CN112334582A

CN112334582A - 蛋白质的制造方法

Info

Publication number: CN112334582A
Application number: CN201980042391.4A
Authority: CN
Inventors: 柴田望; 新井俊阳
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2018-07-04
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2021-02-05
Also published as: PH12021550012A1; CN112313341B; US11155797B2; PH12021550013A1; JP7398371B2; JPWO2020008988A1; CN112313341A; JPWO2020008987A1; EP3819383A1; EP3819383A4; WO2020008988A1; US20210254117A1; EP3819384A1; EP3819384A4; US20210261933A1; JP7360386B2; WO2020008987A1

Abstract

本发明提供一种用于廉价且有效地以微生物学的方式制造蛋白质的方法。一种蛋白质的制造方法，其包括：在糖基胺的存在下培养微生物的步骤。

Description

蛋白质的制造方法

技术领域

本发明涉及一种使用微生物的蛋白质的制造方法。

背景技术

由于丝状菌生产多种纤维素酶和木聚糖酶，因此，作为植物性多糖的分解菌备受关注。其中，木霉(Trichoderma)可以同时且大量地生产纤维素酶和木聚糖酶，因此，作为用于制造纤维素酶系生物质分解酶的微生物被进行研究。

在微生物的培养中，目前，通用葡萄糖作为碳源。但是，在葡萄糖存在下，通过被称为分解代谢物阻遏的控制机理，产生微生物的物质生产率的降低或饱和。报道有广域控制型转录因子CreA、或CreB、CreC、CreD等参与曲霉(Aspergillus)属等丝状菌的分解代谢物阻遏(专利文献1)。有可能可以通过这些转录因子的控制而调节曲霉的分解代谢物阻遏，但还尚未得到充分的成果。关于木霉，也正在进行分解代谢物阻遏的机理分析(专利文献2、非专利文献1)。但是，木霉的分解代谢物阻遏的机理还有很多不清楚的地方，没有达到避免阻遏。

另外，在利用微生物的酶等蛋白质的生产中，除碳源之外，有时需要诱导物质。例如，米曲霉的α淀粉酶基因的表达由淀粉或麦芽糖等诱导。另外，木霉的主要的纤维素酶基因cbh1、cbh2、egl1和egl2的表达受纤维素、纤维二糖等诱导(非专利文献2)。淀粉或麦芽糖、纤维素、纤维二糖另外也可以作为培养的碳源使用。在使用微生物的纤维素酶生产中，通常使用阿维散(Avicel)等微晶性纤维素。

在专利文献3中，公开有代替纯粹的纤维素而将木质纤维素用作诱导物质的利用微生物的纤维素酶的制造方法。在专利文献3中，在含有纤维素系材料的培养基中，一边分别流加作为碳源的葡萄糖和作为pH调节剂的磷酸或氨水，一边对木霉进行培养，生产纤维素酶。在非专利文献3中公开有：一边在培养基中反复或持续地流加糖类，一边使棒状杆菌制造氨基酸。在专利文献4和非专利文献4中公开有：在培养物中流加葡萄糖和氨的混合溶液，通过一边控制pH值，一边加入碳源和氮源而发酵生产赖氨酸，通过该方法，赖氨酸的生产率增加。

糖基胺为C-1位的羟基被氨基取代的单糖衍生物，许多情况下，作为各种糖衍生物的中间体被合成并被利用。报道有β-D-糖基胺作为β-糖苷酶的抑制剂起作用(非专利文献5)。在非专利文献6中记载有β-D-糖基胺通过葡萄糖和氨的反应而生成。在非专利文献7中记载有：含有β-D-吡喃葡萄糖胺的各种D-葡萄糖衍生物可以作为用于白色假丝酵母(Candida albicans)的菌丝生长的碳源利用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2015-39349号公报

专利文献2：日本特表平11-512930号公报

专利文献3：美国专利公开公报第2008/0199908号

专利文献4：中国专利授权公报第101967501号

非专利文献

非专利文献1：Appl.Environ.Microbiol.,63:1298-1306(1997)

非专利文献2：Curr.Genomics,14:230-249(2013)

非专利文献3：Journal of Biotechnology,104:155-172(2003)

非专利文献4：The Chinese Journal of Process Engineering,11(3):492-496(2011)

非专利文献5：Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.,48:319-384(1990)

非专利文献6：日本农艺化学会志，36:305-310(1962)

非专利文献7：Journal of Basic Microbiology,23(5):303-312(1983)

发明内容

本发明提供一种蛋白质的制造方法，其包括：在糖基胺的存在下培养微生物的步骤。

附图说明

图1是培养物的相对蛋白质生产量。值表示将比较例1的培养第3天的蛋白质生产量设为100％时的培养日第2天、第3天或第4天的相对值。

图2是培养物的相对蛋白质生产量。值表示将比较例1的培养第3天的蛋白质生产量设为100％时的相对值。

具体实施方式

本说明书中所引用的全部专利文献、非专利文献和其它出版物，其整体在本说明书中作为参考被引用。

本说明书中，与基因有关的“上游”和“下游”是指该基因的转录方向的上游和下游。例如，“配置于启动子的下游的基因”是指在DNA有义链中在启动子的3’侧存在该基因，基因的上游是指DNA有义链中的该基因的5’侧的区域。

本说明书中，启动子和基因的“可操作的连结”是指：以该启动子可诱导该基因转录的方式进行连结。启动子和基因的“可操作的连结”的步骤是本领域技术人员众所周知的。

本说明书中，“启动子活性”是指促进位于其下游的基因的表达的活性，更详细而言，是指促进从位于下游的基因的DNA向mRNA的转录的活性。

本说明书中，对细胞的功能或性状、形态使用的用语“本来”是用于表示该功能或性状、形态在该细胞中原来存在。对照而言，用语“外来”是用于表示并不是在该细胞中原来存在，而是从外部导入的功能或性状、形态。例如，“外来”基因或多核苷酸是指从外部导入细胞的基因或多核苷酸。外来基因或多核苷酸可以源自与导入其的细胞同种的生物，也可以源自不同种的生物(即不同种基因或多核苷酸)。

本说明书中，与氨基酸序列或核苷酸序列有关的“至少90％的同一性”是指：90％以上、优选95％以上、更优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步更优选98％以上、另外优选99％以上的同一性。

本说明书中，核苷酸序列和氨基酸序列的同一性利用Lipman-Pearson法(Science，1985，227：1435-1441)进行计算。具体而言，使用遗传信息处理软件Genetyx-Win的同源性分析(Search homology)程序，通过将Unit size to compare(ktup)设为2进行分析来算出。

要求开发用于利用微生物的廉价且有效的制造酶等蛋白质的培养技术。通过将葡萄糖反复或连续地流加于培养物的流加培养，抑止分解代谢物阻遏，存在微生物的蛋白质生产率提高的可能性。但是，葡萄糖少时，蛋白质合成过程不充分进行，另一方面，大量的葡萄糖的流加会引起分解代谢物阻遏，因此，在利用葡萄糖流加培养的蛋白质生产中，要求培养物中的葡萄糖浓度的精密控制。

本发明的发明人发现：通过在糖基胺的存在下培养微生物，利用微生物的酶等蛋白质生产率提高。

根据本发明，能够用简单的步骤使利用微生物的蛋白质的生产率提高。

本发明的蛋白质的制造方法包括：在糖基胺的存在下培养微生物的步骤。作为本发明中所使用的糖基胺，可以列举β-D-吡喃葡萄糖胺(CAS No.7284-37-9)、β-D-吡喃甘露糖胺(CAS No.7388-99-0)、β-D-吡喃半乳糖胺(CAS No.74867-91-7)等，可以使用它们的任一种或将2种以上组合使用。优选本发明中所使用的糖基胺为β-D-吡喃葡萄糖胺，其为β-D-葡萄糖的C-1位的羟基被氨基取代后的化合物。糖基胺被市售，或者也可以参考J.Org.Chem，1958，23(9)：1309-1319中所记载的步骤来制造。

在本发明的方法的一个实施方式中，用含有糖基胺的培养基培养微生物。在一例中，在培养的初始培养基中添加糖基胺，使用该培养基培养微生物。向初始培养基的糖基胺的添加量在每1L初始培养基中优选为50g以下，更优选为30g以下，进一步优选为0.5～20g，进一步优选为1～10g。在其它的一例中，将糖基胺流加于微生物的培养物。相对于该培养物的糖基胺的流加量在每1L初始培养基中优选为5g/hr以下，更优选为4g/hr以下，进一步优选为0.005～4g/hr，进一步优选为0.01～3g/hr。或者，也可以组合上述的向初始培养基的糖基胺的添加和向混合物的糖基胺的流加。此时，优选以培养物中的糖基胺的含量在每1L该培养物中优选成为0.5～50g、更优选成为0.5～20g、进一步优选成为1～10g的方式，调整向初始培养基的糖基胺的添加量和糖基胺的流加量。流加可以为间断的，另外也可以改变流加速度。流加的条件在考虑蛋白质的生产率的基础上来设定。

在本发明的方法中，将糖基胺流加于微生物的培养物时，优选含有糖基胺的水溶液被流加于该培养物。该水溶液中的糖基胺的含量优选为2～90质量％，更优选为2～50质量％。该水溶液中的糖基胺的量过少时，就会向混合物流加大量的水溶液，因此，对培养设备造成负担。另一方面，水溶液中的糖基胺的量过多时，向混合物的水溶液的流加量的控制变得困难。

该含有糖基胺的水溶液可以为在水中直接添加糖基胺并使其溶解得到的水溶液，或者也可以为葡萄糖和氨的混合物(含有通过葡萄糖和氨的反应而生成的糖基胺，参照非专利文献6)。因此，作为一个实施方式，本发明的方法可包括：一边流加葡萄糖和氨的混合物，一边培养微生物的步骤。该葡萄糖和氨的混合物为通过将葡萄糖和氨进行混合而制备的液体状的混合物。例如，该混合物为葡萄糖、氨以及它们的溶剂(例如水)的混合物。优选该混合物为通过葡萄糖或其水溶液与氨、其盐或它们的水溶液、以及根据需要的水进行混合而制备的混合物。更优选该混合物为将葡萄糖和氨水溶液以及根据需要的水进行混合而得到的混合物。在制备该葡萄糖和氨的混合物时，将葡萄糖和氨以质量比优选0.5～10：1、更优选2～8：1的比例进行混合即可。葡萄糖的比率过高时，细胞从酶生产状态转变为增殖状态，有酶生产率降低的倾向，另一方面，葡萄糖的比率过低时，碳源变得不足，结果，不能期望酶生产率的提高。另外，在制备该葡萄糖和氨的混合物时，将葡萄糖的添加量调整为得到的混合物每100mL优选为2～90g、更优选为5～80g即可。向混合物的葡萄糖的添加量过少时，为了实现上述的糖基胺的流加量，就会向混合物流加大量的混合物，因此，对培养设备造成负担。另一方面，向混合物的葡萄糖的添加量过多时，向培养物的混合物的流加量的控制变得困难。例如，该混合物可以通过以能够实现上述的葡萄糖：氨比、和/或葡萄糖添加量的方式将适当量的葡萄糖和氨水溶液进行混合而制备，或者，也可以通过将任意量的葡萄糖和氨水溶液进行混合之后，将得到的水溶液以能够实现上述的葡萄糖：氨比、和/或葡萄糖添加量的方式用适当水稀释而制备。

将该葡萄糖和氨的混合物流加于微生物的培养物的情况下，该混合物相对于该培养物的流加量只要是能够实现上述的糖基胺的流加量的范围的量即可，例如，每1L初始培养基(不含有所流加的该混合物的培养基)，换算为添加于该混合物的葡萄糖的量，优选为8g/hr以下，更优选为6g/hr以下，进一步优选为0.05～8g/hr，进一步优选为0.1～6g/hr。葡萄糖的流加量多时，有时会引起分解代谢物阻遏。另一方面，该混合物(整体)相对于该培养物的流加量根据其葡萄糖或氨的含量、或后述的培养物的pH等适当调整即可，没有特别限定。从经济性的观点考虑，将每1L初始培养基的该混合物(整体)的流加量调整为0.1～10g/hr左右、优选0.3～8g/hr左右即可。

优选通过该葡萄糖和氨的混合物的流加，调整培养物的pH。此时，该混合物的流加的量和时间依赖于流加该混合物的培养物的pH。优选用通常的步骤制备规定的pH的初始培养基，接着，以流加后的培养物维持该规定的pH值的方式一边流加该葡萄糖和氨的混合物，一边将该培养物进行培养。优选在培养中的培养物的pH的调整中仅使用该葡萄糖和氨的混合物，但也可以并用其它pH调节剂。培养物的pH的测定和基于pH值的流加量的控制可以使用市售的发酵罐(jar fermenter)等来进行。培养物的pH可以根据微生物的种类、或制造的蛋白质的种类而设定为适当的值。例如微生物为丝状菌的情况下，培养物的pH维持在优选pH3～7、更优选pH3.5～6。培养物的pH通常可以用装设于发酵罐的电极进行测定。优选本发明中的培养物的pH是指：在培养温度28℃下，使用F-635Autoclavable pH Electrode(Broadley-James Corp)、或405-DPAS-SC-K8S pH传感器(METTLER TOLEDO)的pH传感器而测定的值。

从糖基胺的稳定性的观点考虑，含有该糖基胺的水溶液的pH在25℃时优选为碱性，更优选为pH8以上，进一步优选为pH9以上，进一步优选为pH10以上，而且，优选为pH13以下。含有该糖基胺的水溶液为上述葡萄糖和氨的混合物的情况下，该葡萄糖和氨的混合物的pH在25℃时优选为碱性，更优选为pH8以上，进一步优选为pH9以上，进一步优选为pH10以上，而且，优选为pH13以下。优选根据需要使用碱剂(氨等)等的pH调节剂，将含有该糖基胺的水溶液的pH调整为上述的范围。含有该糖基胺的水溶液的pH可以使用一般的pH计进行测定。例如，使用在pH计(HORIBALtd.制pH/离子计F-52等)上连接有pH测定用复合电极(HORIBALtd.制玻璃滑动套筒型等)的pH计。作为pH电极内部液，使用饱和氯化钾水溶液(3.33mol/L)。测定在25℃下进行。

含有该糖基胺的水溶液可以进一步含有可通常添加于微生物的培养培养基的其它物质。作为该其它物质的例子，可以列举：有机盐、无机盐、pH调节剂、糖基胺以外的碳源或氮源、表面活性剂、消泡剂等。优选并用葡萄糖作为碳源，作为氮源，优选使用氨。氨也可以作为pH调节剂使用。选自葡萄糖和氨中的1种以上可以在初始培养基中含有一部分或全部，或者也可以进行流加。流加葡萄糖和氨的1种以上的情况下，含有其的水溶液的流加速度优选为糖基胺、葡萄糖和氨的合计的流加量不超过上述糖基胺的流加量的速度。另外，初始培养基和培养物中的葡萄糖、氨和糖基胺的合计量也优选不超过上述糖基胺在初始培养基和培养物中的含量。

上述的葡萄糖和氨的混合物也还可以进一步含有可通常添加于微生物的培养培养基的其它物质。作为该其它物质的例子，优选列举不损害该混合物的pH调节功能的物质例如有机盐、无机盐、其它pH调节剂、葡萄糖和氨以外的碳源或氮源、表面活性剂、消泡剂等。

在本发明的方法中，微生物的培养中所使用的初始培养基只要是该微生物的培养中通常所使用的培养基即可。例如，该初始培养基可以含有碳源、氮源、镁盐、锌盐等金属盐、硫酸盐、磷酸盐、pH调节剂、表面活性剂、消泡剂等的微生物的培养基中通常所含有的各种成分。培养基中的成分组成可适当选择。该初始培养基可以为合成培养基、天然培养基、半合成培养基的任一种，或者也可以为市售的培养基。该初始培养基优选为液体培养基。

优选本发明的方法中的微生物的培养在编码目标蛋白质的基因的表达的诱导物质的存在下进行。由此，能够进一步提高目标蛋白质的生产率。更详细而言，该微生物的培养物只要含有该诱导物质即可。例如，该诱导物质可以在初始培养基中含有，也可以流加于培养物，或者还可以为这两者。作为该诱导物质的优选的例子，可以列举纤维素和纤维二糖，可以使用它们的任一者或两者。培养物中的纤维素或纤维二糖不仅作为诱导物质起作用，而且可作为碳源被消耗。该培养物中的纤维素或纤维二糖的浓度作为纤维素和纤维二糖的合计浓度，优选为1～15质量/容量％。例如，将纤维素或纤维二糖添加于初始培养基的情况下，该初始培养基中的纤维素或纤维二糖的浓度作为纤维素和纤维二糖的合计浓度，优选为1～15质量/容量％。已知木霉等丝状菌的纤维素酶基因的表达由纤维素、纤维二糖等诱导，通过葡萄糖而受到分解代谢物阻遏(专利文献2、非专利文献1～2)。因此，使用该诱导物质的本发明的方法可以优选用于使用丝状菌的纤维素酶的制造。

或者，通过将编码目标蛋白质的基因连结于丝状菌所具有的编码纤维素酶的基因的启动子(所谓的丝状菌纤维素酶基因启动子)那样的、纤维素或纤维二糖所诱导的启动子，就能够由纤维素或纤维二糖诱导目标蛋白质的基因的表达。因此，在本发明的方法的优选的实施方式中，该微生物的培养在选自纤维素和纤维二糖中的至少1种的存在下进行，且该微生物含有纤维素或纤维二糖所诱导的启动子，在该启动子的下游，可操作地连结有编码目标蛋白质的基因。

作为该纤维素或纤维二糖所诱导的启动子的例子，可以列举丝状菌纤维素酶基因或木聚糖酶基因的启动子等。作为丝状菌纤维素酶基因的启动子的例子，可以列举木霉属菌的纤维素酶基因的启动子，作为优选的例子，可以列举由序列号1或2的核苷酸序列构成的里氏木霉的纤维素酶基因的启动子。作为丝状菌木聚糖酶基因的启动子的例子，可以列举木霉属菌的木聚糖酶基因的启动子，作为优选的例子，可以列举由序列号3的核苷酸序列构成的里氏木霉的木聚糖酶基因的启动子。作为该纤维素或纤维二糖所诱导的启动子的进一步实例，可以列举由与序列号1～3的任一个核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且具有纤维素或纤维二糖所诱导的启动子活性的多核苷酸。

该启动子可以为用本发明的方法培养的微生物本来具有的启动子，或者也可以为导入于该微生物的外来的启动子。这些启动子和编码目标蛋白质的基因的连结可以通过内切酶法、同源重组法等公知的步骤而进行。例如，将具有含有编码目标蛋白质的基因的多核苷酸的载体或DNA片段导入于微生物细胞，在基因组内的标靶启动子的下游插入该多核苷酸，由此，该启动子和编码目标蛋白质的基因在基因组上可操作地连结。或者，也可以构建具有启动子序列和连结于其下游的含有编码目标蛋白质的基因的多核苷酸的载体或DNA片段，将该载体或片段导入于微生物细胞。根据需要，该载体或DNA片段还可以具有抗生物质耐性基因、营养需求性相关基因等选择标记物。

该载体可以为质粒等能够在染色体外自我增殖和复制的载体，或者也可以为插入于染色体内的载体。优选的载体的种类依赖于导入其的微生物的种类。例如，作为丝状菌用的载体的优选的例子，可以列举含有在曲霉属微生物中作为自我复制因子起作用的AMA1的质粒等，但并不限定于这些。

为了向微生物导入载体或DNA片段，可以使用一般的转化法、例如电穿孔法、转化法、转染法、接合法、原生质体法、粒子枪法、农杆菌介导法等。

导入有目标载体或DNA片段的微生物可以利用选择标记物来选择。例如，选择标记物为抗生物质耐性基因的情况下，能够通过在添加了该抗生物质的培养基中培养微生物，选择导入有目标载体或DNA片段的微生物。另外，例如选择标记物为氨基酸合成相关基因、碱基合成相关基因等营养需求性相关基因的情况下，在该营养需求性的宿主中进行基因导入之后，可以以该营养需求性的有无为指标，选择导入有目标载体或DNA片段的微生物。或者，也可以通过利用PCR等调查微生物的DNA序列而确认目标载体或DNA片段的导入。

连结于该启动子的编码目标蛋白质的基因可以与分泌信号肽进行连结。通过与分泌信号肽的连结，表达的目标蛋白质被分泌到细胞外，因此，可以不破坏微生物细胞，而从培养上清液中将目标蛋白质进行分离。作为分泌信号肽的例子，可以列举：里氏木霉的纤维二糖水解酶1、米曲霉的α淀粉酶、米根霉的葡萄糖淀粉酶、或酿酒酵母的源自α因子的信号肽等。

作为通过本发明的方法所制造的目标蛋白质的例子，可以列举：氧化还原酶(Oxidoreductase)、转移酶(Transferase)、水解酶(Hydrolase)、裂解酶(Lyase)、异构酶(Isomerase)、合成酶(Ligase或Synthetase)、糖酵解系的酶、乳酸合成酶(LDH等)、TCA循环的酶等。该目标蛋白质可以为用本发明的方法培养的微生物本来具有的蛋白质，也可以为外来的蛋白质。作为目标蛋白质的优选的例子，可以列举与生物质分解或生物质糖化相关的酶。作为与生物质分解或生物质糖化相关的酶的例子，可以列举：纤维素酶(例如β-内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶等)、半纤维素酶(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、阿魏酸酯酶等)、木聚糖酶等，其中，优选纤维素酶。与该生物质分解或生物质糖化相关的酶为优选源自丝状菌，更优选源自木霉属菌的酶。

作为用本发明的方法培养的微生物的例子，可以列举细菌、酵母、丝状菌等，其中，优选丝状菌。作为丝状菌，可以列举例如：枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、巨座壳属(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix属)、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、毛平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳菌属(Pleurotus)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、草根霉菌属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)的丝状菌，其中，优选枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毁丝霉属(Myceliophthora)、链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、草根霉菌属(Thielavia)和木霉属(Trichoderma)，更优选木霉属。作为木霉属菌，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)及其变异株。作为里氏木霉及其变异株的例子，可以列举里氏木霉QM9414株及其变异株。

本发明的方法中的用于微生物的培养的各种条件与该微生物的种类、或培养的规模等相符，可以按照常规方法适当设定。例如微生物为丝状菌的情况下，培养物的pH维持在优选pH3～7、更优选pH3.5～6。培养物的pH的测定方法如上所述。

接着，从培养物中回收目标蛋白质。蛋白质被分泌于培养上清液中的情况下，可以从培养上清液中回收蛋白质。蛋白质在细胞中含有的情况下，将细胞破坏，取出含有蛋白质的组分，用于蛋白质的回收。蛋白质的回收可以通过该领域中通常所使用的方法、例如倾析法、膜分离、离心分离、电透析法、离子交换树脂的利用、蒸馏、盐析等、或它们的组合而进行。也可以将回收的目标蛋白质进一步进行分离或纯化。

目标蛋白质被分泌于培养上清液中的情况下，本发明中蛋白质的制造中所使用的微生物可以重复使用。即，回收与培养上清液分离的微生物细胞，将其再次如上所述那样在糖基胺的存在下进行培养，由此能够再次制造目标蛋白质。

本发明的蛋白质的制造方法可以为交替进行微生物的培养与积累于培养物中的蛋白质的回收和培养基的更换的间歇式方法，或者也可以为一边间断或连续地更换一部分微生物和培养基、一边同时进行微生物的培养和蛋白质的回收而进行的半间歇式或连续的方法。

作为本发明的例示的实施方式，进一步在本说明书中公开以下的物质、制造方法、用途、方法等。但是，本发明并不限定于这些实施方式。

[1]一种蛋白质的制造方法，其包括：在糖基胺的存在下培养微生物的步骤。

[2]根据[1]所述的制造方法，其中，优选上述微生物的培养在选自纤维素和纤维二糖中的至少1种的存在下进行。

[3]根据[2]所述的制造方法，其中，优选上述微生物含有纤维素诱导型启动子或纤维二糖诱导型启动子，

该启动子优选为丝状菌纤维素酶基因启动子或丝状菌木聚糖酶基因的启动子，

更优选为木霉属菌的纤维素酶基因启动子或木霉属菌的木聚糖酶基因的启动子。

[4]根据[3]所述的制造方法，其中，优选在上述启动子的下游连结有编码上述蛋白质的基因。

[5]根据[4]所述的制造方法，优选上述启动子为丝状菌纤维素酶基因启动子，上述蛋白质为酶。

[6]根据[4]或[5]所述的制造方法，其中，上述蛋白质优选为酶，优选为与生物质分解或生物质糖化相关的酶，更优选为纤维素酶，

与该生物质分解或生物质糖化相关的酶优选为源自丝状菌的酶，更优选为源自木霉属菌的酶，进一步优选为源自丝状菌的纤维素酶，进一步优选为源自木霉属菌的纤维素酶。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的制造方法，其中，优选上述糖基胺被添加于初始培养基。

[8]根据[7]所述的制造方法，其中，上述糖基胺的添加量在每1L初始培养基中优选为50g以下，更优选为30g以下，进一步优选为0.5～50g，进一步优选为0.5～30g，进一步优选为0.5～20g，进一步优选为1～10g。

[9]根据[1]～[8]中任一项所述的制造方法，其中，优选上述糖基胺被流加于培养物。

[10]根据[9]所述的制造方法，其中，上述糖基胺的流加量在每1L初始培养基中优选为5g/hr以下，更优选为4g/hr以下，进一步优选为0.005～4g/hr，进一步优选为0.01～3g/hr。

[11]根据[1]～[10]中任一项所述的制造方法，其中，优选上述糖基胺被添加于初始培养基，且流加于培养物，该培养物中的糖基胺的含量在每1L该培养物中优选为0.5～50g，更优选为0.5～20g，进一步优选为1～10g。

[12]根据[9]～[11]中任一项所述的制造方法，其中，优选流加含有上述糖基胺的水溶液，该水溶液中的糖基胺的含量优选为2～90质量％，更优选为2～50质量％。

[13]根据[12]所述的制造方法，其优选包括：一边流加葡萄糖和氨的混合物，一边培养微生物的步骤。

[14]根据[13]所述的制造方法，其中，将上述混合物换算为添加于该混合物的葡萄糖的量，以每1L初始培养基，优选8g/hr以下、更优选6g/hr以下、进一步优选0.05～8g/hr、进一步优选0.1～6g/hr的速度流加上述混合物。

[15]根据[13]或[14]所述的制造方法，其中，通过上述混合物的流加，将培养物的pH调整为优选pH3～7、更优选pH3.5～6。

[16]根据[13]～[15]中任一项所述的制造方法，其中，上述混合物为以质量比优选0.5～10：1、更优选2～8：1含有葡萄糖和氨的混合物。

[17]根据[13]～[16]中任一项所述的制造方法，其中，优选上述混合物每100mL含有2～90g的葡萄糖。

[18]根据[12]～[17]中任一项所述的制造方法，其中，含有上述糖基胺的水溶液或上述葡萄糖和氨的混合物的pH在25℃时优选为碱性，更优选为pH8以上，进一步优选为pH9以上，进一步优选为pH10以上，且优选为pH13以下。

[19]根据[1]～[18]中任一项所述的制造方法，其中，上述糖基胺优选为选自β-D-吡喃葡萄糖胺、β-D-吡喃甘露糖胺和β-D-吡喃半乳糖胺中的至少1种，更优选为β-D-吡喃葡萄糖胺。

[20]根据[1]～[19]中任一项所述的制造方法，其中，在上述培养中，将培养物的pH调整为优选pH3～7、更优选pH3.5～6。

[21]根据[1]～[20]中任一项所述的制造方法，其中，上述微生物为丝状菌。

[22]根据[21]所述的制造方法，其中，上述丝状菌为木霉属菌。

[23]根据[22]所述的制造方法，其中，上述木霉属菌为里氏木霉。

[24]根据[2]～[23]中任一项所述的制造方法，其中，优选上述微生物为丝状菌，上述蛋白质优选为与生物质分解或生物质糖化相关的酶，更优选为纤维素酶。

[25]根据[24]所述的制造方法，其中，优选上述丝状菌为木霉属菌。

[26]根据[25]所述的制造方法，其中，上述木霉属菌为里氏木霉。

[27]根据[2]～[26]中任一项所述的制造方法，其中，优选上述培养物中的纤维素或纤维二糖的浓度作为纤维素和纤维二糖的合计浓度为1～15质量/容量％。

[28]根据[1]～[27]中任一项所述的制造方法，其优选还包括：从上述微生物的培养物中回收蛋白质的步骤。

实施例

以下，基于实施例，进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于实施例。需要说明的是，在以下的实施例中，只要没有特殊说明，“％”是指“w/v％”。培养物的pH使用装设于发酵罐的F-635Autoclavable pH Electrode(Broadley-James Corp)或405-DPAS-SC-K8S pH传感器(METTLER TOLEDO)的pH传感器进行测定。

参考例1β-D-吡喃葡萄糖胺的合成

在200mL的甲醇中加入80g的D-葡萄糖和2g的氯化铵，鼓入氨气直至在13℃下溶解。溶解后，通过在4℃下静置得到晶体。通过过滤而回收所得到的晶体后，用甲醇清洗后，进行干燥，得到β-D-吡喃葡萄糖胺。将得到的β-D-吡喃葡萄糖胺用于以下的实施例。

比较例1

通过将里氏木霉X3AB1株(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，2012，174：1-9；以下，称为X3AB1株)在含纤维素的培养基中进行培养，生产含有纤维素酶的蛋白质。作为前培养，在500mL烧瓶中加入培养基50mL，以成为1×10⁵个/mL的方式植菌X3AB1株的孢子，在28℃、220rpm(PRECI公司、PRXYg-98R)下进行振荡培养。培养基组成如下所述：1％葡萄糖、0.14％(NH₄)₂SO₄、0.2％KH₂PO₄、0.03％CaCl₂·2H₂O、0.03％MgSO₄·7H₂O、0.1％细菌蛋白胨(BactoPeptone)(BD Difco)、0.05％Bacto酵母提取物(Yeast extract)(BD Difco)、0.1％Tween80、0.1％微量元素(Trace element)、50mM酒石酸缓冲液(pH4.0)。微量元素的组成如下所述：将6mg H₃BO₃、26mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、100mg FeCl₃·6H₂O、40mg CuSO₄·5H₂O、8mgMnCl₂·4H₂O、200mg ZnCl₂用蒸馏水定容至100mL。

2天的前培养后，进行主培养。主培养的初始培养基含有粉末纤维素(KC FlockW100；日本制纸)10％、和以下的其它培养基成分：0.42％(NH₄)₂SO₄、0.2％KH₂PO₄、0.03％CaCl₂·2H₂O、0.03％MgSO₄·7H₂O、0.1％细菌蛋白胨、0.05％Bacto酵母提取物、0.1％Tween80、0.1％微量元素、0.2％消泡剂PE-L。在含有该培养基500mL的1L容积发酵罐BMZ-01KP2(Biott)中接种10％(v/v％)前培养液培养4天。发酵罐的设定如下所述：温度28℃、通气量0.5vvm、pH：4.5±0.1、搅拌数以保持DO＝3.0ppm的方式变动。培养中，通过流加10％氨水溶液而将培养液的pH维持在上述规定的范围。在培养第2天、第3天、第4天时，对培养液进行取样。

实施例1

除了在主培养的初始培养基中添加β-D-吡喃葡萄糖胺0.5％之外，用与比较例1同样的步骤进行微生物的培养，对培养液进行取样。

实施例2

主培养的培养中，将β-D-吡喃葡萄糖胺的8％水溶液在表1所示的条件下流加于培养基(培养基每单位加料量，流加总计0.2％的β-D-吡喃葡萄糖胺)，除此之外，用与比较例1同样的步骤进行微生物的培养，对培养液进行取样。

[表1]

试验1蛋白质生产量

将比较例1和实施例1-2中得到的培养液进行离心分离，接着，用膜滤器25CS020AN(Advantech)将菌体和上清液进行分离。用Bradford法测定上清液的蛋白质的浓度。使用基于Bradford法的QuickStart蛋白质分析(BioRad)，根据将牛γ球蛋白作为标准蛋白质的标准曲线，计算上清液的蛋白质浓度，作为蛋白质生产量。图1中示出将比较例1的培养第3天的蛋白质生产量设为100％时的比较例1以及实施例1-2的培养第2天、第3天和第4天的相对蛋白质生产量。在实施例1中，在培养第3天显示最大生产率，在实施例2中，在培养第4天显示最大生产率，在任一个实施例中，与比较例1相比，都显示高20％以上的生产率。由以上可知：通过将糖基胺用作培养基原料，不论是在预添加于培养基成分的情况下，还是在培养中流加的情况下，蛋白质生产量均大大提高。

比较例2

主培养的培养中，将40％葡萄糖水溶液在表2所示的条件下流加于培养物，除此之外，用与比较例1同样的步骤进行微生物的培养，对培养液进行取样。

实施例3

主培养的培养中，将38％葡萄糖/2％β-D-吡喃葡萄糖胺水溶液在表2所示的条件下流加于培养物，除此之外，用与比较例1同样的步骤进行微生物的培养，对培养液进行取样。

实施例4

主培养的培养中，将35％葡萄糖/5％β-D-吡喃葡萄糖胺水溶液在表2所示的条件下流加于培养物，除此之外，用与比较例1同样的步骤进行微生物的培养，对培养液进行取样。

[表2]

比较例3

主培养的培养中，将40％葡萄糖水溶液在表3所示的条件下流加于培养物，除此之外，用与比较例1同样的步骤进行微生物的培养，对培养液进行取样。

实施例5

主培养的培养中，将38％葡萄糖/2％β-D-吡喃葡萄糖胺水溶液在表3所示的条件下流加于培养物，除此之外，用与比较例1同样的步骤进行微生物的培养，对培养液进行取样。

实施例6

主培养的培养中，将35％葡萄糖/5％β-D-吡喃葡萄糖胺水溶液在表3所示的条件下流加于培养物，除此之外，用与比较例1同样的步骤进行微生物的培养，对培养液进行取样。

[表3]

试验2蛋白质生产量

对比较例2-3和实施例3-6中得到的培养液，与试验1同样地测定蛋白质生产量。图2中示出将比较例1的培养第3天的蛋白质生产量设为100％时的比较例2-3以及实施例3-6中的最大生产时的相对蛋白质生产量。确认到了以下趋势：蛋白质生产率随着培养物中的β-D-吡喃葡萄糖胺添加量升高而提高。另外，将流加液的流加开始的时间和流加速度不同的比较例2、实施例3-4和比较例3、实施例5-6进行比较时，确认到了：从一开始就一点一点地少量开始流加的情况显示更高的生产率的趋势。由以上可知：糖基胺向培养物的添加即使在与葡萄糖等其它碳源一起添加的情况下，也会使蛋白质生产率提高。

序列表

<110> 花王株式会社

<120> 蛋白质的制造方法

<130> KS1629

<150> JP 2018-127519

<151> 2018-07-04

<150> JP 2018-211690

<151> 2018-11-09

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1640

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<220>

<223> cbh1 启动子

<400> 1

tgcaaagttt tgtttcggct acggtgaaga actggatact tgttgtgtct tctgtgtatt 60

tttgtggcaa caagaggcca gagacaatct attcaaacac caagcttgct cttttgagct 120

acaagaacct gtggggtata tatctagagt tgtgaagtcg gtaatcccgc tgtatagtaa 180

tacgagtcgc atctaaatac tccgaagctg ctgcgaaccc ggagaatcga gatgtgctgg 240

aaagcttcta gcgagcggct aaattagcat gaaaggctat gagaaattct ggagacggct 300

tgttgaatca tggcgttcca ttcttcgaca agcaaagcgt tccgtcgcag tagcaggcac 360

tcattcccga aaaaactcgg agattcctaa gtagcgatgg aaccggaata atataatagg 420

caatacattg agttgcctcg acggttgcaa tgcaggggta ctgagcttgg acataactgt 480

tccgtacccc acctcttctc aacctttggc gtttccctga ttcagcgtac ccgtacaagt 540

cgtaatcact attaacccag actgaccgga cgtgttttgc ccttcatttg gagaaataat 600

gtcattgcga tgtgtaattt gcctgcttga ccgactgggg ctgttcgaag cccgaatgta 660

ggattgttat ccgaactctg ctcgtagagg catgttgtga atctgtgtcg ggcaggacac 720

gcctcgaagg ttcacggcaa gggaaaccac cgatagcagt gtctagtagc aacctgtaaa 780

gccgcaatgc agcatcactg gaaaatacaa accaatggct aaaagtacat aagttaatgc 840

ctaaagaagt catataccag cggctaataa ttgtacaatc aagtggctaa acgtaccgta 900

atttgccaac ggcttgtggg gttgcagaag caacggcaaa gccccacttc cccacgtttg 960

tttcttcact cagtccaatc tcagctggtg atcccccaat tgggtcgctt gtttgttccg 1020

gtgaagtgaa agaagacaga ggtaagaatg tctgactcgg agcgttttgc atacaaccaa 1080

gggcagtgat ggaagacagt gaaatgttga cattcaagga gtatttagcc agggatgctt 1140

gagtgtatcg tgtaaggagg tttgtctgcc gatacgacga atactgtata gtcacttctg 1200

atgaagtggt ccatattgaa atgtaagtcg gcactgaaca ggcaaaagat tgagttgaaa 1260

ctgcctaaga tctcgggccc tcgggccttc ggcctttggg tgtacatgtt tgtgctccgg 1320

gcaaatgcaa agtgtggtag gatcgaacac actgctgcct ttaccaagca gctgagggta 1380

tgtgataggc aaatgttcag gggccactgc atggtttcga atagaaagag aagcttagcc 1440

aagaacaata gccgataaag atagcctcat taaacggaat gagctagtag gcaaagtcag 1500

cgaatgtgta tatataaagg ttcgaggtcc gtgcctccct catgctctcc ccatctactc 1560

atcaactcag atcctccagg agacttgtac accatctttt gaggcacaga aacccaatag 1620

tcaaccgcgg actgcgcatc 1640

<210> 2

<211> 1477

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<220>

<223> egl1 启动子

<400> 2

tttcagcaat gcgtggcgtt ggcaggcgac ttcgcggcag tgcatgagcg atattcgggg 60

tcgttgaagc cgacgttcac gccggagatt ggcatgatcc cagtgcttta catcatcggg 120

gccaaatgcc ggcatcctgt tgtgcggcgg gaggccttgg gtcttttgag gcggcaaccg 180

atccgggagg cggtttggga tagcgttgtt gttgccaggg tagtggagag gataatggag 240

attgaggagg ttgggtttga gaagtgggaa atgatacaga gtatggaaca ggttccggtg 300

tggcagaggg ttgagacgct gtcttgggca catgtcgtcg tcgatggaca gtctgcgggc 360

agagtggaca ttaactatac gttctgcgcg cgagagggat cgcatattga gtctttcatg 420

atgtaataag cttgggcttg acagcgttct attgccagtg tatcaacgaa gtggtatgta 480

ccatcgtgct ctgtccagac gttttggtca ggtcgacaaa caggcttttc ttcctattct 540

ctttctttga tatatacacg cttagaaatg tgtcaaaaag aacagaaacc tcttttgatg 600

tagttatgcg catgctagac tgctcctgtt tcatgtggtt acaacaaaca gtctgatcga 660

cttcgaatac ttggactgat gaaggttgta cagattgctg acagatgtcg taatgcagag 720

caaggctgta gattccataa aaccagttgc ttcgcctgct gtggctctgg agaaccaaag 780

agacgtgtct cgggagggta agtggtatcg aatctatgag agaagcccag tctaagagag 840

gaccatctcg ccaggggaag atgaagctgg ttacaactga tttgttttcc cgtctgccac 900

catggtatag agcctggacc aatcaggcta aatcattgta tacaataagc ctagagaaaa 960

cctgaaatct gtcctcgtcc tttgtccgtt gtctaattat ccgttatttt cgaacgatga 1020

tacagtatga gttttgccga aattttgcta aaggtactat cgacggggga cacaagggtt 1080

gagtctgtat aacggctcga aacagcagct ggtagcagga atccaggccc gcgtttcatt 1140

tggattcatt ttcccatatt ccccttgcag aaggatacga cagtagcatt ggaaaccgta 1200

aatgacggca aaaagcatgg ttctgctcag atactccaag ccaacctatc gggtcctgga 1260

ggctatttcc aacatctcat agcctaacag aaataacgga agtcggcatc tgtatcgctc 1320

aaactgacca gacgagcccg ccatatcgag gcagagttac tctgtgttgc aaatccaact 1380

tataaagaca acaaccgcaa actttgtctt gtcgccatca gattgttcgc caagcaccct 1440

cccccccccc tatcttagtc cttcttgttg tcccaaa 1477

<210> 3

<211> 1084

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<220>

<223> xyn3 启动子

<400> 3

gggaattccg tgattgacaa aatctattcg tatcaaacgt tcatgccgcc gtctccagtc 60

tcctcacgct atggtgcttg atatacataa gggggggacg ttgaatatat gttcccagtt 120

tacctccaca taagaaatat ctcctttgga cggtctctgc aattttgccc tcaagactct 180

gcagacaatc cctctgtgct ttaaaacccc cgagtatccc ggtcacctga tggcgcaagt 240

ctcaacttcc ccaggatgcc gtctcctcat ctccgtgatg gtaacaaccg catataaggg 300

acttttgtct tctttaggct tcggacgagg gggttctttc ccagatcaat gccttgaccg 360

aaactgtcaa gatggctata taggacactg tcaattttgc catttcagtc cgggtattta 420

gacttaaaag cacctagtat ttatggttaa taaatctccg ggcaaaggtc tctttccgtg 480

cgtgtctgat gggttatgct aagctcatct ccgcagacag ggtagtaaca gaggtagccg 540

ttccttggaa agacggttaa ttgacttctt gactttgact gtccaattcg catggctaat 600

tgcggcaaaa atgatgccat atggccccgt gggcacaact ttctcacaag tctctggtgt 660

cttgactgag gtcgatgttg tgctctttct tcccaactat acaagtctaa actcctcagt 720

aaatcgatac aaggtaaatt taaactctct ggttactctt cctaccaaaa ggccctggtt 780

acatttcgtg tatacccgag gcggctgaat ctgggggact cacataggtg gatgcaatgt 840

gctattagcc agctacgcat atacaatcaa acattgaaaa tcaaaggata tacaacaact 900

ttgacgattt tccataaatt ggcatcatct ttctgagtcc tgatggatgt cagacagcaa 960

gcggacaagc tggctcatga ctcaatcctc cgaatacatc gcatcatcta ggagccattc 1020

tcacctcgaa acttctacca tctttccact gagtttcaat tgaggcggac accatggaag 1080

cacc 1084

Claims

1.一种蛋白质的制造方法，其特征在于，包括：

在糖基胺的存在下培养微生物的步骤。

2.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于：

所述微生物的培养在选自纤维素和纤维二糖中的至少1种的存在下进行。

3.根据权利要求2所述的制造方法，其特征在于：

所述微生物含有纤维素诱导型启动子或纤维二糖诱导型启动子。

4.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于：

在所述启动子的下游连结有编码所述蛋白质的基因。

5.根据权利要求4所述的制造方法，其特征在于：

所述启动子为丝状菌纤维素酶基因启动子，所述蛋白质为酶。

6.根据权利要求5所述的制造方法，其特征在于：

所述蛋白质为纤维素酶。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其特征在于：

所述糖基胺被添加于初始培养基。

8.根据权利要求7所述的制造方法，其特征在于：

所述糖基胺的添加量在每1L初始培养基中为50g以下。

9.根据权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其特征在于：

所述糖基胺被流加于培养物。

10.根据权利要求9所述的制造方法，其特征在于：

所述糖基胺的流加量为每1L初始培养基5g/hr以下。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的制造方法，其特征在于：

所述糖基胺为β-D-吡喃葡萄糖胺。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的制造方法，其特征在于：

在所述培养中，将培养物的pH调整为3～7。

13.根据权利要求1～12中任一项所述的制造方法，其特征在于：

所述微生物为丝状菌。

14.根据权利要求13所述的制造方法，其特征在于：

所述丝状菌为木霉属菌。

15.根据权利要求14所述的制造方法，其特征在于：

所述木霉属菌为里氏木霉。

16.根据权利要求13～15中任一项所述的制造方法，其特征在于：

所述蛋白质为与生物质分解或生物质糖化相关的酶。

17.根据权利要求2～16中任一项所述的制造方法，其特征在于：

所述微生物的培养物中的纤维素或纤维二糖的合计浓度为1～15质量/容量％。

18.根据权利要求1～17中任一项所述的制造方法，其特征在于，还包括：

从所述微生物的培养物中回收蛋白质的步骤。