CN112378970A - 一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备 - Google Patents

一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备 Download PDF

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Abstract

本发明属于新型纳米复合材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备方法。本发明以具有高导电性的Au/Co‑BDC/MoS2为基底材料，以树枝状铂铜合金纳米颗粒（DPCN）和具有大的比表面积的MoS2纳米片组装形成的DPCN/MoS2作为电化学信号放大平台，实现了对心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的定量检测，具有特异性强，灵敏度高，检测限低等优点，对急性心肌梗塞（AMI）的检测具有重要的科学意义和应用价值。

Description

一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的 制备
技术领域
本发明属于新型纳米复合材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备，应用于心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的检测。
背景技术
急性心肌梗塞（AMI）是一种危重病症，在中国的发病率为0.2% ~ 0.6%，致使中国每年几十万人死亡，当前，医学上用来检测AMI的生物标志物是心肌肌钙蛋白I（CTnI）,CTnI从心肌中产生，因此对检测AMI更具特异性，正常人的CTnI浓度大约为1 pg/mL，但是在AMI患者的血液中，cTnI的浓度会升高到100 ng/mL。患者心肌损伤后，血液中CTnI浓度会迅速增高，并且持续时间较长，为检测提供了较长时间的窗口期，因此，CTnI被用作诊断心肌梗塞的重要生物标志物。
树枝状铂铜合金纳米颗粒（DPCN）通过离子键相互作用明显提高了催化活性，由于不同组分对电子耦合效应的影响，DPCN具有良好的稳定性、快速的响应和较高的催化效率。三维树突状结构具有大的比表面积和丰富的活性位点，可以负载更多的二抗，DPCN具有优良的电导率和生物相容性，通过Pt-N健有效固定二抗；MoS2纳米片具有大的比表面积，可以负载更多的DPCN实现信号放大；具有纳米厚度的2D MOF纳米片可实现出色的电子转移和快速的质量传输，Co-BDC在MoS2纳米片的成功沉积，进一步提高了Co-BDC/MoS2的电导率；AuNPs具有优良的导电性能和良好的生物相容性，通过静电吸附作用将Au NPs成功结合到Co-BDC/MoS2纳米片上，使得Au/Co-BDC/MoS2表现出更加优良的导电性。
本发明以Au/Co-BDC/MoS2为基底材料，DPCN/MoS2作为电化学信号放大平台，具有操作简单，特异性强，灵敏度高，检测限低等优点，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，实现对心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的超灵敏检测。
发明内容
本发明提供了一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备，实现了对心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的超灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器用于心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤：
1. 一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备，步骤如下：
（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0 µL、2.0 ~ 3.0 mg/mL的Au/Co-BDC/MoS2分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、5 ~ 15 µg/mL的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗体滴加到电极表面，pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1 ~ 2 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、10 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原溶液，用pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的DPCN/MoS2-Ab2分散液滴涂于电极表面，在4 ℃冰箱中静置40 min，用pH=6.98的磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃干燥，制得一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的夹心型电化学免疫传感器。
2. 一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备，所述相关材料的制备，步骤如下：
（1）DPCN的制备
在磁力搅拌下，在50 mL 聚四氟乙烯内衬中将0.5 ~ 1.5 mL CuCl2•2H2O（20 mM）和0.5 ~ 1.5 mL H2PtCl6•6H2O（20 mM）混合，将0.015 ~ 0.035 mL新鲜制备的KI水溶液（5M），140 ~ 180 mg PVP（200 mg/mL）和5 ~ 15 mL EG（乙二醇）添加到PTFE内衬中，将衬管密封在不锈钢容器中，并在140 ℃加热90分钟，之后，取出不锈钢容器，自然冷却至室温，将产物用乙醇/丙酮（v / v = 1/1）以10000 rpm的速度洗涤3次，分散在去离子水中，并在4 ℃下保存；
（2）MoS2纳米片的制备
在100 mL烧杯中，将0.15 ~ 0.35 g Na2MoO4•2H2O溶解在50 mL去离子水中，然后，在超声条件下将0.4 ~ 0.6 g L-半胱氨酸添加至溶液中10分钟，将溶液的pH调节至6.5，将烧杯的溶液添加到100 mL聚四氟乙烯内衬中，在不锈钢高压釜中密封，将高压釜放入200 ℃的干燥箱中18小时，取出高压釜，自然冷却至室温，最后，将获得的产物用乙醇洗涤3次，并通过以8000 rpm离心来收集；
（3）DPCN/MoS2的制备
将2.0 ~ 6.0 mL MoS2（2.0 mg/mL）分散在5 ~ 15 mL无水乙醇中，将溶液超声处理15分钟，之后，添加50 ~ 150 µL的氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），并在磁力搅拌下加热至100 ℃保持2 h，将产物离心并用去离子水洗涤3次，再分散在去离子水中，并在4 ℃下保存，在超声条件下将1.0 ~ 3.0 mL DPCN和0.5 ~ 1.5 mL NH2-MoS2混合1 h，之后，将混合溶液在室温下振摇8小时，将产物离心并用去离子水洗涤3次；
（4）DPCN/MoS2-Ab2分散液的制备
在室温下，将2.0 ~ 6.0 mL Ab2溶液（20 µg/mL）和2.0 ~ 6.0 mL DPCN/MoS2（2.0 mg/mL）混合，将混合物在4 ℃摇动12 h，然后通过离心用磷酸盐缓冲溶液（PBS）（pH=6.98）洗涤3次，将产物分散在PBS（pH=6.98）中，并保存在4 ℃；
（5）Au NPs的制备
将0.5 ~ 1.5 mL HAuCl4•4H2O（1.0 wt％）添加到装有99 mL超纯水的圆底烧瓶中，将电磁转子放入烧瓶中，以一定速度搅拌，加热至沸腾，然后，将2.0 ~ 3.0 mL柠檬酸钠（1.0wt％）添加到烧瓶中，并保持沸腾15分钟，获得均匀的金纳米颗粒；
（6）Co-BDC/MoS2的制备
在超声条件下，将16 ~ 48 mL DMF，1 ~ 3 mL乙醇，1 ~ 3 mL水和20.4 ~ 61.2 mgMoS2加入100 mL锥形瓶中10分钟，然后，在搅拌下将BDC（0.05 ~ 0.15 mM）和CoCl2·6H2O（0.05 ~ 0.15 mM）加入溶液中，之后，将0.1 ~ 0.3 mL TEA注入溶液中，将该溶液在常温下超声处理3小时，将所得产物用乙醇洗涤并离心四次，并在60 ℃的真空干燥炉中干燥，干燥后得到的产物分散在去离子水中并在4 ℃下储存；
（7）Au/Co-BDC/MoS2的制备
在超声条件下将1 ~ 3 mL Co-BDC/MoS2和1 ~ 3 mL Au NPs溶液混合10分钟，然后在室温下摇动6小时，将得到的产物离心并洗涤3次，并在4 ℃下保存。
3. 一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备，用于心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站，在三电极体系下进行测试，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，以所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL包含5 mol/L过氧化氢溶液的pH 5.0 ~ 8.5磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL pH=6.98磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的过氧化氢溶液，记录电流变化；
（4）记录不同浓度下的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原所对应的电流峰值；
（5）利用工作曲线法，得到待测样品中心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的浓度。
本发明的有益成果
（1）本发明制备的DPCN具有独特的中空金字塔结构，粒径小，表面积大，与单组分粒子相比，表现出更优的导电性和催化性能，同时由于不同组分对电子耦合效应的影响，DPCN具有良好的稳定性、快速的响应和较高的催化效率；Co-BDC在MoS2上的沉积引起MoS2从2H相向1T相的部分转移，这使得Co-BDC/MoS2具有更好的导电性；Co-BDC在MoS2上的沉积覆盖了MoS2的部分活性位，降低了Co-BDC/MoS2的催化活性；Co-BDC/MoS2作为基底材料，具有良好的电导率和较低的催化活性，可以降低背景信号，提高检测灵敏度；以Au/Co-BDC/MoS2作为基底材料，DPCN/MoS2作为Ab2标记的活性探针能够进一步地实现信号放大，通过这种协同作用和多重放大作用，降低了传感器的检测限，实现高灵敏、快速电化学检测；
（2）一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器对心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的检测，其对心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的线性检测范围是10 fg/mL ~ 100 ng/mL，最低检测下限为3.02 fg/mL；表明所制备的一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器可以精确定量检测心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1 一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备方法
（1）将直径为3.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0 µL、2.0 mg/mL的Au/Co-BDC/MoS2分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、5 µg/mL的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗体滴加到电极表面，pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、10 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原溶液，用pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6.0 µL、1.0 mg/mL的DPCN/MoS2-Ab2分散液滴涂于电极表面，在4 ℃冰箱中静置40 min，用pH=6.98的磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃干燥，制得一种基于DPCN/MoS2的夹心型电化学免疫传感器。
实施例2 一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备方法
（1）将直径为4.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0 µL、2.5 mg/mL的Au/Co-BDC/MoS2分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、10 µg/mL的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗体滴加到电极表面，pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.5 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、10 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原溶液，用pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6.0 µL、2.0 mg/mL的DPCN/MoS2-Ab2分散液滴涂于电极表面，在4 ℃冰箱中静置40 min，用pH=6.98的磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃干燥，制得一种基于DPCN/MoS2的夹心型电化学免疫传感器。
实施例3 一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备方法
（1）将直径为5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0 µL、3.0 mg/mL的Au/Co-BDC/MoS2分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、15 µg/mL的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗体滴加到电极表面，pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、2 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、10 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原溶液，用pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6.0 µL、3.0 mg/mL的DPCN/MoS2-Ab2分散液滴涂于电极表面，在4 ℃冰箱中静置40 min，用pH=6.98的磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃干燥，制得一种基于DPCN/MoS2的夹心型电化学免疫传感器。
实施例4所述DPCN/MoS2-Ab2分散液的制备
（1）DPCN的制备
在磁力搅拌下，在50 mL 聚四氟乙烯内衬中将0.5 mL CuCl2•2H2O（20 mM）和0.5 mLH2PtCl6•6H2O（20 mM）混合，将0.015 mL新鲜制备的KI水溶液（5 M），140 mg PVP（200 mg/mL）和5 mL EG（乙二醇）添加到PTFE内衬中，将衬管密封在不锈钢容器中，并在140 ℃加热90分钟，之后，取出不锈钢容器，自然冷却至室温，将产物用乙醇/丙酮（v / v = 1/1）以10000 rpm的速度洗涤3次，分散在去离子水中，并在4 ℃下保存；
（2）MoS2纳米片的制备
在100 mL烧杯中，将0.15 g Na2MoO4•2H2O溶解在50 mL去离子水中，然后，在超声条件下将0.4 g L-半胱氨酸添加至溶液中10分钟，将溶液的pH调节至6.5，将烧杯的溶液添加到100 mL聚四氟乙烯内衬中，在不锈钢高压釜中密封，将高压釜放入200 ℃的干燥箱中18小时，取出高压釜，自然冷却至室温，最后，将获得的产物用乙醇洗涤3次，并通过以8000 rpm离心来收集；
（3）DPCN/MoS2的制备
将2.0 mL MoS2（2.0 mg/mL）分散在5 mL无水乙醇中，将溶液超声处理15分钟，之后，添加50 µL的氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），并在磁力搅拌下加热至100 ℃保持2 h，将产物离心并用去离子水洗涤3次，再分散在去离子水中，并在4℃下保存，在超声条件下将1.0 mLDPCN和0.5 mL NH2-MoS2混合1 h，之后，将混合溶液在室温下振摇8小时，将产物离心并用去离子水洗涤3次；
（4）DPCN/MoS2-Ab2分散液的制备
在室温下，将2.0 mL Ab2溶液（20 µg/mL）和2.0 mL DPCN/MoS2（2.0 mg/mL）混合，将混合物在4 ℃摇动12 h，然后通过离心用磷酸盐缓冲溶液（PBS）（pH=6.98）洗涤3次，将产物分散在PBS（pH=6.98）中，并保存在4 ℃。
实施例5所述DPCN/MoS2-Ab2分散液的制备
（1）DPCN的制备
在磁力搅拌下，在50 mL 聚四氟乙烯内衬中将1.0 mL CuCl2•2H2O（20 mM）和1.0 mLH2PtCl6•6H2O（20 mM）混合，将0.025 mL新鲜制备的KI水溶液（5 M），160 mg PVP（200 mg/mL）和10 mL EG（乙二醇）添加到PTFE内衬中，将衬管密封在不锈钢容器中，并在140 ℃加热90分钟，之后，取出不锈钢容器，自然冷却至室温，将产物用乙醇/丙酮（v / v = 1/1）以10000 rpm的速度洗涤3次，分散在去离子水中，并在4 ℃下保存；
（2）MoS2纳米片的制备
在100 mL烧杯中，将0.25 g Na2MoO4•2H2O溶解在50 mL去离子水中，然后，在超声条件下将0.5 g L-半胱氨酸添加至溶液中10分钟，将溶液的pH调节至6.5，将烧杯的溶液添加到100 mL聚四氟乙烯内衬中，在不锈钢高压釜中密封，将高压釜放入200 ℃的干燥箱中18小时，取出高压釜，自然冷却至室温，最后，将获得的产物用乙醇洗涤3次，并通过以8000 rpm离心来收集；
（3）DPCN/MoS2的制备
将4.0 mL MoS2（2.0 mg/mL）分散在10 mL无水乙醇中，将溶液超声处理15分钟，之后，添加100 µL的氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），并在磁力搅拌下加热至100 ℃保持2 h，将产物离心并用去离子水洗涤3次，再分散在去离子水中，并在4℃下保存，在超声条件下将2.0 mL DPCN和1.0 mL NH2-MoS2混合1 h，之后，将混合溶液在室温下振摇8小时，将产物离心并用去离子水洗涤3次；
（4）DPCN/MoS2-Ab2分散液的制备
在室温下，将4.0 mL Ab2溶液（20 µg/mL）和4.0 mL DPCN/MoS2（2.0 mg/mL）混合，将混合物在4 ℃摇动12 h，然后通过离心用磷酸盐缓冲溶液（PBS）（pH = 6.98）洗涤3次，将产物分散在PBS（pH = 6.98）中，并保存在4 ℃。
实施例6所述DPCN/MoS2-Ab2分散液的制备
（1）DPCN的制备
在磁力搅拌下，在50 mL 聚四氟乙烯内衬中将1.5 mL CuCl2•2H2O（20 mM）和1.5 mLH2PtCl6•6H2O（20 mM）混合，将0.035 mL新鲜制备的KI水溶液（5 M），180 mg PVP（200 mg/mL）和15 mL EG（乙二醇）添加到PTFE内衬中，将衬管密封在不锈钢容器中，并在140 ℃加热90分钟，之后，取出不锈钢容器，自然冷却至室温，将产物用乙醇/丙酮（v / v = 1/1）以10000 rpm的速度洗涤3次，分散在去离子水中，并在4 ℃下保存；
（2）MoS2纳米片的制备
在100 mL烧杯中，将0.35 g Na2MoO4•2H2O溶解在50 mL去离子水中，然后，在超声条件下将0.6 g L-半胱氨酸添加至溶液中10分钟，将溶液的pH调节至6.5，将烧杯的溶液添加到100 mL聚四氟乙烯内衬中，在不锈钢高压釜中密封，将高压釜放入200 ℃的干燥箱中18小时，取出高压釜，自然冷却至室温，最后，将获得的产物用乙醇洗涤3次，并通过以8000 rpm离心来收集；
（3）DPCN/MoS2的制备
将6.0 mL MoS2（2.0 mg/mL）分散在15 mL无水乙醇中，将溶液超声处理15分钟，之后，添加150 µL的氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），并在磁力搅拌下加热至100 ℃保持2 h，将产物离心并用去离子水洗涤3次，再分散在去离子水中，并在4℃下保存，在超声条件下将3.0 mL DPCN和1.5 mL NH2-MoS2混合1 h，之后，将混合溶液在室温下振摇8小时，将产物离心并用去离子水洗涤3次；
（4）DPCN/MoS2-Ab2分散液的制备
在室温下，将6.0 mL Ab2溶液（20 µg/mL）和6.0 mL DPCN/MoS2（2.0 mg/mL）混合，将混合物在4 ℃摇动12 h，然后通过离心用磷酸盐缓冲溶液（PBS）（pH = 6.98）洗涤3次，将产物分散在PBS（pH = 6.98）中，并保存在4 ℃。
实施例7 所述Au/Co-BDC/MoS2分散液的制备
（1）Au NPs的制备
将0.5 ml HAuCl4•4H2O（1.0 wt％）添加到装有99 mL超纯水的圆底烧瓶中，将电磁转子放入烧瓶中，以一定速度搅拌，加热至沸腾，然后，将2.0 mL柠檬酸钠（1.0 wt％）添加到烧瓶中，并保持沸腾15分钟，获得均匀的金纳米颗粒；
（2）Co-BDC/MoS2的制备
在超声条件下，将16 mL DMF，1 mL乙醇，1 mL水和20.4 mg MoS2加入100 mL锥形瓶中10分钟，然后，在搅拌下将BDC（0.05 mM）和CoCl2·6H2O（0.05 mM）加入溶液中，之后，将0.1mL TEA注入溶液中，将该溶液在常温下超声处理3小时，将所得产物用乙醇洗涤并离心四次，并在60 ℃的真空干燥炉中干燥，干燥后得到的产物分散在去离子水中并在4 ℃下储存；
（3）Au/Co-BDC/MoS2的制备
在超声条件下将1 mL Co-BDC/MoS2和1 mL Au NPs溶液混合10分钟，然后在室温下摇动6小时，将得到的产物离心并洗涤3次，并在4 ℃下保存。
实施例8所述Au/Co-BDC/MoS2分散液的制备
（1）Au NPs的制备
将1.0 ml HAuCl4•4H2O（1.0 wt％）添加到装有99 mL超纯水的圆底烧瓶中，将电磁转子放入烧瓶中，以一定速度搅拌，加热至沸腾，然后，将2.5 mL柠檬酸钠（1.0 wt％）添加到烧瓶中，并保持沸腾15分钟，获得均匀的金纳米颗粒；
（2）Co-BDC/MoS2的制备
在超声条件下，将32 mL DMF，2 mL乙醇，2 mL水和40.8 mg MoS2加入100 mL锥形瓶中10分钟，然后，在搅拌下将BDC（0.1 mM）和CoCl2·6H2O（0.1 mM）加入溶液中，之后，将0.2 mLTEA注入溶液中，将该溶液在常温下超声处理3小时，将所得产物用乙醇洗涤并离心四次，并在60 ℃的真空干燥炉中干燥，干燥后得到的产物分散在去离子水中并在4 ℃下储存；
（3）Au/Co-BDC/MoS2的制备
在超声条件下将2 mL Co-BDC/MoS2和2 mL Au NPs溶液混合10分钟，然后在室温下摇动6小时，将得到的产物离心并洗涤3次，并在4 ℃下保存。
实施例9所述Au/Co-BDC/MoS2分散液的制备
（1）Au NPs的制备
将1.5 ml HAuCl4•4H2O（1.0 wt％）添加到装有99 mL超纯水的圆底烧瓶中，将电磁转子放入烧瓶中，以一定速度搅拌，加热至沸腾，然后，将3.0 mL柠檬酸钠（1.0 wt％）添加到烧瓶中，并保持沸腾15分钟，获得均匀的金纳米颗粒；
（2）Co-BDC/MoS2的制备
在超声条件下，将48 mL DMF，3 mL乙醇，3 mL水和61.2 mg MoS2加入100 mL锥形瓶中10分钟，然后，在搅拌下将BDC（0.15 mM）和CoCl2·6H2O（0.15 mM）加入溶液中，之后，将0.3mL TEA注入溶液中，将该溶液在常温下超声处理3小时，将所得产物用乙醇洗涤并离心四次，并在60 ℃的真空干燥炉中干燥，干燥后得到的产物分散在去离子水中并在4 ℃下储存；
（3）Au/Co-BDC/MoS2的制备
在超声条件下将3 mL Co-BDC/MoS2和3 mL Au NPs溶液混合10分钟，然后在室温下摇动6小时，将得到的产物离心并洗涤3次，并在4 ℃下保存。
实施例10 所述的基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器对心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的检测
（1）使用电化学工作站，在三电极体系下进行测试，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，以所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL包含5 mol/L过氧化氢溶液的pH 5.0 ~ 8.5磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL pH=6.98磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的过氧化氢溶液，记录电流变化；
（4）记录不同浓度下的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原所对应的电流峰值；
（5）利用工作曲线法，得到待测样品中心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的线性检测范围是10fg/mL ~ 100 ng/mL，最低检测下限为3.02 fg/mL。

Claims (5)

1.一种基于树枝状铂铜合金纳米颗粒的电化学免疫传感器的制备，其特征在于，包括以下步骤：
（1）DPCN/MoS2的制备：将单独制备的三维（3D）树枝状铂铜合金纳米颗粒（DPCN）和MoS2纳米片结合；
（2）Au/Co-BDC/MoS2的制备：将Au NPs和Co-BDC以及MoS2纳米片结合；
（3）构建基于DPCN的夹心型电化学免疫传感器，测定心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原含量，绘制工作曲线。
2.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的DPCN/MoS2的制备具体如下：
（1）DPCN的制备
在磁力搅拌下，在50 mL 聚四氟乙烯内衬中将0.5 ~ 1.5 mL CuCl2•2H2O（20 mM）和0.5~ 1.5 mL H2PtCl6•6H2O（20 mM）混合，将0.015 ~ 0.035 mL新鲜制备的KI水溶液（5 M），140~ 180 mg PVP（200 mg/mL）和5 ~ 15 mL EG（乙二醇）添加到PTFE内衬中，将衬管密封在不锈钢容器中，并在140 ℃加热90分钟，之后，取出不锈钢容器，自然冷却至室温，将产物用乙醇/丙酮（v / v = 1/1）以10000 rpm的速度洗涤3次，分散在去离子水中，并在4 ℃下保存；
（2）MoS2纳米片的制备
在100 mL烧杯中，将0.15 ~ 0.35 g Na2MoO4•2H2O溶解在50 mL去离子水中，然后，在超声条件下将0.4 ~ 0.6 g L-半胱氨酸添加至溶液中10分钟，将溶液的pH调节至6.5，将烧杯的溶液添加到100 mL聚四氟乙烯内衬中，在不锈钢高压釜中密封，将高压釜放入200 ℃的干燥箱中18小时，取出高压釜，自然冷却至室温，最后，将获得的产物用乙醇洗涤3次，并通过以8000 rpm离心来收集；
（3）DPCN/MoS2的制备
将2.0 ~ 6.0 mL MoS2（2.0 mg/mL）分散在5 ~ 15 mL无水乙醇中，将溶液超声处理15分钟，之后，添加50 ~ 150 µL的氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），并在磁力搅拌下加热至100℃保持2 h，将产物离心并用去离子水洗涤3次，再分散在去离子水中，并在4 ℃下保存，在超声条件下将1.0 ~ 3.0 mL DPCN和0.5 ~ 1.5 mL NH2-MoS2混合1 h，之后，将混合溶液在室温下振摇8小时，将产物离心并用去离子水洗涤3次；
（4）DPCN/MoS2-Ab2分散液的制备
在室温下，将2.0 ~ 6.0 mL Ab2溶液（20 µg/mL）和2.0 ~ 6.0 mL DPCN/MoS2（2.0 mg/mL）混合，将混合物在4 ℃摇动12 h，然后通过离心用磷酸盐缓冲溶液（PBS）（pH=6.98）洗涤3次，将产物分散在PBS（pH=6.98）中，并保存在4 ℃。
3.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的Au/Co-BDC/MoS2的制备具体如下：
（1）Au NPs的制备
将0.5 ~ 1.5 mL HAuCl4•4H2O（1.0 wt％）添加到装有99 mL超纯水的圆底烧瓶中，将电磁转子放入烧瓶中，以一定速度搅拌，加热至沸腾，然后，将2.0 ~ 3.0 mL柠檬酸钠（1.0wt％）添加到烧瓶中，并保持沸腾15分钟，获得均匀的金纳米颗粒；
（2）Co-BDC/MoS2的制备
在超声条件下，将16 ~ 48 mL DMF，1 ~ 3 mL乙醇，1 ~ 3 mL水和20.4 ~ 61.2 mg MoS2加入100 mL锥形瓶中10分钟，然后，在搅拌下将BDC（0.05 ~ 0.15 mM）和CoCl2·6H2O（0.05~ 0.15 mM）加入溶液中，之后，将0.1 ~ 0.3 mL TEA注入溶液中，将该溶液在常温下超声处理3小时，将所得产物用乙醇洗涤并离心四次，并在60 ℃的真空干燥炉中干燥，干燥后得到的产物分散在去离子水中并在4 ℃下储存；
（3）Au/Co-BDC/MoS2的制备
在超声条件下将1 ~ 3 mL Co-BDC/MoS2和1 ~ 3 mL Au NPs溶液混合10分钟，然后在室温下摇动6小时，将得到的产物离心并洗涤3次，并在4 ℃下保存。
4.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的构建电化学免疫传感器，具体如下：
（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0 µL、2.0 ~ 3.0 mg/mL的Au/Co-BDC/MoS2分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0 µL、5 ~ 15 µg/mL的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗体滴加到电极表面，pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1 ~ 2 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0 µL、10 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原溶液，用pH=6.98磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（6）将6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的DPCN/MoS2-Ab2分散液滴涂于电极表面，在4 ℃冰箱中静置40 min，用pH=6.98的磷酸盐缓冲液冲洗，4 ℃干燥，制得一种基于DPCN/MoS2的夹心型电化学免疫传感器。
5.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的测定心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原，绘制工作曲线，具体如下：
（1）将6 µL不同浓度的心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原溶液分别滴涂至电极表面，反应0.5~ 2 h，晾干后连接至电化学工作站中，分别将电极浸于10 mL pH=6.98的磷酸盐缓冲溶液中测定其氧化还原电流变化，当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL pH=6.98磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的过氧化氢溶液，记录电流变化；
（2）根据所得电流差值与心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
（3）利用工作曲线法，得到待测样品中心肌肌钙蛋白I（CTnI）抗原的浓度。
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