CN112370536A - 羧基四甲基罗丹明修饰的肾清除型银纳米颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了羧基四甲基罗丹明修饰的肾清除型银纳米颗粒及其制备方法与应用。本发明制备的超稳定银纳米颗粒TG‑AgNPs是在已有的谷胱甘肽为配体合成的肾清除型银纳米粒子(GS‑AgNPs)上合成，本发明合成的TG‑AgNPs，合成产率高，形貌较均一，并且具有优越的稳定性和良好的生物相容性；同时本发明的制备方法简单方便，原料来源广，具有可加工性。无论在水或者PBS缓冲液中始终呈高度分散状态，通过对TG‑AgNPs在pH＝3‑11范围内的稳定性研究说明TG‑AgNPs在体外环境中具备极佳的稳定性。小鼠体内成像的研究证明TG‑AgNPs具有良好的肾清除特性，基于这些各种优良特性，TG‑AgNPs有望用于肿瘤诊断和治疗。
Description
技术领域
本发明属于化学纳米材料领域，具体涉及羧基四甲基罗丹明修饰的肾清除型银纳米颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
银纳米粒子(AgNPs)是至少一个维度上直径为1-100nm的银粒子，由于其独特的性质，在光学、电子、生物和医学领域受到越来越多的关注。尤其是银纳米颗粒具有表面等离子体共振(SPR)、高稳定性和良好的生物相容性。结合一些配体如谷胱甘肽(GSH)，使其进入生物体后能够快速被肾脏清除，从而降低其生物毒性。2015年，杨等通过调控银纳米颗粒表面化学性质来制备肾脏可快速清除的发光2nm GS-AgNPs，是一种非常有前途的治疗材料[Colloids and Surfaces B:Biointerfaces 2015,135,751-755.]。2017年，崔等人通过改变AgNPs的大小和形状，合成出具有较高稳定性和较好生物相容性的肾清除纳米颗粒[ACSapplied materials&interfaces 2017,9(7),5900-5906.]。这些研究成果的取得，为贵金属银进一步发展和实际诊疗应用展开了一个很好的前景。如何提高银纳米颗粒的稳定性，是值得大家探究的课题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种羧基四甲基罗丹明修饰的肾清除型银纳米颗粒及其制备方法与应用，本发明制备合成的TG-AgNPs具有好的荧光性质，合成产率高，形貌较均一，稳定性高，并且可应用于肿瘤成像及治疗方面，具有荧光强度高，体内代谢快的特点，且稳定性高。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
羧基四甲基罗丹明修饰的肾清除型银纳米颗粒，通过5(6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(NHS-TAMRA)和谷胱甘肽(GSH)为配体，合成的GS-AgNPs之间发生EDC-NHS耦合反应获得银纳米粒子TG-AgNPs；所述银纳米粒子TG-AgNPs为分散性好、直径为2-3nm之间的球形颗粒，在586nm波长处有强的荧光发射峰。
上述银纳米粒子TG-AgNPs与GS-AgNPs相比，形貌和尺寸并未发生明显改变。
上述羧基四甲基罗丹明修饰的肾清除型银纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，分别取2-4mL浓度为100-200mmol/L的硝酸银溶液和1-2mL浓度为200-400mmol/L的谷胱甘肽溶液于去离子水中，调pH至4.9-5.1，再向混合溶液中加入硼氢化钠溶液，室温下以搅拌速度不低于900r/min的速度剧烈搅拌2天，待反应停止后，取反应溶液透析，并将溶液冷冻干燥，得到谷胱甘肽封端银纳米颗粒GS-AgNPs；
步骤2，将谷胱甘肽封端银纳米颗粒GS-AgNPs与5(6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯NHS-TAMRA溶液发生EDC-NHS耦合反应，反应完成后，按V混合液：V乙醇为1:2的比例加入乙醇，在10000r/min离心2-3min,高速离心去掉上清液，并将沉淀重新溶解在PBS中，整个离心过程重复4次，最后一次离心后，将沉淀在少量PBS缓冲液中重新溶解，并过Sephadex LH-20柱，收集第一洗脱相溶液，即NHS-TAMRA包覆银纳米颗粒AgNPs合成的TG-AgNPs。
作为改进的是，步骤2中所述EDC-NHS耦合反应为室温下反应24小时。
其中，步骤2所述加乙醇高速离心后的沉淀重新溶解并通过Sephadex LH-20柱，去除未反应的NHS-TAMRA。
上述NHS-TAMRA包覆银纳米颗粒AgNPs合成的TG-AgNPs在制备诊断或治疗肿瘤的产品上的应用。
本发明利用pH不敏感荧光染料与谷胱甘肽(GSH)为配体合成的GS-AgNPs，在室温下振荡反应，制备了超稳定TG-AgNPs。合成的球形纳米颗粒TG-AgNPs相较与GS-AgNPs，在水中或PBS缓冲溶液中的稳定性得到大幅提高，具有高分散性，并且形貌尺寸未发生明显改变，依旧保留着在生物体内能够通过肾脏被快速清除的特性。由于染料NHS-TAMRA的保护作用，所以具备更好的稳定性，减少了生物毒性，因此，不同pH下的稳定性研究及生物成像表明合成的银纳米颗粒TG-AgNPs具有高稳定性及良好的生物相容性，可用于生物医学领域，尤其是肿瘤诊断和治疗。
有益效果：
与现有技术相比，本发明羧基四甲基罗丹明修饰的肾清除型银纳米颗粒及其制备方法与应用，具有如下优势：
本发明通过EDC-NHS耦合反应制备的银纳米颗粒TG-AgNPs是一种全新纳米荧光材料，制备的荧光染料分子NHS-TAMRA包覆银纳米颗粒GS-AgNPs耦合成的TG-AgNPs展现出较强的紫外吸收和高稳定性，其荧光光谱相对于GS-AgNPs，稳定性显著增强，并且具有良好的生物相容性；同时本发明的制备方法易于操控，原料易获得，可加工性强；本发明被NHS-TAMRA包覆银纳米粒TG-AgNPs由于其超高稳定性和较小的生物毒性使其成为生物体内肿瘤诊断和治疗及荧光成像的理想材料。
附图说明
图1为本发明制备的荧光染料分子NHS-TAMRA包覆银纳米颗粒GS-AgNPs耦合成TG-AgNPs的理化图，其中(a)为HR-TEM图，(b)为HR-TEM图中的粒径分布；
图2为本发明制备的TG-AgNPs与GS-AgNPs的紫外-可见、激发和发射光谱，其中(a)为GS-AgNPs，(b)为TG-AgNPs；
图3为本发明制备的TG-AgNPs与GS-AgNPs以及染料分子NHS-TAMRA的紫外-可见光谱；
图4为本发明制备的TG-AgNPs与GS-AgNPs以及染料分子NHS-TAMRA的凝胶-电泳图；
图5为本发明制备的TG-AgNPs和GS-AgNPs的荧光衰减曲线，其中(a)为GS-AgNPs，(b)为TG-AgNPs；
图6为本发明制备的TG-AgNPs在pH＝3时3天内的紫外-可见吸收光谱；
图7为本发明制备的TG-AgNPs在pH＝7与pH＝9时的紫外光谱中Abs522nm/Abs555nm的变化，其中(a)为pH＝7，(b)为pH＝9；
图8(a)为本发明制备的TG-AgNPs在pH＝3的凝胶电泳图；
图8(b)为本发明制备的TG-AgNPs在pH＝7时第1天和第10天的凝胶电泳图；
图9为本发明制备的TG-AgNPs在pH＝7时的HR-TEM图，其中(a)为第1天的HR-TEM图，(b)为第83天的HR-TEM图；
图10为本发明制备的TG-AgNPs和荧光染料NHS-TAMRA分别在第0、1、6、26h的体内荧光成像；
图11为本发明制备的TG-AgNPs和荧光染料NHS-TAMRA分别在第0、1、6、26h肿瘤、身体和膀胱的平均荧光强度对比图，其中(a)为TG-AgNPs，(b)为荧光染料NHS-TAMRA；
图12为本发明制备的TG-AgNPs在48h内小鼠尿液的变化及尿液的紫外-可见吸收光谱，其中(a)为注射TG-AgNPs在48h内小鼠尿液在自然光和365nm紫外灯下的对比图，(b)为尿液的紫外-可见吸收光谱；
图13为本发明制备的TG-AgNPs和GSH混合前后的紫外-可见光谱图和荧光光谱图，其中(a)为混合前后的紫外-可见光谱图，(b)为混合前后的荧光光谱图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
羧基四甲基罗丹明修饰的肾清除型银纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将97mL去离子水,2ml、100mmol/L的硝酸银溶液，1ml、200mmol/L的谷胱甘肽溶液混合，加5mol/L氢氧化钠溶液调pH控制在4.9-5.1，加200μL硼氢化钠溶液进混合液，室温下以搅拌速度不低于900r/min的速度剧烈搅拌2天；
(2)将上述溶液反应2天后，停止反应，取出反应溶液转移至透析袋，透析3天，最后冷冻干燥24h，得到GS-AgNPs粉末；
(3)将上述GS-AgNPs粉末重新溶解在PBS中配制成0.05mmol/L的溶液，调pH为8-9，将pH不敏感荧光染料5(6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(NHS-TAMRA)溶解在DMSO中配制成20mmol/L的溶液，在室温下振荡反应；
(4)将上述溶液反应24h后停止反应，将溶液倒入离心管，加2倍乙醇在10000r/min离心2-3min,丢弃上清液，将沉淀在PBS缓冲液中重新溶解，通过Sephadex LH-20柱，从共轭的TG-AgNPs中去除和分离未反应的NHS-TAMRA。收集第一洗脱相溶液即超稳定银纳米粒TG-AgNPs。
实施例1
对发明制备的一种超稳定银纳米粒TG-AgNPs进行测试，包括荧光、紫外吸收、HR-TEM、电泳、Bruker体内成像系统等等。
将荧光染料NHS-TAMRA包覆银纳米颗粒GS-AgNPs，采用上述实施案例的制备方法，耦合而成TG-AgNP。图1为合成的TG-AgNP的HR-TEM图，可以看出颗粒为球形结构，分散性好，直径小于5.5nm的尺寸依然满足在生物体中肾清除的要求。
如实施例制备的TG-AgNPs，图2为制备合成的TG-AgNPs的紫外-可见、激发和发射光谱与GS AgNPs的对比图。可以发现GS-AgNPs在300-800nm内无吸收峰，然而，图中的紫外-可见吸收曲线显示TG-AgNPs有两个吸收峰，强吸收峰位于522nm处，弱吸收峰位于555nm。图3中游离TAMRA在550nm处表现出强烈的吸收峰。522nm处的另一个肩峰是由于水溶液中单体TAMRA分子之间的缔合作用。与GS-AgNPs偶联后，550nm处的强吸收被分成两个峰：一个峰位于522nm，另一个峰红移到555nm，与先前关于TAMRA分子二聚作用的报告一致，进一步证实了TAMRA二聚体在GS-AgNPs上的偶极-偶极耦合。因为TAMRA的吸收过程中同时观察到蓝移和红移，根据著名的分子激发耦合理论，TAMRA的二聚体不是相互平行的，而是具有中间的几何结构。
实施例2
采用实施案例制备的TG-AgNPs 10uL加入胶板的样品小槽内，接导线进行电泳，当移到距前沿1-2cm时，停止电泳，取出后再紫外灯下观察。图4为本发明制备的TG-AgNPs与GS-AgNPs以及染料分子NHS-TAMRA的凝胶-电泳图。由于GS-AgNPs在溶液中呈负电，通电后向正极移动，将荧光染料连接到GS-AgNPs表面生成红色的TG-AgNPs，具有和GS-AgNPs相同的移动性。而游离粉红色NHS-TAMRA的移动距离明显短于GS-AgNPs和TG-AgNPs，说明荧光染料NHS-TAMRA成功连接到GS-AgNPs表面。
实施例3
采用实施例制备的TG-AgNPs，与GS-AgNPs作荧光衰减曲线对比，图5为二者的荧光衰减曲线图，通过拟合曲线可以得出TG-AgNP的平均荧光寿命是GS-AgNPs的2.4倍，意味着NHS-TAMRA和GS-AgNPs之间存在强荧光共振能量转移。
实施例4
测试实施例制备的TG-AgNPs在pH＝3-11范围内的稳定性。图6为pH＝3时的TG-AgNPs 3天内的紫外-可见吸收光谱图，由图可以看出，第1天时紫外光谱就发生了变化，与TG-AgNPs的紫外-可见吸收光谱中两个吸收峰不同，仅在500nm处出现一个强吸收峰，560nm处为一个肩峰。
测试实施例制备的TG-AgNPs在pH＝7、9的稳定性，对其紫外-可见光谱进行分析，从图7吸收峰值比Abs522nm/Abs555nm可以得出结论在pH＝7和9时稳定性很好，室温避光放置，即使过去120天，紫外可见光谱不发生不变化。这说明在pH＝7、9的条件下，TG-AgNPs在120天内始终维持在最稳定状态。
为更准确说明实施例制备的TG-AgNPs在pH下的稳定性，图8为对TG-AgNPs在pH＝3和7时进行的样品电泳图，凝胶电泳图的结果可以判断，处于pH为3和7时的TG-AgNPs未发生变化，维持稳定性。上述研究发现pH＝3时在第1天紫外光谱就发生变化，是由于在pH＝3时达到GSH的等电点，TG-AgNPs聚集并沉淀导致。再次溶于pH＝7的溶液中快速分散，恢复为最初的稳定状态。
如实施例制备的TG-AgNPs，为更确定在pH＝7条件下可使TG-AgNPs长时间维持稳定的状态，对其测定HR-TEM，图9是pH＝7的TG-AgNPs在第1天和第83天的TEM图。通过对比图发现，83天后的TG-AgNPs分散性依然较好。
实施例5
测试实施例制备的TG-AgNPs的荧光特性，使用Bruker体内成像系统对该颗粒在体内的分布和代谢进行观察。图10中随着时间的推移，大量的TG-AgNPs经肾脏由尿液从体内排出，到尾静脉注射后的第6h，身体各组织/器官都显示极弱的强度，仅膀胱能观察到明显的荧光信号，注射后的第24h基本观察不到明显荧光信号。而注射了NHS-TAMRA荧光染料的小鼠，即使注射后马上采集的成像图，仍然显示了较低的荧光强度，大量的NHS-TAMRA聚集于膀胱处并迅速排出体外，第1h时就已经几乎观察不到明显的荧光信号。TG-AgNPs提高了颗粒在生物体内的停留时间，24h后大量的颗粒可经尿液排出体外，对生物体的毒性较小，表明TG-AgNPs在肿瘤成像和癌症治疗方面有很好的应用前景。
实施例6
探究实施案例制备的TG-AgNPs体内分解情况，图12为注射实施案例制备的TG-AgNPs后48h内小鼠尿液在自然光和365nm紫外灯下的对比图，4h是小鼠的尿液呈粉色，紫外灯下发出橙色的荧光，8h时浓度降低，颜色变浅，荧光也随之变弱。24h尿液颜色恢复正常，对收集的尿液全部稀释至2mL进行紫外-可见光谱测定，发现4h时得到的紫外光谱为NHS-TAMRA特征吸收光谱，8h时浓度较低，峰值发生显著变化，但特征依然可分辨。TG-AgNPs注射入小鼠体中，经体内循环排出。对代谢物进行分析，发现存在NHS-TAMRA，但不排除GS-AgNPs在尿液中存在。
尿液中检测到明显的NHS-TAMRA的吸收峰，而非TG-AgNPs，对产生这种现象的原因，进行了初步探究。图13为TG-AgNPs与GSH混合前后的紫外-可见光谱图和荧光光谱图，混合后TG-AgNPs的吸收峰发生变化，此时的紫外-可见光谱与NHS-TAMRA荧光染料相同，出现NHS-TAMRA强吸收峰可能是由于小鼠体内大量GSH的存在使得NHS-TAMRA从TG-AgNPs上分离下来所致。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.羧基四甲基罗丹明修饰的肾清除型银纳米颗粒，其特征在于，通过5(6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯和谷胱甘肽为配体，合成的GS-AgNPs之间发生EDC-NHS耦合反应获得银纳米粒子TG-AgNPs；所述银纳米粒子TG-AgNPs为分散性好、直径为2-3nm的球形状颗粒，在586nm波长处具有强的荧光发射峰。
2.基于权利要求1所述的羧基四甲基罗丹明修饰的肾清除型银纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，分别取2-4mL浓度为100-200mmol/L的硝酸银溶液和1-2mL浓度为200-400mmol/L的谷胱甘肽溶液于去离子水中，调pH至4.9-5.1，再向混合溶液中加入硼氢化钠溶液，室温下以搅拌速度不低于900r/min的速度剧烈搅拌2天，待反应停止后，取反应溶液透析，并将溶液冷冻干燥，得到谷胱甘肽封端银纳米颗粒GS-AgNPs；
步骤2，将谷胱甘肽封端银纳米颗粒GS-AgNPs与5(6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯NHS-TAMRA溶液发生EDC-NHS耦合反应，反应完成后，按V混合液：V乙醇为1:2的比例加入乙醇，在10000r/min离心2-3min,去掉上清液，并将沉淀重新溶解在PBS中，整个离心过程重复4次，最后一次离心后，将沉淀在PBS缓冲液中重新溶解，并过Sephadex LH-20柱，收集第一洗脱相溶液，即NHS-TAMRA包覆银纳米颗粒AgNPs合成的TG-AgNPs。
3.根据权利要求2所述的5(6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯包覆银纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤2中所述EDC-NHS耦合反应为室温下反应24小时。
4.基于权利要求1所述的NHS-TAMRA包覆银纳米颗粒AgNPs合成的TG-AgNPs在制备诊断或治疗肿瘤的产品上的应用。
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