CN112359020A - 一种杂交瘤细胞株、类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白MAb、抗原表位及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，属于单克隆抗体(MAb)制备技术领域。本发明的杂交瘤细胞株能够分泌类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白MAb，所获得的MAb具有特异性好、效价高等特点。本发明利用上述MAb，结合肽扫描技术，筛选获得了一个位于HA蛋白上的线性抗原表位216VSVGSS221，该表位在类禽型H1N1病毒中高度保守。MAb和抗原表位的获得可用于建立类禽型H1N1 SIV或其抗体的免疫学诊断方法，如ELISA、胶体金等。而表位信息的获得有助于完善H1N1 SIV的HA蛋白表位信息，能够更好的了解HA蛋白抗原结构和功能，为预测病毒抗原性变异的动态，更好的做好疫病的防控提供理论与技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及单克隆抗体制备技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株、类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白MAb、抗原表位及应用。
背景技术
猪流感(SI)是指A型流感病毒引起的猪的传染性呼吸道疾病，该病临床上具有较高的发病率。根据SI流行病学的研究结果发现当前我国猪群中主要流行H1N1、H1N2、H3N2等亚型的病毒。根据 H1N1病毒的基因来源不同，又被分为经典H1N1、类禽H1N1、类人H1N1及2009/H1N1。类禽型H1N1于1979年首次传入猪群，目前在猪群中流行广泛，而且出现了对人的零星感染，该类病毒具有重要的兽医及公共卫生学意义。
猪流感病毒(SIV)的基因组为单股、分节段的负链RNA，编码至少10种以上的蛋白；其中片段4编码的血凝素蛋白(HA)是构成病毒囊膜的主要成分，作为病毒的表面抗原，HA蛋白能够诱导机体产生特异性的中和性抗体，与此同时，HA蛋白又是病毒抗原性决定的重要因素。单克隆抗体(MAb)是针对同一抗原表位的单一抗体，具有生物活性单一、与抗原结合特异性强等特点，被广泛应用于疾病的预防、诊断、治疗及免疫机制研究等方面。目前缺少一种能够分泌 HA蛋白MAb的杂交瘤细胞株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杂交瘤细胞株、类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白MAb、抗原表位及应用，所述杂交瘤细胞株能够分泌HA 蛋白MAb，且分泌得到的HA蛋白MAb效价高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株以表达类禽型H1N1 SIV HA基因的重组质粒为免疫原制备得到。
优选的，所述重组质粒以pCAGGS作为原始质粒，所述类禽型 H1N1 SIV HA基因插入在pCAGGS的的ClaⅠ和BglⅡ位点之间。
优选的，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO：C2020175。
本发明还提供了上述方案所述杂交瘤细胞株分泌的类禽型H1N1 猪流感病毒HA蛋白MAb。
本发明还提供了上述方案所述类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白 MAb在制备类禽型H1N1 SIV检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了上述方案所述类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白 MAb识别HA蛋白的抗原表位；所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：216VSVGSS221。
本发明还提供了检测上述方案所述抗原表位的试剂在制备类禽型H1N1 SIV检测试剂盒中的应用。
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，本发明的杂交瘤细胞株能够分泌类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白MAb，所获得的MAb具有特异性好、效价高等特点。本发明利用上述MAb，结合肽扫描技术，筛选获得了一个位于HA蛋白上的线性抗原表位216VSVGSS221，该表位在类禽型H1N1病毒中高度保守。MAb和抗原表位的获得可用于建立类禽型H1N1 SIV或其抗体的免疫学诊断方法，如ELISA、胶体金等。而表位信息的获得有助于完善H1N1 SIV的HA蛋白表位信息，能够更好的了解HA蛋白抗原结构和功能，为预测病毒抗原性变异的动态，更好的做好疫病的防控提供理论与技术支撑。
附图说明
图1A为pCAGGS-HA蛋白表达的IFA检测结果；
图1B为pCAGGS-HA蛋白表达的Western-blot检测结果；
图2MAb 2G2的Westernblot活性检测结果；
图3HA蛋白抗原表位的鉴定策略；
图4MAb 2G2识别抗原表位的第一次截断；
图5MAb 2G2识别抗原表位的第二次截断；
图6MAb 2G2识别抗原表位的精确定位；
图7表位氨基酸的保守性分析。
生物保藏说明
杂交瘤细胞株2G2，于2020年10月02日保藏在中国典藏培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO： C2020175。
具体实施方式
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株以表达类禽型H1N1 SIV HA基因的重组质粒为免疫原制备得到。
在本发明中，所述重组质粒优选的以pCAGGS作为原始质粒，所述类禽型H1N1 SIVHA基因插入在pCAGGS的的ClaⅠ和BglⅡ位点之间。类禽型H1N1 SIV的HA基因在真核表达质粒pCAGGS 中能够获得高效表达，且所表达的蛋白具有良好的生物学活性。在本发明中，pCAGGS质粒含有AG复合启动子，能够实现其下游插入基因的高效表达。
在本发明中，所述类禽型H1N1 SIV HA基因的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示，具体为： atggaaacaaaactatttgtattattctgtgcattcactgcactgaaagctgacaccatctgtgtaggctatc atgccaacaattccacggacactgtcgacacaatactggagaaaaatgtgactgttacccattcagttaatttactggaaaacagccataatgggaaactctgcagcctgaatggaaagatccccttacaactggggaact gcaacgtagcaggatggatccttggcaacccaaaatgtgacttgctgctcacagcgaattcgtggtctta cataatagagacttcaaattcaaaaaatggagcatgctaccccggagaattcgctgattatgaagagttaa aagagcagctgagtacagtttcttcatttgaaagatttgaaattttcccaaaggcaacctcatggccaaacc atgatacaaccagaggtaccacagttgcatgctcccactctggagccaacagtttttatcggaatttactat ggatagtaaagaaaggaaactcctatcctaaactcagcaagtcatacacaaacaataagggaaaggaa gtgcttgtaatttggggagtgcaccaccctccgactgacagtgaccaacaaaccctctaccagaataatc atacatatgtttcagttggatcatcaaaatactacaaaaggttcacaccagaaatagtagcaagacctaaa gtcagagaacaatcaggcagaatgaattattactggacactgttagatcaaggggacaccataacttttga agccactgggaatttaatagcaccatggcacgcatttgcgttgagaaaaggctctagttctggaattatgat gtctgatgctaaggttcacaattgcactacaaaatgccaaactccctatggggccttgaaaggcaatcttc cttttcagaacgtacatccagtcactattggagaatgccccaaatatgttaaaagcacacaactgagaatg gcaacaggactaaggaatatcccctctattcaatcaagaggacttttcggggcaattgccggattcattga aggaggatggacaggaatggtagatggatggtatgggtatcaccatcgaaatgagcagggatctggtta cgcagcagatcagaaaagcacacaaattgcaattgatgggataagtaacaaagtgaactcagtaattga aaaaatgaacattcaatttacttcagtgggcaaggagttcaatagtctagagaaaaggatggaaaatttga ataagaaggttgatgatgggtttttggatgtatggacatataacgctgagttgctcattttactcgagaatgaaaggactctggatttccatgaccttaacgtaaaaaatttatatgaaaaggtcaaatcacaactaaggaaca atgccaaggagatcggtaatggctgctttgagttctatcacaaatgtgataatgagtgcatggaaagcgta aagaatggcacatacaattatcccaaatattcagaagaatccaagttgaatagggaggaaatagatggtg tgaaactagaatcaatgggaattcaccagattttggcgatctactccacagtcgccagttccctggtcctat tagtctccctgggggcaatcagtttttggatgtgttctaatgggtcattgcaatgcagagtatgcatttaa，全长为1701bp。
在本发明中，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO： C2020175。
本发明所述杂交瘤细胞株能够稳定分泌抗HA蛋白单克隆抗体 (MAb)。
本发明所述杂交瘤细胞株优选的采用以下方法制备得到：
利用所述重组质粒免疫BALB/c小鼠，细胞融合，得到杂交瘤细胞株；本发明对所述免疫的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
本发明还提供了上述方案所述杂交瘤细胞株分泌的类禽型H1N1 猪流感病毒HA蛋白MAb。
本发明还提供了上述方案所述类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白 MAb在制备类禽型H1N1 SIV检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了上述方案所述类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白 MAb识别HA蛋白的抗原表位；所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：216VSVGSS221。
本发明还提供了检测上述方案所述抗原表位的试剂在制备类禽型H1N1 SIV检测试剂盒中的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、重组表达质粒pCAGGS-HA的构建与鉴定
取病毒A/swine/Zhejiang/245/2013(H1N1)(哈尔滨兽医研究所分离、鉴定并保存，参见【徐汇洋，许榜丰，陈艳，隋金钰，杨焕良，尹航，杨大为，乔传玲，陈化兰.一株H1N1猪流感病毒的进化分析与分子特征.中国农业科学2015,48(15)：3071-3078ScientiaAgricultura Sinica doi：10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.018】)接种10日龄无特定病原(SPF)鸡胚(购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心)，36℃增殖72h后收获尿囊液，加入Trizol试剂(Gibco BRL)提取RNA，用通用引物uni12(序列为：5'-agcaaaagcagg-3'，如SEQID No.3所示) 逆转录获得病毒HA基因cDNA。以cDNA为模板进行聚合酶链反应 (PCR)扩增HA基因，所用引物：上游引物HAF：5'-gcaatcgat atggaaacaaaactatttgtatta-3'，如SEQ IDNo.4所示；下游引物HAR： 5'-gcaagatctttaaatgcatactctgcattgc-3'，如SEQ ID No.5所示；
PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火 40s，72℃延伸2min，循环扩增35次，最后72℃延伸10min。
PCR反应的体系是：总体系为50μl，其中cDNA 2μl、
Max DNAPremix(2X)25μl、上游引物(10μM)1μl、下游引物(10μM)1μl和ddH2O 21μl。
胶回收PCR产物，将其克隆于载体pCAGGS中(HA基因插入载体质粒的ClaⅠ和BglⅡ位点之间)，经测序验证后，获得重组表达质粒pCAGGS-HA。
2、HA蛋白在293T细胞中表达的检测
将pCAGGS-HA和pCAGGS按转染试剂盒说明书分别进行转染；将转染60h后的293T细胞用冰预冷的无水乙醇固定20min，以鸡抗类禽型H1N1 SIV的多克隆血清作为一抗，二抗为荧光标记的抗鸡抗体，于荧光显微镜下观察可见到转染pCAGGS-HA的293T细胞呈现绿色荧光，而转染空载体pCAGGS及未转染质粒的293T细胞均未观察到绿色荧光，表明所构建的真核表达载体pCAGGS-HA的HA基因能够在真核细胞中得到表达(图1A)。
分别取pCAGGS-HA和pCAGGS转染60h后的293T细胞样品进行SDS-PAGE电泳，转移至NC膜上用鸡抗SIV多克隆血清进行 Westernblot鉴定，结果表明，转染pCAGGS-HA的293T细胞样品在 72ku处出现一条明显的条带，与预期大小相符；而空载体则无此反应条带，进一步证实HA蛋白在真核细胞中获得表达，表达蛋白具有良好的免疫原性(图1B)。
3、免疫原DNA的制备及小鼠免疫
按照QIAGEN质粒提取试剂盒说明书提取pCAGGS-HA。具体操作如下：
1)将培养后的菌液4℃，6000g离心15min，弃掉上清，收集菌体。
2)用4ml BufferP1溶解菌体，加入4ml的BufferP2，混匀后静置5min。
3)加入4ml 4℃预冷的BufferP3，立即颠倒混匀4～6次，6000g 离心10min，使白色絮状物沉淀，将上清加入到过滤柱中，孵育10min。在此期间，向QIAGEN-tip加入4ml BufferQBT平衡液，让液体自然流下。
4)插入活塞，将过滤柱中的上清推入QIAGEN-tip中，让上清自然流出。
5)加入10ml的Buffer QC冲洗QIAGEN-tip，弃掉滤液，共洗2 次。
6)加入5ml的Buffer QF洗脱DNA，用新的离心管保存滤液。加入3.5ml的异丙醇，充分混匀，4℃，13000g离心30min，小心弃去上清。
7)加入2ml 70％的乙醇，溶解沉淀，12000g离心10min，吸去上清，并用适量的ddH2O溶解沉淀，测其DNA的含量。DNA含量约为11.6μg/μL。
将pCAGGS-HA按100μg/只的剂量经腿部肌肉注射免疫4～5周龄BALB/c小鼠，共免疫3次，每次间隔2周，三免后5天进行细胞融合，细胞融合前3d再次加强，加强免疫的剂量是100μg/只。
4、阳性杂交瘤细胞的筛选
按常规方法进行细胞融合。融合10d后筛选杂交瘤细胞，筛选方法如下：
按常规间接ELISA方法操作，以矩阵法确定最佳抗原包被浓度、血清最佳稀释度以及一抗、二抗的最佳作用时间，建立MAb的ELISA 筛选方法。具体操作如下：
1)以纯化的ZJ245病毒蛋白为包被抗原，将其稀释至1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml，包被ELISA板，100μl/ 孔，置于4℃过夜包被。第二天，甩出包被液，PBST洗板3次，5min/ 次。
2)加入5％脱脂乳封闭ELISA板，200μl/孔，37℃封闭2h，PBST 洗涤3次，5min/次。
3)分别对阴、阳性血清进行1：100、1：200、1：400、1：800、 1：1600倍稀释，100μl/孔，37℃中作用1h，用PBST洗板3次，5min/ 次。
4)加入1：4000稀释的羊抗鼠HRP-IgG，100μl/孔，37℃孵育 1h，PBST重复洗板3次，5min/次。
5)按100μl/孔的量加入TMB底物显色液，置于37℃温箱中作用4min，加入2mol/L的H2S04终止反应，50μl/孔，读取OD450nm。
6)进行ELISA结果判定，以阳性孔OD值最接近于1，阴性孔 OD值小于0.2，P/N值≥2.1的抗原包被浓度和血清稀释度作为最佳工作浓度。
阳性培养孔细胞用有限稀释法进行克隆纯化，直至所有克隆细胞100％阳性。
5、MAb亚类的鉴定及效价测定
利用SBAClono-typingTM Systerm/HRP抗体亚类试剂盒测得2G2 分泌的MAb的抗体亚类为Ig M型，轻链为κ链。间接ELISA方法测得杂交瘤细胞培养上清效价为1∶102、腹水效价为1∶106。
6、MAb的western blot检测
Westernblot试验结果表明，2G2 MAb可与纯化的SIV HA蛋白在约55ku处产生特异性条带，而SP2/0上清则不与之发生反应，由此证明2G2是一株针对SIV HA蛋白HA1区域的线性表位的MAb(图 2)。
7、MAb的HI和中和活性的测定
将获得的MAb 2G2与SW/ZJ/245/13按照常规操作进行HI试验，结果2G2对类禽型SW/ZJ/245/13病毒具有HI活性。
将生长状况良好的MDCK细胞铺于96孔细胞培养板中。用 DMEM培养液对腹水进行倍比稀释，按1：10，1：20，1：40……倍比稀释至1：5120，将ZJ245病毒稀释至100TCID50/50μL，按常规方法进行中和试验。结果发现2G2 MAb对SW/ZJ/245/13毒株不具有中和活性。
8、HA蛋白抗原表位的鉴定
首先根据毒株SW/ZJ/245/13HA1的编码序列，将HA1蛋白的编码基因截短为4段部分重叠的短肽片段，分别命名为Pep1、Pep2、 Pep3、Pep4。根据序列的特征，在Pep1、Pep3和Pep4引物的上下游分别引入EcoR I和Xho I酶切位点，Pep2引物的上下游分别引入 BamH I和Xho I酶切位点。引物序列见附表1，HA1蛋白分段策略见图3。以制备的MAb 2G2为一抗MAb为一抗对4个短肽进行 Westernblot分析。结果MAb 2G2能够与Pep3及Pep4发生反应(图 4，将HA1蛋白的编码基因截短为4段部分重叠的短肽片段，并通过构建原核表达载体分段表达，分别命名为Pep1、Pep2、Pep3、Pep4； GST泳道为阴性对照组)，初步确定MAb 2G2特异性识别的抗原表位在Pep3及Pep4的重叠部分(命名为Pep5)；将Pep5按图3再分成4部分重叠的片段(Pep6-Pep9)，进行原核表达。同样以制备的 MAb 2G2为一抗对各个短肽进行Westernblot分析。结果表明Pep 6 能够与MAb 2G2发生反应，从而将HA1蛋白抗原表位进一步确定为210QNNHTYVSVGSSKYY224，如SEQ ID No.6所示，(图5，经过第 1次截断后，确定抗原表位位于Pep3与Pep4重叠部分(Pep5)，对 Pep5进行另一轮的截短表达，将其截短为4段有部分重叠的短肽片段，通过构建原核表达载体分段表达，表达后的短肽分别命名为Pep6、Pep7、Pep8、Pep9；GST泳道为阴性对照组)。根据210QNNHTYVSVGSSKYY224短肽的编码序列，分别从C-端和N-端逐个截短氨基酸，将其设计为8对寡核苷酸链(表1)。表达8个GST 融合短肽后，以制备的HA1 MAb 2G2为一抗，与GST融合短肽再次进行Westernblot分析，结果显示HA1蛋白能够被MAb 2G特异性识别的最短抗原表位是216VSVGSS221(如SEQ ID No.2所示)(图6，经过第2次截断后，确定抗原表位位于Pep6，对Pep6进行第3轮的截短表达，将其截短为8段有部分重叠的短肽片段，通过构建原核表达载体分段表达，表达后的短肽分别命名为Pep10、Pep11、Pep12、 Pep13、Pep14、Pep15、Pep16、Pep17；GST泳道为阴性对照组)。
表1用于部分重叠肽段表达的引物和寡核苷酸链
9、抗原表位216VSVGSS221的保守性分析
将所鉴定的表位与12株类禽型H1N1 SIV，5株H1N1亚型禽流感病毒(AIV)，5株经典型H1N1毒株，5株2009/H1N1毒株以及5 株人流感H1N1毒株的氨基酸序列进行比对。结果发现该表位216VSVGSS221在EAH1N1 SIV之间高度保守，但在2013年分离到的两株猪流感病毒SIV A/swine/Guangdong/104/2013以及 A/swine/Guangdong/306/2013中，219位氨基酸不同。该段表位在 AIV(H1N1)中也保守，与经典型H1N1流感病毒217位有所不同，与 2009/H1N1流感病毒在217和220位有所不同，和人流感病毒相比其 219位有差异，结果见图7。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> 一种杂交瘤细胞株、类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白MAb、抗原表位及应用
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1701
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaaacaa aactatttgt attattctgt gcattcactg cactgaaagc tgacaccatc 60
tgtgtaggct atcatgccaa caattccacg gacactgtcg acacaatact ggagaaaaat 120
gtgactgtta cccattcagt taatttactg gaaaacagcc ataatgggaa actctgcagc 180
ctgaatggaa agatcccctt acaactgggg aactgcaacg tagcaggatg gatccttggc 240
aacccaaaat gtgacttgct gctcacagcg aattcgtggt cttacataat agagacttca 300
aattcaaaaa atggagcatg ctaccccgga gaattcgctg attatgaaga gttaaaagag 360
cagctgagta cagtttcttc atttgaaaga tttgaaattt tcccaaaggc aacctcatgg 420
ccaaaccatg atacaaccag aggtaccaca gttgcatgct cccactctgg agccaacagt 480
ttttatcgga atttactatg gatagtaaag aaaggaaact cctatcctaa actcagcaag 540
tcatacacaa acaataaggg aaaggaagtg cttgtaattt ggggagtgca ccaccctccg 600
actgacagtg accaacaaac cctctaccag aataatcata catatgtttc agttggatca 660
tcaaaatact acaaaaggtt cacaccagaa atagtagcaa gacctaaagt cagagaacaa 720
tcaggcagaa tgaattatta ctggacactg ttagatcaag gggacaccat aacttttgaa 780
gccactggga atttaatagc accatggcac gcatttgcgt tgagaaaagg ctctagttct 840
ggaattatga tgtctgatgc taaggttcac aattgcacta caaaatgcca aactccctat 900
ggggccttga aaggcaatct tccttttcag aacgtacatc cagtcactat tggagaatgc 960
cccaaatatg ttaaaagcac acaactgaga atggcaacag gactaaggaa tatcccctct 1020
attcaatcaa gaggactttt cggggcaatt gccggattca ttgaaggagg atggacagga 1080
atggtagatg gatggtatgg gtatcaccat cgaaatgagc agggatctgg ttacgcagca 1140
gatcagaaaa gcacacaaat tgcaattgat gggataagta acaaagtgaa ctcagtaatt 1200
gaaaaaatga acattcaatt tacttcagtg ggcaaggagt tcaatagtct agagaaaagg 1260
atggaaaatt tgaataagaa ggttgatgat gggtttttgg atgtatggac atataacgct 1320
gagttgctca ttttactcga gaatgaaagg actctggatt tccatgacct taacgtaaaa 1380
aatttatatg aaaaggtcaa atcacaacta aggaacaatg ccaaggagat cggtaatggc 1440
tgctttgagt tctatcacaa atgtgataat gagtgcatgg aaagcgtaaa gaatggcaca 1500
tacaattatc ccaaatattc agaagaatcc aagttgaata gggaggaaat agatggtgtg 1560
aaactagaat caatgggaat tcaccagatt ttggcgatct actccacagt cgccagttcc 1620
ctggtcctat tagtctccct gggggcaatc agtttttgga tgtgttctaa tgggtcattg 1680
caatgcagag tatgcattta a 1701
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Ser Val Gly Ser Ser
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcaaaagca gg 12
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcaatcgata tggaaacaaa actatttgta tta 33
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaagatctt taaatgcata ctctgcattg c 31
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Asn Asn His Thr Tyr Val Ser Val Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcgaattct ttgtattatt ctgtgcattc ac 32
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcctcgagg atccatcctg ctacgttgca gttc 34
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcggatccc aactggggaa ctgcaacgta gcag 34
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgcctcgaga gagtgggagc atgcaactgt ggta 34
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agcgaattct tcccaaaggc aacctcatgg ccaa 34
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgcctcgagt ttaggtcttg ctactatttc tggt 34
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcgaattcc ctccgactga cagtgaccaa caaa 34
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgcctcgagg ggagtttggc attttgtagt gcaa 34
<210> 15
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aattccctcc gactgacagt gaccaacaaa ccctctacca gaataatcat tagc 54
<210> 16
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcgagctaat gattattctg gtagagggtt tgttggtcac tgtcagtcgg aggg 54
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aattccaaac cctctaccag aataatcata catatgtttc agttggatca tagc 54
<210> 18
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcgagctatg atccaactga aacatatgta tgattattct ggtagagggt ttgg 54
<210> 19
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aattccatac atatgtttca gttggatcat caaaatacta caaaaggttc tagc 54
<210> 20
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcgagctaga accttttgta gtattttgat gatccaactg aaacatatgt atgg 54
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aattctcatc aaaatactac aaaaggttca caccagaaat agtagcaaga cctaaatagc 60
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcgagctatt taggtcttgc tactatttct ggtgtgaacc ttttgtagta ttttgatgag 60
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aattcagaat aatcatacat atgtttcata gc 32
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tcgagctatg aaacatatgt atgattattc tgg 33
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aattcaataa tcatacatat gtttcagttt agc 33
<210> 26
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcgagctava actgaaacat atgtatgatt attg 34
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aattcaatca tacatatgtt tcagttggat agc 33
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcgagctatc caactgaaac atatgtatga ttg 33
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aattccatac atatgtttca gttggatcat agc 33
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tcgagctatg atccaactga aacatatgta tgg 33
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aattcacata tgtttcagtt ggatcatcat agc 33
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgagctatg atgatccaac tgaaacatat gtg 33
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aattctatgt ttcagttgga tcatcaaaat agc 33
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcgagctatt ttgatgatcc aactgaaaca tag 33
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aattcgtttc agttggatca tcaaaatact agc 33
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
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<400> 36
tcgagctagt attttgatga tccaactgaa acg 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aattctcagt tggatcatca aaatactact agc 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tcgagctagt agtattttga tgatccaact gag 33
Claims (7)
1.一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株以表达类禽型H1N1 SIV HA基因的重组质粒为免疫原制备得到。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述重组质粒以pCAGGS作为原始质粒，所述类禽型H1N1 SIV HA基因插入在pCAGGS的ClaⅠ和BglⅡ位点之间。
3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO：C2020175。
4.权利要求1～3任意一项所述杂交瘤细胞株分泌的类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白MAb。
5.权利要求4所述类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白MAb在制备类禽型H1N1 SIV检测试剂盒中的应用。
6.权利要求4所述类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白MAb识别HA蛋白的抗原表位；所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：216VSVGSS221。
7.检测权利要求6所述抗原表位的试剂在制备类禽型H1N1 SIV检测试剂盒中的应用。
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| CN202011244388.1A CN112359020B (zh) | 2020-11-10 | 2020-11-10 | 一种杂交瘤细胞株、类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白MAb、抗原表位及应用 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113817687A (zh) * | 2021-09-22 | 2021-12-21 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 一种杂交瘤细胞株、a型流感病毒核蛋白单克隆抗体及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101988050A (zh) * | 2010-12-09 | 2011-03-23 | 湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 抗h1n1猪流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及抗原捕获elisa试剂盒 |
-
2020
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113817687A (zh) * | 2021-09-22 | 2021-12-21 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 一种杂交瘤细胞株、a型流感病毒核蛋白单克隆抗体及其应用 |
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