洗脱条件：0-3min，20-70％B；3-5min，70-80％B；5-7min，80-84％B； 7-8min，84-100％B；8-10min，100-20％B。

以3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼为底物进行SPG体外酶活反应，HPLC分析结果发现了两个新的产物峰，一个为脱氧半棉酚(图2b所示)，一个是半棉酚(图2c所示)。至此，本发明人解析了完整的棉酚生物合成途径，如图2a所示。

以8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯为底物时的检测条件：HPLC分析采用 Agilent1100系统，Agilent Eclipse XDB-C18semi-preparative column (250mm×9.4mm，5μm)反向C18分析柱。流动相为乙腈(B)和甲酸溶液(A)，甲酸浓度为0.1％，流动相流速为1mL/min，进样量为10μl。梯度洗脱条件：0-6min，20-70％B；6-10min，70-80％B；10-14min，80-84％B；14-16min，84-100％B；16-18.5min，100％B；18.5-19min，100-20％B； 19-21min，20％B。体外酶活反应的产物检测峰如图2d所示，产物峰为呋喃卡拉曼。

进一步研究SPG和同源乙二醛酶I的体外酶活，发现多个物种包括棉花的乙二醛酶I GhGLXI和人的乙二醛酶HsGLO1都能以3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼和8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯为底物，催化其活性羰基醛结构的异构、脱水形成苯环的芳香化反应(图2b，c，d；表2)。通过酶动力学分析，本发明人发现SPG的催化能力远远高于GhGLXI。如图2e所示。SPG催化底物 3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼和8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯的反应机制如图3f和图3g所示。

表2、多个物种中乙二醛酶I的催化活性

活性1：底物为3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼；

活性2：底物为8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯。

实施例4、SPG能够以3A-DON为底物进行催化反应降低其毒性

通过寻找底物类似物，本发明人发现禾谷镰孢菌产生的毒素脱氧雪腐镰刀菌醇(DON)及其酰基化衍生物具有类似的邻位羟基酮的结构，体外酶活实验表明SPG可以利用乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3A-DON)为底物进行催化反应，经过LC-MS分析，发现SPG催化3A-DON产生了2个产物，第一个产物iso-3A-DON的分子量和3A-DON相同，皆为338(图3a)，另一个分子量是304，结构未知(图3b)。进一步比较发现，其它物种如人和棉花中的 GLXI并不能催化3A-DON的转化(图3a，b)，因而这个活性可能是SPG所独有的。

利用不同浓度的3A-DON和iso-3A-DON对小鼠成纤维细胞进行了毒性比较，表明iso-3A-DON毒性较3A-DON低(图3c)。由此，发现SPG可以利用3A-DON为底物进行催化反应，降低其毒性。SPG催化3A-DON的机制如图3e所示。

进一步以TMS为内标，在Bruker AVANCEIIITM 500核磁共振仪上检测了SPG酶活产物的结构。分析1H，13C NMR和2D NMR谱，分别对呋喃卡拉曼(化合物9)和iso-3A-DON(化合物16)的结构进行了鉴定。如图4和图5所示。

实施例5、通过序列比对及蛋白质模拟发现SPG的GSH结合位点发生改变

a：利用人乙二醛酶I蛋白GLO1的晶体结构进行模拟和底物docking 实验

通过序列比对本发明人得知SPG与人乙二醛酶I(GLO1)的蛋白相似性为 59％，说明SPG的序列是很保守的。本发明人将SPG与人乙二醛酶I的晶体结构进行比较，发现与GSH结合相关的4个位点发生了改变。

根据序列比对结果，SPG蛋白69位的氨基酸变成了M，而对应的 GhGLXI和其它物种的GLXI在此位置的氨基酸是F；SPG在101位置的氨基酸是F，而GhGLXI和其它物种的GLXI在此位置是N；SPG在121位置的氨基酸是I，而GhGLXI和其它物种的GLXI在此位置是R，另外SPG缺失了Loop13中4个氨基酸(其153～154位之间缺失GKMK)，GhGLXI在此处是GKMK。这些位点可能与GSH的binding密切相关，如图6b所示。本发明人根据这些位点的特征，对SPG和GhGLXI进行了组合突变，将SPG 相应的点突变成GhGLXI对应的点，相反，把GhGLXI相应的点突变成SPG 对应的点。如图6c中F119M代表将GhGLXI 119位的F变成M；再如图6d中SPG突变体M69F/F101N/I121R代表将SPG这三个位点的氨基酸置换成 GhGLXI对应位置的氨基酸。

b：SPG和GhGLXI乙二醛酶活性测定

用水溶液配置100mM GSH和MG，将1420μL 0.1M磷酸氢二钠溶液 (PH＝7.0)，40μL100mM GSH和40μL 100mM MG混合，在室温孵育15min，使MG和GSH自发反应成加合物。用磷酸氢二钠缓冲液将SPG稀释至0.4 ng/μL，将50μL和150μL加合物混匀，测定240nm处的吸光度变化。根据吸光度的变化，测定SPG的乙二醛酶I活力。1个单位(units/L)的乙二醛酶 I指的是能够在25℃，pH 7.0的溶液中，每分钟生成1μM产物的蛋白量。经过测定，本发明人发现，陆地棉乙二醛酶I GhGLXI具有MG解毒活性，而其突变体不同程度地丧失了对MG的解毒能力，如图6c所示。相反，SPG 丢失了对MG的解毒能力，但是将GSH结合位点进行置换后，某些突变体部分恢复了对MG的解毒能力，包括M69F/F101N/GKMK、 F101N/I121R/GKMK、M69F/F101N/I121R/GKMK，如图6d所示。

c：陆地棉中乙二醛酶I GhGLXI和特化的乙二醛酶I SPG的染色体分布和亚细胞定位

通过分析，本发明人得知SPG在染色体呈现串联重复，A亚基因组中的 Gh_A03G0247和Gh_A03G0248，D亚基因组中的Gh_D03G1320、 Gh_D03G1321、Gh_D03G1322、Gh_D03G1323。其中Gh_D03G1323在各个组织中几乎不表达，猜测是一个假基因。陆地棉乙二醛酶I GhGLXI位于13 号染色体上，分别是A13染色体的Gh_A13G2029和D13染色体的 Gh_D13G2432，如图6e所示。拟南芥只有一个锌离子依赖的乙二醛酶I，具有可变剪切，而GhGLXI也具有可变剪切，如图7a，b所示。与GhGLXI相比，SPG都缺失了N端的质体定位的信号肽，如图6f，图7c，d所示，这与倍半萜类化合物的生物合成位于细胞质中也是相吻合的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

主要参考文献

1.Tian，X.et al.Characterization of gossypol biosyntheticpathway.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 115， E5410-e5418(2018).

2.Richard，J.P.Mechanism for the formation of methylglyoxal fromtriosephosphates. Biochemical Society transactions 21，549-553(1993).

3.Sousa Silva，M.，Gomes，R.A.，Ferreira，A.E.，Ponces Freire，A.& Cordeiro，C.The glyoxalase pathway:the first hundred years...and beyond. Biochem J 453，1-15，doi:10.1042/BJ20121743(2013).

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 乙二醛酶SPG的功能及应用

<130> 195737

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 549

<212> DNA

<213> 棉属(Gossypium)

<400> 1

atggcgtcat tggattcaaa agaatcacct gccaataacc caggccttca ttttccccct 60

gacgaagcca ccaaaggcta catcatgcag caaaccatgt ttcgtattaa ggatccaaaa 120

cgcactcttg aattctatag tcgtgttttg ggcatgacgt tgcttaacaa agtggatgtt 180

ccatatatga aaatgacatt gtatatgatg ggatatgagg atgtttcatc agctccaact 240

gacccagttg agaaaactat ttggacattt ggaagaccag ctactatgga actgacacac 300

ttttggggta ccgaaaacga tcccgagttc aaaggatatc acgatgggaa ttcggaacct 360

attggatttg ggcacatcgg ccttaccgtg gatgacttgt acaaggcatg cgagagattt 420

gaaagtcttg gagtggaatt tgtcaaaaaa ccaagtgacg gttttgcatt catcaaggat 480

cctgatggtt attggattga aatctttgat ttgaaaggaa ttagacaaat agttaacagt 540

ttagcttga 549

<210> 2

<211> 182

<212> PRT

<213> 棉属(Gossypium)

<400> 2

Met Ala Ser Leu Asp Ser Lys Glu Ser Pro Ala Asn Asn Pro Gly Leu

1 5 10 15

His Phe Pro Pro Asp Glu Ala Thr Lys Gly Tyr Ile Met Gln Gln Thr

20 25 30

Met Phe Arg Ile Lys Asp Pro Lys Arg Thr Leu Glu Phe Tyr Ser Arg

35 40 45

Val Leu Gly Met Thr Leu Leu Asn Lys Val Asp Val Pro Tyr Met Lys

50 55 60

Met Thr Leu Tyr Met Met Gly Tyr Glu Asp Val Ser Ser Ala Pro Thr

65 70 75 80

Asp Pro Val Glu Lys Thr Ile Trp Thr Phe Gly Arg Pro Ala Thr Met

85 90 95

Glu Leu Thr His Phe Trp Gly Thr Glu Asn Asp Pro Glu Phe Lys Gly

100 105 110

Tyr His Asp Gly Asn Ser Glu Pro Ile Gly Phe Gly His Ile Gly Leu

115 120 125

Thr Val Asp Asp Leu Tyr Lys Ala Cys Glu Arg Phe Glu Ser Leu Gly

130 135 140

Val Glu Phe Val Lys Lys Pro Ser Asp Gly Phe Ala Phe Ile Lys Asp

145 150 155 160

Pro Asp Gly Tyr Trp Ile Glu Ile Phe Asp Leu Lys Gly Ile Arg Gln

165 170 175

Ile Val Asn Ser Leu Ala

180

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

gaagcctcat cgataccgtc 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

ctaccactac catcatgg 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

acgatcccga gttcaaagga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

caagtcatcc acggtaaggc 20

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

gagtaaggtt accgaattct ctagatgcca ataacccagg ccttc 45

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

cgcgtgagct cggtaccgga tccaactcgg gatcgttttc ggt 43

Claims (17)

1.乙二醛酶SPG或其同源物的用途，用于催化具有邻位羟基酮结构的环状化合物发生芳香化反应、异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应；或

用于制备催化具有邻位羟基酮结构的环状化合物发生芳香化反应、异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应的制剂。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的环状化合物化合物为单环化合物或多环化合物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的邻位羟基酮结构包括：

其中X为环结构。

4.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的芳香化反应或异构化反应包括：形成苯环、增加环结构中的不饱和键数量、改变环结构中的不饱和键的位置、或改变环结构或其上基团的光学构象或手性。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的具有邻位羟基酮结构的环状化合物包括：

3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼或其类似物，其经乙二醛酶SPG或其同源物催化发生芳香化反应和/或异构化反应，生成脱氧半棉酚或其类似物；

8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯或其类似物，其经乙二醛酶SPG或其同源物催化发生异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应，生成呋喃卡拉曼或其类似物；或

乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇或其类似物，其经乙二醛酶SPG催化发生异构化反应，生成异构化乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇或其类似物。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼和8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯为参与棉酚生物合成的中间物质，从而，所述的乙二醛酶SPG或其同源物被用于棉酚生物合成中。

7.如权利要求1～6任一所述的用途，其特征在于，所述乙二醛酶SPG包括：(a)如SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)氨基酸序列与(a)限定的氨基酸序列有80％以上相同性且具有(a)多肽功能的多肽；或(d)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:2的片段；较佳地，所述乙二醛酶SPG的编码基因的ID包括：Gh_A03G0247，Gh_A03G0248，Gh_D03G1320，Gh_D03G1321，Gh_D03G1322，Gorai.003G145000.1，Gorai.003G145100.1，Gorai.003G145200.1，Ga_01G2453，Ga_01G2453，GB_A03G0384，GB_A03G0385，GB_A03G0386，GB_D03G1602，GB_D03G1603，GB_D03G1604。

8.如权利要求1～6任一所述的用途，其特征在于，所述乙二醛酶SPG的同源物包括：乙二醛酶I，乙二醛酶GLO1；较佳地，所述的乙二醛酶I包括GhGLXI，CrGLXI，SmGLXI，OSGLXI，AtGLXI，DzGLXI，DmGLXI，DrGLXI；较佳地，所述的乙二醛酶GLO1包括HsGLO1。

9.乙二醛酶SPG的用途，用于降低或解除毒素脱氧雪腐镰刀菌醇的酰基化衍生物的毒性。

10.一种催化具有邻位羟基酮结构的环状化合物发生芳香化反应、异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应的方法，包括：以乙二醛酶SPG或其同源物处理所述具有邻位羟基酮结构的环状化合物。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的环状化合物化合物为单环化合物或多环化合物；或

所述的邻位羟基酮结构包括：

其中X为环结构。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的芳香化反应或异构化反应包括：形成苯环、增加环结构中的不饱和键数量、改变环结构中的不饱和键的位置、或改变环结构或其上基团的光学构象或手性。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的具有邻位羟基酮结构的环状化合物包括：

3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼，其经催化发生芳香化反应和/或异构化反应，生成脱氧半棉酚；或

8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯，其经催化发生异构化反应、脱水反应和/或环氧化反应，生成呋喃卡拉曼；或

乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇，其经催化发生异构化反应，生成异构化乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇。

14.一种降低或解除脱氧雪腐镰刀菌醇或其酰基化衍生物的毒性的方法，包括以乙二醛酶SPG来处理。

15.一种提高乙二醛酶SPG在降低或解除甲基乙二醛毒性方面的能力的方法，包括对乙二醛酶SPG进行序列改造，使得其发生M69F/F101N突变、F101N/I121R突变或M69F/F101N/I121R，且其Loop13中增加4个氨基酸GKMK；较佳地，对应SEQ ID NO:2序列，在其153～154位之间插入GKMK。

16.一种乙二醛酶SPG突变体，其具有降低或解除甲基乙二醛(MG)毒性方面的能力，其对应SEQ ID NO:2序列，发生M69F/F101N突变、F101N/I121R突变或M69F/F101N/I121R，且其Loop13中增加4个氨基酸GKMK。

17.一种合成棉酚的方法，其特征在于，包括：

(1)以法尼基二磷酸为底物，以杜松烯合成酶催化，获得(+)-δ-杜松烯；

(2)将(1)的产物，以P450单加氧酶CYP706B1催化，获得7-羟基-(+)-δ-杜松烯；

(3)将(2)的产物，以醇脱氢酶-1催化，获得7-羰基-δ-杜松烯；

(4)将(3)的产物，以P450单加氧酶CYP82D113催化，获得8-羟基-7-羰基-δ-杜松烯；

(5)将(4)的产物，以P450单加氧酶CYP71BE79催化，获得8,11-二羟基-7-羰基-杜松烯；

(6)将(5)的产物，以乙二醛酶SPG进行催化，获得呋喃卡拉曼；

(7)将(6)的产物，以P450单加氧酶CYP736A196催化，获得2-羟基-呋喃卡拉曼；

(8)将(7)的产物，以醇脱氢酶-1催化，获得呋喃卡拉曼-2-酮；

(9)将(8)的产物，以2-酮戊二酸/Fe(ii)-依赖的双加氧酶-1催化，获得3-羟基-2-羰基-呋喃卡拉曼；

(10)将(9)的产物，以乙二醛酶SPG进行催化，获得脱氧半棉酚；

(11)将(10)的产物，自发反应获得半棉酚；

(12)将(11)的产物，以漆酶或过氧化物酶催化，获得棉酚。

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