CN112390839A - 三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及dna单分子测序系统与测序方法 - Google Patents

三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及dna单分子测序系统与测序方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112390839A
CN112390839A CN202011286386.9A CN202011286386A CN112390839A CN 112390839 A CN112390839 A CN 112390839A CN 202011286386 A CN202011286386 A CN 202011286386A CN 112390839 A CN112390839 A CN 112390839A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequencing
dna
fluorescence
reversible termination
triazene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011286386.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112390839B (zh
Inventor
沈玉梅
邵志峰
龚兵
汤博为
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN202011286386.9A priority Critical patent/CN112390839B/zh
Publication of CN112390839A publication Critical patent/CN112390839A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112390839B publication Critical patent/CN112390839B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/073—Pyrimidine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及DNA单分子测序系统及测序方法，所述三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂包括以下基于三氮烯连接单元的不同荧光素标记四种不同碱基的可逆终止核苷酸：
Figure DDA0002782484890000011
本发明在包含所述三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂的DNA单分子集成测序系统中，通过前一次DNA链延伸产物的荧光信号图像作为下一次延伸产物的定位荧光，无需额外的定位荧光，并且三氮烯荧光标记核苷酸在断裂反应后，在DNA链上无残基保留，理论上读长无限制。

Description

三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及DNA单分子测序 系统与测序方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种DNA单分子测序系统与测序方法， 尤其涉及一种三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及DNA单分子测序系统与测序方 法。
背景技术
人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNAsequencing) 是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟 嘌呤(G)的排列顺序。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医学等具 有重要意义。
DNA合成测序二代测序技术已经得到广泛应用，但是其内在的局限性也日益显现。为弥补现行的二代测序技术的不足，基于单分子的三代测序技术近年来得到了高度重 视。
目前，三代单分子测序技术主要基于两种不同原理。一个是通过DNA分子直接穿过适当的纳米孔而读取DNA分子中的碱基信息(Oxford Nanopore)。另一个是通过合 成延伸，结合单分子荧光信号来获取DNA模板碱基序列信息(Helicos与BioPacific)。 虽然通过5′-标记荧光技术(BioPacific)可以实现较长的一次性读取，但检测方式复杂， 错误率高。通过碱基的合理荧光修饰，结合单碱基延伸与复活，具有错误率低的优势。 并且读取系统相对简单，可实现高通量、低成本的单分子直接测序。而该方法的关键是 实现稳定可靠的单碱基延伸以及检测后的多次循环延伸，从而实现准确和较长的碱基序 列读取。因此，发展基于这一原理的单分子测序技术具有独特优势，对临床检测和基础 研究均具有重要意义。
目前文献已经公开的基于可逆终止的单分子测序方法，文献Nat.Methods 2009，6, 593报道，为了实现一次测序循环只能延伸一个荧光标记核苷酸的目的，设计合成了结构非常复杂的虚拟可逆终止核苷酸，而该结构直接导致在聚合酶作用下，延伸反应很慢、延伸错误率高。而在此之前，文献Science,2008,320,106所报道的测序系统一次测序循 环可延伸一个、两个甚至三个可逆终止核苷酸，无法做到一次测序循环只延伸一个可逆 终止核苷酸。
在单分子测序中，通过连接单元将荧光素与核苷酸连接起来形成的可逆终止核苷酸，其电子效应、空间位阻以及在溶液中的稳定性均在DNA链延伸、成像及断裂过程 中发挥着极为重要的作用，直接影响甚至决定了测序的读长、错误率等关键性能指标。
现有基于可逆终止的单分子测序技术中，为了进行荧光定位，往往需要在待测模板 的3'-端标记特定的定位荧光，然后在对参与延伸反应后的引物/模板复合物进行测序的 荧光检测之前,均需要对标记在待测模板3'-端的荧光素进行照射激发以便对引物/模板 复合物进行定位,该定位荧光因为在每次延伸反应过程中均需要对其照射激发,而多次反复激发容易导致其荧光淬灭,致使定位信息丢失,从而最终导致单分子测序读长短、 错误率偏高。
发明内容
针对现有测序技术中的缺点，本发明的目的是提供一种三氮烯四色荧光可逆终止核 苷酸测序试剂及DNA单分子测序系统与测序方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂，包括以下不同荧光素 标记四种不同碱基的可逆终止核苷酸：
Figure BDA0002782484870000021
Figure BDA0002782484870000031
本发明还提供了一种四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂在DNA单分子测序中的应用。
本发明还提供了一种基于荧光标记可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统，包括固 定于流通池反应器表面的引物、待测DNA模板、DNA聚合酶以及三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂；
所述待测DNA模板不标记定位荧光。
优选地，所述引物通过点击化学反应与连接了水溶性双功能连接单元的流通池反应 器表面连接。
优选地，所述测序系统还包括流通池反应器、流体输送系统、光学系统、温度控制系统；所述温度控制系统用于控制流通池反应器中的温度；所述光学系统用于检测荧光 信号。
本发明还提供了一种基于前述测序系统进行DNA单分子测序方法，包括以下步骤：
A、将待测DNA模板加入流通池反应器中，与固定于流通池反应器表面的引物杂交，然后将四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂、DNA聚合酶加入流通池反应器中，在DNA聚 合酶的作用下用四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂进行第一次延伸反应，得第一次延伸 反应产物；
B、检测第一次延伸反应产物的荧光信号，分析即得待测DNA模板的第一次延伸反应产物的碱基序列信息；
C、步骤B检测结束后，通过将弱酸和还原剂的混合溶液加入流通池反应器中反应，去除第一次延伸反应产物上的荧光素，并以第一次延伸反应产物的荧光信号作为下一次延伸的定位荧光，以此类推，进行多次测序循环，即可。
优选地，所述待测DNA模板、四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂、DNA聚合酶均通过流体输送系统加入流体池反应器中。
优选地，步骤B中，所述检测第一次延伸反应产物的荧光信号的步骤具体为：荧光信号被激发后，以此通过物镜、二向色镜、聚光镜后进入EMCCD相机成像。
优选地，步骤C中，所述弱酸和还原剂的混合溶液为次磷酸钠的酸性溶液或次磷酸溶液，pH值为4-5。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明提出的四色荧光单分子测序系统，一次测序循环能够测一个碱基的读长， 而单色单分子测序系统，四次测序循环才能测得一个碱基的读长。所以本发明所述单分 子测序系统能够使测序效率提高四倍。并且避免了在长时间的测序循环过程中，固定于芯片表面的引物在反复多次的测序循环中，可能导致部分引物脱落或者受酶的污染而导致固定的引物降解等实际问题。所以本发明的单分子测序系统读长可大幅度提高。
2、本发明提出的四色荧光单分子测序系统，由于在延伸反应中，四个不同碱基的荧光素核苷酸全部一次加入反应体系，降低了碱基相互识别时发生错配的概率，有助于 提高测序的准确率。并且单分子测序不需要表面放大扩增步骤，可降低由扩增带来的GC 偏好等测序误差。所以本发明提出的单分子测序系统错误率大幅降低。
3、本发明提供的单分子测序系统，不需要在待测模板的3′-端标记定位荧光素，而是利用测序循环过程中，前一次延伸反应物的荧光作为下一次延伸产物的定位荧光，不 需要再加额外的定位荧光。所以在本发明所述体系中，不存在由于定位荧光的淬灭而导 致定位信息丢失，从而有效避免了定位信息丢失的问题。
4、本发明所述四色荧光可逆终止核苷酸I,II,III,IV，其连接单元三氮烯为无痕迹 连接单元，参与延伸后，在还原剂和弱酸的共同作用下，三氮烯快速完全断裂，没有任何分子痕迹残留在DNA链上，所以即使经过多次测序循环，DNA链的构型、构象仍然 没有变化，理论上测序读长没有限制，且错误率极低。
5、本发明所述的单分子测序系统是在所述特有的仪器装置中完成的，该仪器装置的特有性能参数能够保证所述单分子测序体系的顺利进行，促使其创新性得以顺利完 成、体现。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目 的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例2的四色荧光标记核苷酸单分子测序定位荧光；
图2为本发明实施例2的四色荧光标记核苷酸单分子测序第一次延伸四色荧光图；
图3为本发明实施例2的四色荧光标记核苷酸单分子测序第一次延伸四色荧光合并 图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人 员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于 本发明的保护范围。
实施例1：四色荧光可逆终止核苷酸的制备
荧光素标记可逆终止核苷酸I合成方法的反应过程如下所示：
Figure BDA0002782484870000051
称取60.8mg化合物S1,0.75mL HCl溶解于0.75mL H2O,再加1mL丙酮，混合均 匀，冷却至0℃，滴加亚硝酸钠溶液(17.5mg加入0.5mL H2O中形成),在0℃下反 应1h。然后加入19mg甲基丙炔胺，于5℃滴加三乙胺调节pH至碱性，在0℃下反应 0.5h，然后室温再反应1h，柱层析纯化得化合物S2。
将化合物S2在反应之前真空干燥1h,在手套箱分别称取0.08mmol化合物S2、88 mg(0.16mmol)三正丁胺焦磷酸盐、30mg(0.16mmol)2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4- 酮置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.25mL无水DMF中，再加入0.3mL 无水三正丁胺，常温搅拌0.5h，得三正丁胺焦磷酸盐溶液；与此同时，将2-氯-4H-1,3,2- 苯并二氧磷-4-酮溶于0.25mL无水DMF溶液中，再将三正丁胺焦磷酸盐溶液注入，常 温搅拌0.5h，形成混合液。然后将该混合液注入到化合物S2中，反应1.5h。加入1mL 3％碘溶液(9:1吡啶/H2O)，使溶液呈现深红棕色，保持15min不退色，再加入3mL 水，搅拌2h。加入0.5mL 3mol/L NaCl水溶液，15mL无水乙醇，震荡混匀，-20℃冷 冻过夜。离心(3200r/min，25℃)20分钟，然后倾去上层清液，得到棕色沉淀物，抽 干溶剂，加入2mL浓氨水，室温搅拌5小时。减压旋除溶剂，出现棕色固体，RP-HPLC 分离，条件：Agilent Prep-C18柱(5μm,9.4×250mm)，紫外可见检测器：254nm。 HPLC分离后的产物旋除有机溶剂后冷冻干燥，除去三乙胺乙酸盐，得到白色固体即化 合物S3，产率30％。HRMS(ESI):calc for C12H18N5O14P3(M-H)-548.0063,found548.0059.
室温下，于119mg化合物S3的0.5mL乙醇溶液中，加入101mg 6-叠氮三氟乙基 己氨，再将25mg无水硫酸铜溶于1mL水的溶液加入，混合后溶液变为墨绿色，再加 入40mg维C钠，混合溶液变为棕色。室温下反应0.5h，粗产物使用HPLC分离纯化， 得化合物S4。
得到的化合物S4进一步与荧光素Cy3 NHS酯反应，得预期产物荧光标记可逆终止核苷酸I。HRMS(ESI):calc for C45H61N11O15P3(M-H)-1087.3556,found 1087.3555.
其它三个碱基的荧光标记核苷酸(结构如式II,III,IV所示)用类似方法合成。最终产物均需要制备HPLC纯化并冷冻干燥。
实施例2：四色荧光标记核苷酸在次磷酸作用下快速完全断裂
Figure BDA0002782484870000061
将实施例1制备的四种荧光标记核苷酸(式I-式IV结构)溶于pH＝5的次磷酸钠溶液 中，室温下反应5min,反应后的产物(1H-NMR和HRMS表征)表明，cleavage断裂效率100％， 且没有残基留在碱基上。在DNA测序中，由于延伸反应后，需要将标记在碱基上的荧光 素去除，以便进行下一轮延伸反应，而在去除荧光素时，往往会在DNA链的碱基上留下部分分子基团(残基)，这些残基的累计，导致经过多次延伸之后，DNA链的构型、构 象均发生变化，在这种情况下，DNA聚合酶的识别不再准确，从而随着测序读长的增加， 错误率也不断增加。即使Illumina测序技术，也只能做到单端测序读长150，错误率控 制在0.1％-1％范围内。而我们的测序方法采用的四种荧光标记核苷酸断裂后没有残基， 从根本上解决了残基的存在或累计，理论上可以做到读长没有限制，错误率为0。
实施例3：四色荧光标记可逆终止核苷酸DNA单分子测序系统
本实施例提供了一种DNA单分子测序系统和测序方法，在本实施例中选择实施例1制备的可逆终止核苷酸I,II,III,IV作为四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂。
Figure BDA0002782484870000071
四条不同的待测模板序列如下：
5’-CTACGTTCGAACTACTAACTTGATGTAGCTTCGTAGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTT TT-3’(序列1)，
5’-CTACGTTCGAACTACTAATGGCCAACTTTAGGTACAGGCTTTTTTTTTTTTTTTTT TTT-3’(序列2)，
5’-CTACGTTCGAACTACTAAGCAATCCGGCAGATCGTCACTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTT-3’(序列3)，
5’-CTACGTTCGAACTACTAAAACTGGTACAGCCAACGTCTGTTTTTTTTTTTTTTTTT TTT-3’(序列4)
先将上述四条不同序列的模板与固定在流通池反应器表面的引物(AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(序列5))，所述引物通过点击化学反应与连接了 水溶性双功能连接单元的流通池反应器表面连接。具体连接方式参考专利文献 201711280069.4中记载的方法)在65℃下温育5分钟进行杂交，然后在聚合酶的作用 下用四种不同荧光标记的可逆终止核苷酸延伸引物，延伸反应时间为15分钟，温度为 37℃。第一次延伸反应结束后通过检测延伸产物的荧光信号即可得到待测碱基的信息， 然后在次磷酸(pH＝5)作用下，去除标记在碱基上的荧光素。以第一次延伸后的荧光 成像作为定位荧光(图1)，采用相同的步骤进行第二次延伸循环，以此类推，进行多 次测序循环。图2是第一次延伸后的单分子荧光照片，根据荧光信号可以通过第一次延 伸反应读出四条待测序列上相应的碱基分别为A(序列1)，C(序列2)，T(序列3)， G(序列4)。图3是四色荧光标记核苷酸单分子测序第一次延伸四色合并荧光图；在 该实施例中，使用前一次延伸产物的荧光信息作为下一次延伸产物的定位信息，不需要 在待测模板的3′-端标记特定的定位荧光信息。并且在我们初步的实验过程中，我们发 现四色荧光单分子测序系统在不需要特意在待测模板上标记定位信息的前提下，也就不 存在由于定位信息的荧光淬灭。
由于本实施例所述荧光标记核苷酸在参与延伸反应，去除荧光素之后，没有任何分 子基团残留在碱基上，所以理论上读长没有限制，且错误率为0。而在我们的实验中， 我们发现经过10次测序循环的实测，没有发现错配的碱基，即错误率为0。
所以本发明所述单分子测序系统能够获得长读长、低错误率的高通量的单分子测序 系统。这些实验结果都是在我们自己设计的测序芯片及装置中完成的。
对比实施例1：四色荧光标记酸敏感可逆终止核苷酸DNA单分子测序系统
本对比例的DNA单分子测序系统中，选择可逆终止核苷酸式V,式VI,式VII,式VIII作为四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂。其他测序条件和使用的试剂与实施例2相同。
Figure BDA0002782484870000091
先将实施例2所述四条不同序列的模板与固定在流通池反应器表面的引物在65℃下温育5分钟进行杂交，然后在聚合酶的作用下用上述四种不同荧光标记的可逆终止核 苷酸延伸引物，延伸反应时间为15min，温度为37℃。第一次延伸反应结束后通过检 测延伸产物的荧光信号即可得到待测碱基的信息，然后在弱酸(pH＝5)作用下，去除 标记在碱基上的荧光素。以第一次延伸后的荧光成像作为定位荧光，采用相同的步骤进 行第二次延伸循环，以此类推，进行多次测序循环。在该对比例中，我们发现该四色荧 光单分子测序系统经过10次测序循环的实测，错误率为0.03％。即由于其采用的可逆 终止核苷酸结构断裂后存在残基，因此10次测序循环的错误率为0.03％，预计更多次 测序循环后由于残基累计叠加等原因，错误率将更高。
总之，本发明所述三氮烯四色单分子测序系统具有测序读长更长，错误率更低的特 点，并且测序效率高，一次测序循环就可测定一个碱基的读长。而单色单分子测序系统四次测序循环才能测得一个碱基的读长，测序效率提高了四倍。
需要说明的是，本发明提供的四色荧光单分子测序系统，并不限于目前提出的几类 可逆终止剂，也同样适用于其他类型的可逆终止剂。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视 为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及DNA单分子测序系统与测序方法
<130> KAG45671
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctacgttcga actactaact tgatgtagct tcgtagtaat tttttttttt ttttttttt 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctacgttcga actactaatg gccaacttta ggtacaggct tttttttttt ttttttttt 59
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctacgttcga actactaagc aatccggcag atcgtcactt tttttttttt ttttttttt 59
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctacgttcga actactaaaa ctggtacagc caacgtctgt tttttttttt ttttttttt 59
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20

Claims (9)

1.一种三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂，其特征在于，包括以下基于三氮烯连接单元的不同荧光素标记四种不同碱基的可逆终止核苷酸：
Figure FDA0002782484860000011
2.一种根据权利要求1所述的四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂在DNA单分子测序中的应用。
3.一种基于荧光标记可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统，其特征在于，包括固定于流通池反应器表面的引物、待测DNA模板、DNA聚合酶、权利要求1所述的四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂；
所述待测DNA模板不标记定位荧光。
4.根据权利要求3所述的DNA单分子测序系统，其特征在于，所述引物通过点击化学反应与连接了水溶性双功能连接单元的流通池反应器表面连接。
5.根据权利要求3所述的DNA单分子测序系统，其特征在于，所述测序系统还包括流通池反应器、流体输送系统、光学系统、温度控制系统；所述温度控制系统用于控制流通池反应器中的温度；所述光学系统用于检测荧光信号。
6.一种基于权利要求3-5任一项所述测序系统进行DNA单分子测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将待测DNA模板加入流通池反应器中，与固定于流通池反应器表面的引物杂交，然后将四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂、DNA聚合酶加入流通池反应器，在DNA聚合酶作用下用四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂进行第一次延伸反应，得第一次延伸反应产物；
B、检测第一次延伸反应产物的荧光信号，分析即得待测DNA模板的第一次延伸反应产物的碱基信息；
C、步骤B检测结束后，通过将弱酸和还原剂的混合溶液加入流通池反应器中反应，去除第一次延伸反应产物上的荧光素，并以第一次延伸反应产物的荧光信号作为下一次延伸的定位荧光，以此类推，进行多次测序循环，即可。
7.根据权利要求6所述的DNA单分子测序方法，其特征在于，所述待测DNA模板、四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂、DNA聚合酶均通过流体输送系统加入流体池反应器中。
8.根据权利要求6所述的DNA单分子测序方法，其特征在于，步骤B中，所述检测第一次延伸反应产物的荧光信号的步骤具体为：荧光信号被激发后，以此通过物镜、二向色镜、聚光镜后进入EMCCD相机成像。
9.根据权利要求6所述的DNA单分子测序方法，其特征在于，步骤C中，所述弱酸和还原剂的混合溶液为次磷酸钠的酸性溶液或次磷酸溶液，pH值为4-5。
CN202011286386.9A 2020-11-17 2020-11-17 三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及dna单分子测序系统与测序方法 Active CN112390839B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011286386.9A CN112390839B (zh) 2020-11-17 2020-11-17 三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及dna单分子测序系统与测序方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011286386.9A CN112390839B (zh) 2020-11-17 2020-11-17 三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及dna单分子测序系统与测序方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112390839A true CN112390839A (zh) 2021-02-23
CN112390839B CN112390839B (zh) 2022-02-25

Family

ID=74605828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011286386.9A Active CN112390839B (zh) 2020-11-17 2020-11-17 三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及dna单分子测序系统与测序方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112390839B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102971335A (zh) * 2009-03-23 2013-03-13 史蒂芬·阿尔伯特·本纳 可逆终止引物延伸试剂
CN104003902A (zh) * 2014-05-14 2014-08-27 上海交通大学 三氮烯连接单元的合成及其在dna测序中的用途
CN108192957A (zh) * 2017-12-06 2018-06-22 上海交通大学 Dna合成测序方法与测序系统
CN108251516A (zh) * 2017-12-06 2018-07-06 上海交通大学 Dna单分子测序方法与测序系统
CN110343612A (zh) * 2018-04-08 2019-10-18 上海交通大学 基于多色荧光可逆终止核苷酸的dna单分子测序系统与装置

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102971335A (zh) * 2009-03-23 2013-03-13 史蒂芬·阿尔伯特·本纳 可逆终止引物延伸试剂
CN104003902A (zh) * 2014-05-14 2014-08-27 上海交通大学 三氮烯连接单元的合成及其在dna测序中的用途
CN108192957A (zh) * 2017-12-06 2018-06-22 上海交通大学 Dna合成测序方法与测序系统
CN108251516A (zh) * 2017-12-06 2018-07-06 上海交通大学 Dna单分子测序方法与测序系统
CN110343612A (zh) * 2018-04-08 2019-10-18 上海交通大学 基于多色荧光可逆终止核苷酸的dna单分子测序系统与装置

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAIZHANG HE, ET AL.: "Synthesis of 5-substituted 2’-deoxycytidine 5’-(α-P-borano)triphosphates, their incorporation into DNA and effects on exonuclease", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
MAJKEN N. HANSEN, ET AL.: "Synthesis and Application of a Triazene-Ferrocene Modifier for Immobilization and Characterization of Oligonucleotides at Electrodes", 《J. ORG. CHEM. 》 *
姜玉等: "用于DNA合成测序的可断裂连接单元研究现状", 《化学进展》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112390839B (zh) 2022-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3290528B1 (en) Methods and compositions for nucleic acid sequencing
JP2649102B2 (ja) 核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料
EP1212457B1 (en) Uv excitable fluorescent energy transfer dyes
JP2000513016A (ja) 置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド
KR20180057702A (ko) 폴리메틴 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도
JP2003274999A (ja) 核酸配列の配列決定方法
CN110691854B (zh) 一种核酸测序方法以及一种核酸测序试剂盒
WO2015043493A1 (zh) 5-醛基胞嘧啶特异性化学标记方法及相关应用
WO2022083686A1 (zh) 修饰的核苷或核苷酸
Qiu et al. Design and synthesis of cleavable biotinylated dideoxynucleotides for DNA sequencing by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry
CN112390839B (zh) 三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及dna单分子测序系统与测序方法
US6218124B1 (en) Method for detecting oligonucleotides using UV light source
WO2023019983A1 (zh) 一种核酸荧光染料及其制备和应用
US10239853B1 (en) Polycyclic phosphoramidtes and their applications
KR102608609B1 (ko) 아크리딘계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물
CN115323045A (zh) 一种基因测序试剂及基因测序方法
JP2017043562A (ja) 光切断性蛍光標識プローブ
CN114671842A (zh) 一种荧光化合物及其制备方法、荧光修饰核苷酸、试剂盒
CN114671843B (zh) 一种荧光化合物、荧光修饰核苷酸、试剂盒
CN114656394A (zh) 一种荧光化合物及其制备方法、荧光修饰核苷酸、试剂盒
CN110678559B (zh) 一种核酸探针以及一种核酸测序方法
CN115181049B (zh) 一种荧光化合物及其制备方法、荧光修饰核苷酸、测序试剂
CN114656499A (zh) 硅基罗丹明化合物、制备方法、荧光修饰核苷酸、试剂盒
CN114621306A (zh) 化合物、其制备方法与用途
CN118239996A (zh) 荧光标记核苷酸在dna合成测序以及单分子测序中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant