CN112342304A - 水牛21个str位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 - Google Patents
水牛21个str位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，所述试剂盒包括扩增21个水牛STR位点的特异性引物，其中STR位点为：CSSM019、BM2113、CSSM047、CSSM038、SPS113、CSRM060、CSSM057、CSSM033、CSSM029、CSSM022、CSSM043、UMN0929、TGLA126、ETH225、CSSM041、CSSM013、TGLA227、FJ232023、ILSTS030、FJ232022、CSSM032。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述试剂盒具有特异性强，灵敏度高，分型结果准确的优点，完全能够满足水牛亲权鉴定与个体识别的需要；(2)所述试剂盒涵盖了水牛21个STR基因座，不仅弥补了本领域产品或技术上的空缺，同时提高该类案件的解决速率。
Description
技术领域
本发明属于法医遗传学领域，涉及一种荧光标记复合扩增检验系统，具体为水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用。
背景技术
水牛，常见牛种之一，由亚洲野水牛在3000-6000年前驯化而来，主要分布在南亚、东南亚及东亚的热带和亚热带地区，是我国南方的一种重要家畜，通常用于水田的耕作，在稻作文化的发展和传播中扮演着重要的角色，是我国主要牛种之一。我国拥有丰富的水牛遗传资源，据联合国粮食与农业组织资料显示，中国水牛存栏量居世界第三位。
短串联重复序列基因座(short tandem repeat，STR)作为继限制性片段长度多态性之后的第二代遗传标记，自二十世纪八九十年代以来，被广泛应用于法医物证学方面相关的研究及鉴定，是目前应用最广泛的遗传标记之一。STR标记与其他遗传标记物相比，STR基因座片段小、容易扩增，更适用于微量和降解检材，且多个STR基因座可以同时进行复合扩增，具有快速、高效、准确、灵敏、信息量大等优点，被广泛应用于法医物证中的个体识别和亲子鉴定。经研究报道发现，该项技术也可用于牛亲权鉴定与个体识别。
目前市场上并没有针对水牛STR检测的商品化试剂盒，针对黄牛STR检测的商品化试剂盒有AB的Thermo Scientifc Bovine Genotypes Panel 3.1。因水牛与黄牛在生物分类学上分属不同的牛属，两者的基因存在较大的差异。根据黄牛基因筛选的STR位点并不能完全适用于水牛的检测。本发明筛选可用于水牛检测的21个特异性STR位点，可高效解决水牛个体识别的问题，不仅弥补国内该类产品的空缺，而且提高该类案件的解决速率。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种具有高分辨率且能够满足水牛亲权鉴定与个体识别的试剂盒，本发明提供了水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用。
技术方案：水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，所述试剂盒包括扩增21个水牛STR位点的特异性引物，其中STR位点为：CSSM019、BM2113、CSSM047、CSSM038、SPS113、CSRM060、CSSM057、CSSM033、CSSM029、CSSM022、CSSM043、UMN0929、TGLA126、ETH225、CSSM041、CSSM013、TGLA227、FJ232023、ILSTS030、FJ232022、CSSM032。
优选的，所述特异性引物序列如下：CSSM019、SEQ ID NO:1～2；BM2113、SEQ IDNO:3～4；CSSM047、SEQ ID NO:5～6；CSSM038、SEQ ID NO:7～8；SPS113、SEQ ID NO:9～10；CSRM060、SEQ ID NO:11～12；CSSM057、SEQ ID NO:13～14；CSSM033、SEQ ID NO:15～16；CSSM029、SEQ ID NO:17～18；CSSM022、SEQ ID NO:19～20；CSSM043、SEQ ID NO:21～22；UMN0929、SEQ ID NO:23～24；TGLA126、SEQ ID NO:25～26；ETH225、SEQ ID NO:27～28；CSSM041、SEQ ID NO:29～30；CSSM013、SEQ ID NO:31～32；TGLA227、SEQ ID NO:33～34；FJ232023、SEQ ID NO:35～36；ILSTS030、SEQ ID NO:37～38；FJ232022、SEQ ID NO:39～40；CSSM032、SEQ ID NO:41～42。
优选的，所述特异性引物在扩增体系中的终浓度为：CSSM019、0.4μM；BM2113、0.2μM；CSSM047、0.2μM；CSSM038、0.32μM；SPS113、0.4μM；CSRM060、0.6μM；CSSM057、0.4μM；CSSM033、0.6μM；CSSM029、0.2μM；CSSM022、0.2μM；CSSM043、0.4μM；UMN0929、0.4μM；TGLA126、0.4μM；ETH225、0.2μM；CSSM041、0.8μM；CSSM013、0.8μM；TGLA227、0.2μM；FJ232023、0.2μM；ILSTS030、0.6μM；FJ232022、0.6μM；CSSM032、0.6μM。
表1.21个STR基因座的引物信息
优选的，所述特异性引物分为四组：CSSM019、BM2113、CSSM047、CSSM038、SPS113、CSRM060为第一组，CSSM057、CSSM033、CSSM029、CSSM022、CSSM043、UMN0929为第二组，TGLA126、ETH225、CSSM041、CSSM013为第三组，TGLA227、FJ232023、ILSTS030、FJ232022、CSSM032为第四组；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
优选的，所述荧光染料为：6-FAM、HEX、TAMRA、ROX中任意一种，且每组采用的荧光标记不同；所述试剂盒包括分子内标，且分子内标由橙色荧光SIZ标记。
优选的，所述试剂盒包括特异性复合扩增引物、反应混合液、21个基因座位点的等位基因、热启动Taq酶、DNA标准品、sdH2O和荧光分子量内标；其中反应混合液的组成为：MgCl2 7.5mM,Tris-HCl 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7.5mM，BSA2g/L。各组分及其含量见表2：
表2.PCR扩增体系
| 组分 | 体积 |
| Reaction Mix | 10.0μL |
| 基因组DNA | Xμl含量为0.125-5ng |
| 引物混合物 | 5.0μL |
| 热启动Taq酶(5U/μL) | 0.5μL |
| sdH<sub>2</sub>O | 补足至25.0μL |
以上任一所述水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒在水牛亲权鉴定或个体识别中的应用。
优选的，水牛亲权鉴定或个体识别中采用的样品来源包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机抽提法提取的水牛基因组DNA。
所述试剂盒的应用步骤为：收集基因组DNA，进行PCR扩增，分析扩增产物；具体为：A、按照表2的组分配制扩增体系
B、扩增热循环
(l)将PCR扩增管置于热循环仪上；
(2)选择表3推荐的程序进行扩增；
(3)扩增后的样品应避光保存；
表3热循环仪的扩增程序
C、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔(0.5μl AGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与1μl扩增产物或系统中21个基因座等位基因分型标准物Allelic Ladder(无锡中德美联生物技术有限公司)混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快使遗传分析仪进行电泳检测。
D、分型分析
用片段分析软件GeneMapper ID-X分析步骤C中遗传分析仪检测收集的数据。电泳采用多道或单道毛细管电泳。
有益效果：(1)本发明所述试剂盒具有特异性强，灵敏度高，分型结果准确的优点，完全能够满足水牛亲权鉴定与个体识别的需要；(2)所述试剂盒涵盖了水牛21个STR基因座，不仅弥补了本领域产品或技术上的空缺，同时提高该类案件的解决速率。
附图说明
图1为所述试剂盒的基因座排布图；
图2为样本1的分型图；
图3为样本2的分型图；
图4为样本3的分型图；
图5为样本4的分型图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一、基因座位点筛选
通过研究联合国粮农组织(FAO)与国际动物遗传学会(ISAG)联合推荐的用于动物遗传多样性研究的微卫星标记组合中所推荐的适合牛识别的STR位点与一些关于牛STR位点研究的论文文献，根据多态性高、标记间不连锁、易于基因分型等要求及实际引物测试效果与基因座排布需求，筛选出21个STR基因座：CSSM019、BM2113、CSSM047、CSSM038、SPS113、CSRM060、CSSM057、CSSM033、CSSM029、CSSM022、CSSM043、UMN0929、TGLA126、ETH225、CSSM041、CSSM013、TGLA227、FJ232023、ILSTS030、FJ232022、CSSM032。
二、基因座排布
根据以上21个基因座，设计了独特的基因座排布方式及化学荧光染料标记的方法：CSSM019、BM2113、CSSM047、CSSM038、SPS113、CSRM060为第一组，荧光染料标记物为6-FAM；CSSM057、CSSM033、CSSM029、CSSM022、CSSM043、UMN0929为第二组，荧光染料标记物为HEX；TGLA126、ETH225、CSSM041、CSSM013为第三组，荧光染料标记物为TAMRA；TGLA227、FJ232023、ILSTS030、FJ232022、CSSM032为第四组，荧光染料标记物为ROX，基因座排布如图1。
三、特异性引物设计及复合扩增条件的建立
通过基因座名称或者染色体位置，利用UCSC或NCBI网站进行基因座序列下载；其次，根据每个基因座重复单元两侧的序列进行引物设计。
(1)特异性引物设计
在设计引物时，使用的设计软件最佳搭配是Premier和Oligo合并使用，以Premier进行自动搜索，Oligo进行分析评价，引物碱基分布要随机、Tm值相近、GC含量在40％～60％之间、引物自身及引物之间不应存在互补序列；同时也要保证引物扩增的特异性，在NCBI数据库中使用Primer-BLAST软件对设计的引物进行比对分析，要充分考虑引物3’端的特异性，因为引物3’端序列同源性较高的话容易导致错误引发。
随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试，最终保证试剂盒的扩增特异性及效率。
(2)复合扩增条件的建立
先对21个基因座的单一扩增条件进行优化，在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上，研究21个基因座复合扩增PCR反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如，循环参数、退火温度、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，建立起复合扩增体系，同时扩增出21个基因座，最终引物序列及浓度见表1。
四、调整PCR反应混合液
PCR体系中，Mg2+浓度分别测试1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM 5个梯度，dNTPs浓度分别测试0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM 5个梯度，热启动Taq酶含量分别测试1.0U、1.5U、2.0U、2.5U、3.0U共5梯度，Tris-HCl浓度定为10mM，KCl浓度定为40mM。通过设计正交实验，最终将Mg2+浓度定为2.0mM，dNTPs浓度定为0.25mM，热启动Taq酶含量2.0U，Tris-HCl浓度定为10mM，KCl浓度定为40mM，利用以上材料制备成反应混合液Reaction Mix，加入到PCR体系中。最终PCR体系各组成如下表：
| 组分 | 体积 |
| Reaction Mix | 10.0μL |
| 基因组DNA | Xμl含量为0.125-5ng |
| 引物混合物 | 5.0μL |
| 热启动Taq酶(5U/μL) | 0.5μL |
| sdH<sub>2</sub>O | 补足至25.0μL |
实施例2本发现在实际样本检测中的应用
(1)4份不同水牛的血斑样本：样本由某公安局提供。
(2)利用Chelex法对样本进行DNA提取，使用本试剂盒对提取样本进行分型检测，将4份样本的所有位点分型进行对比：
| 位点名称 | 样本1 | 样本2 | 样本3 | 样本4 |
| CSSM019 | 100,100 | 102,104 | 92,100 | 102,106 |
| BM2113 | 123,125 | 125,125 | 121,123 | 123,123 |
| CSSM047 | 148,168 | 146,148 | 148,152 | 168,170 |
| CSSM038 | 200,200 | 198,200 | 198,200 | 200,200 |
| SPS113 | 219,233 | 225,225 | 225,233 | 227,233 |
| CSRM060 | 247,247 | 249,289 | 247,267 | 247,247 |
| CSSM057 | 113,113 | 115,119 | 113,117 | 119,119 |
| CSSM033 | 140,152 | 156,162 | 140,152 | 140,152 |
| CSSM029 | 179,179 | 179,181 | 179,185 | 193,193 |
| CSSM022 | 224,226 | 224,228 | 226,226 | 225,226 |
| CSSM043 | 251,281 | 251,279 | 251,279 | 251,279 |
| UMN0929 | 300,324 | 300,324 | 300,300 | 300,300 |
| TGLA126 | 85,85 | 85,85 | 85,85 | 85,87 |
| ETH225 | 128,128 | 128,128 | 128,128 | 128,130 |
| CSSM041 | 162,162 | 162,162 | 160,162 | 162,162 |
| CSSM013 | 212,212 | 212,214 | 212,212 | 212,216 |
| TGLA227 | 90,94 | 90,94 | 90,94 | 90,94 |
| FJ232023 | 111,115 | 111,115 | 115,119 | 115,115 |
| ILSTS030 | 136,136 | 136,136 | 136,136 | 136,140 |
| FJ232022 | 168,182 | 170,182 | 182,182 | 168,182 |
| CSSM032 | 219,225 | 225,225 | 219,221 | 221,225 |
结果显示，使用本发明对上述水牛样本进行分型检测，发现各个水牛个体之间分型存在较大差异，使用本发明可对水牛个体进行有效辨别，在水牛个体识别上有较大的作用。
序列表
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aggtaaatgt tcctatttgc taac 24
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acagacagaa actcaatgaa agca 24
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tagccattgg acagcccg 18
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cagtgccctc gtgcttgata 20
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gttgcccgtt cattacctac ac 22
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctgcagttct gcatatgtgg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cttagacaac aggggtttgg 20
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aacaggaacc agcatgaacc ac 22
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cctattccta attgtagctc ctct 24
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ttattttcag tgtttctaga aaac 24
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tataatattg ctatctggaa atcc 24
Claims (9)
1.水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增21个水牛STR位点的特异性引物，其中STR位点为：CSSM019、BM2113、CSSM047、CSSM038、SPS113、CSRM060、CSSM057、CSSM033、CSSM029、CSSM022、CSSM043、UMN0929、TGLA126、ETH225、CSSM041、CSSM013、TGLA227、FJ232023、ILSTS030、FJ232022、CSSM032。
2.根据权利要求1所述的水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述特异性引物序列如下：CSSM019、SEQ ID NO:1～2；BM2113、SEQ ID NO:3～4；CSSM047、SEQ ID NO:5～6；CSSM038、SEQ ID NO:7～8；SPS113、SEQ ID NO:9～10；CSRM060、SEQ IDNO:11～12；CSSM057、SEQ ID NO:13～14；CSSM033、SEQ ID NO:15～16；CSSM029、SEQ IDNO:17～18；CSSM022、SEQ ID NO:19～20；CSSM043、SEQ ID NO:21～22；UMN0929、SEQ IDNO:23～24；TGLA126、SEQ ID NO:25～26；ETH225、SEQ ID NO:27～28；CSSM041、SEQ ID NO:29～30；CSSM013、SEQ ID NO:31～32；TGLA227、SEQ ID NO:33～34；FJ232023、SEQ ID NO:35～36；ILSTS030、SEQ ID NO:37～38；FJ232022、SEQ ID NO:39～40；CSSM032、SEQ ID NO:41～42。
3.根据权利要求1所述的水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述特异性引物在扩增体系中的终浓度为：CSSM019、0.4μM；BM2113、0.2μM；CSSM047、0.2μM；CSSM038、0.32μM；SPS113、0.4μM；CSRM060、0.6μM；CSSM057、0.4μM；CSSM033、0.6μM；CSSM029、0.2μM；CSSM022、0.2μM；CSSM043、0.4μM；UMN0929、0.4μM；TGLA126、0.4μM；ETH225、0.2μM；CSSM041、0.8μM；CSSM013、0.8μM；TGLA227、0.2μM；FJ232023、0.2μM；ILSTS030、0.6μM；FJ232022、0.6μM；CSSM032、0.6μM。
4.根据权利要求1所述的水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述特异性引物分为四组：CSSM019、BM2113、CSSM047、CSSM038、SPS113、CSRM060为第一组，CSSM057、CSSM033、CSSM029、CSSM022、CSSM043、UMN0929为第二组，TGLA126、ETH225、CSSM041、CSSM013为第三组，TGLA227、FJ232023、ILSTS030、FJ232022、CSSM032为第四组；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
5.根据权利要求4所述的水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为：6-FAM、HEX、TAMRA、ROX中任意一种，且每组采用的荧光标记不同。
6.根据权利要求1所述的水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性复合扩增引物、反应混合液、21个基因座位点的等位基因、热启动Taq酶、DNA标准品、sdH2O和荧光分子量内标；其中反应混合液的组成为：MgCl2 7.5mM,Tris-HCl 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7.5mM，BSA2g/L。
7.根据权利要求1所述的水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括分子内标，且分子内标由橙色荧光SIZ标记。
8.权利要求1-7任一所述水牛21个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒在水牛亲权鉴定或个体识别中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，水牛亲权鉴定或个体识别中采用的样品来源包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机抽提法提取的水牛基因组DNA。
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2020
- 2020-12-07 CN CN202011429669.4A patent/CN112342304B/zh active Active
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Also Published As
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|---|---|
| CN112342304B (zh) | 2023-10-13 |
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