CN112326949A - 表面化学修饰方法、芯片制备方法及芯片 - Google Patents

表面化学修饰方法、芯片制备方法及芯片 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种制备芯片的方法。该方法包括：对固相基底进行表面修饰，表面修饰包括利用混合物对固相基底的表面进行处理，混合物包含1:1～1:1000摩尔比的环氧基团和亲水基团末端。该能够通过控制环氧基和亲水基团的比例，根据实际需求，方便地调节表面环氧基团和亲水基团的密度，从而达到探针承载量可调控；同时，通过在表面引入亲水性基团，能够调整表面疏水性，降低芯片表面非特异吸附，提高获得芯片的性能。

Description

表面化学修饰方法、芯片制备方法及芯片
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及芯片及其制备方法。
背景技术
近年来，主要发达国家包括美国，英国，法国等都陆续将基因技术作为国家战略，基因检测技术的发展引人关注。
利用芯片进行核酸检测，包括利用芯片进行目标核酸捕获、在芯片上进行核酸序列测定等，芯片的性能，包括表面亲/疏水特性、非特异性吸附核酸性能、探针/引物的量、探针/引物固定密度等，对检测或测定结果起到关键作用。
芯片仍有待进一步开发或改进，特别是适用于特定情形或者能够满足特定检测要求的芯片。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
目前市售的芯片或者利用已知方法制备得的芯片，芯片表面抗非特异吸附等性能并不能满足基于芯片的单分子检测的要求。例如，在芯片上进行测序时，测试发现，芯片的表面性能包括非特异吸附等，对表面引物/探针的固定、固定量及分布，模板核酸的捕获及后续测序过程的生化反应都有重要影响，直接影响最终测序结果。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种对固相基底进行化学修饰的方法，该方法包括：对固相基底进行表面修饰，所称表面修饰包括利用混合物对所述固相基底的表面进行处理，所述混合物包含1:1～1:1000摩尔比的环氧基团和亲水基团末端。该方法通过控制环氧基团和亲水基团的比例，能够方便地通过调节固相基底表面环氧基团(反应基团，例如可与探针连接反应)和亲水基团的比例，来调节固相基底的承载量以及性能。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备芯片的方法，所称芯片包括固相基底。根据本发明的实施例，所述方法包括：对固相基底进行表面修饰，所述表面修饰包括利用混合物对所述固相基底的表面进行处理，所述混合物包含1:1～1:1000摩尔比的环氧基团和亲水基团末端。根据本发明实施例的上述方法，通过控制环氧基和亲水基团的比例，能够方便地通过调节固相基底表面环氧基团(反应基团，例如可与探针连接反应)和亲水基团的比例，来调控固相基底的承载量以及性能，例如亲疏水性能，利于降低固相基底/芯片表面非特异吸附，提高获得的芯片的核酸检测性能，特别利于用于高精度和/或单分子级别检测的芯片的制备。
需要说明的是，本申请所述的“固体基底”可以是任何可用于可用于固定核酸序列的固体支持物，例如尼龙膜、玻璃片、塑料、硅片、磁珠等，如无特殊说明，芯片表面与基底表面可互换使用。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述方法进一步将核酸探针分子固定在表面修饰后的固相基底上。
根据本发明的实施例，所述环氧基团来自环氧硅烷，所述环氧硅烷具有硅烷基团末端和至少一个环氧基团末端。
根据本发明的实施例，所述亲水基团末端来自第一硅烷，所述第一硅烷具有硅烷基团末端和至少一个亲水基团末端。
根据本发明的实施例，所述环氧硅烷和/或所述第一硅烷的硅烷基团选自一甲基硅烷，二甲基硅烷，三甲基硅烷，一甲基氧硅烷，二甲氧基硅烷和三甲氧基硅烷中的至少之一种。
根据本发明的实施例，所述环氧硅烷和/或所述第一硅烷具有连接基团，所述连接基团和所述硅烷基团连接，所述连接基团为1～12个烷烃链或者1～8乙氧基链。上述连接基团有利于在固相基底表面形成表面高低较一致的单分子层，且起到隔离基底表面的作用。
根据本发明的实施例，所述环氧硅烷选自3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，缩水甘油醚氧基丙基乙氧基硅烷，缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷，缩水甘油醚氧基丙基甲基二甲氧基硅烷，2-(3，4-环氧环已烷)-乙基三甲氧基硅烷和2-(3，4-环氧环已烷)-乙基三乙氧基硅烷中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述第一硅烷选自羟基丙基三甲氧基硅烷，3-氨丙基三乙氧基硅烷，3-氨丙基三甲氧基硅烷，3-脲丙基三乙氧基硅烷，3-脲丙基三甲氧基硅烷，(3，3，3-三氟丙基)甲基二甲氧基硅烷，(3，3，3-三氟丙基)甲基二乙氧基硅烷，3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和甲基丙烯酰氧基丙基三(三甲基硅氧基)硅烷中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述表面修饰在液相和/或气相中进行。例如，可利用化学气相沉积法(CVD)进行表面修饰。
根据本发明的实施例，所述环氧基团来自环氧硅烷，所述亲水基团末端来自第一硅烷，所述混合物中环氧硅烷和第一硅烷的总含量为1％-3％。进而硅烷化效率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述方法还包括：进行所述表面修饰之前，对所述固相基底进行表面活化，以使所述固相基底的表面带有羟基。
根据本发明的实施例，所述核酸探针分子为经过末端氨基化修饰的核酸分子。进而氨基通过1～8烷基链或1～4乙氧基链与修饰处理的固相基体连接。
根据本发明实施例的方法，获得芯片中的核酸探针分子的固定密度随着环氧基团和亲水基团的摩尔比的增大而增大。
根据本发明的实施例，所述环氧基团和亲水基团的摩尔比为1:1000，所述核酸探针分子的固定密度为0.6个/μM2。核酸探针分子的固定密度与环氧基团和亲水基团的摩尔比具有可控的对应关系。
根据本发明的实施例，所述环氧基团和亲水基团的摩尔比为1:500，所述核酸探针分子的固定密度为1.2个/μM2。核酸探针分子的固定密度与环氧基团和亲水基团的摩尔比具有可控的对应关系。
根据本发明的实施例，所述环氧基团和亲水基团的摩尔比为1:250，所述核酸探针分子的固定密度为2.4个/μM2。核酸探针分子的固定密度与环氧基团和亲水基团的摩尔比具有可控的对应关系。
根据本发明的实施例，所述环氧基和羟基的摩尔比为1:1～1:250，所述核酸探针分子的固定密度大于2.4个/μM2。核酸探针分子的固定密度与环氧基团和亲水基团的摩尔比具有可控的对应关系。由于本发明实施例中涉及的具体数据大多具有统计意义，因此，如无特殊说明，任意以精确方式表达的数值均代表一个范围，即包含该数值正负10％的区间，以下不再重复说明。
根据本发明的实施例，所述活化固相基底是通过将所述固相基底与乙醇或异丙醇以及Piranha溶液进行接触获得的。进而使固相基底表面产生足够多的活性羟基基团。
根据本发明的实施例，所述环氧硅烷为3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷。进而硅烷化效率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述羟基硅烷为羟基丙基三甲氧基硅烷。进而硅烷化效率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述氨基修饰在所述核酸探针分子的5’端。
根据本发明的实施例，所述核酸探针分子为含有polyT，polyA的引物。
根据本发明的实施例，所述核酸探针分子的长度为10～30bp。
根据本发明的实施例，所述环氧开环反应是在磷酸盐溶液中进行的。进而将反应pH有效控制在8～10。
根据本发明的实施例，所述磷酸盐为0.1M～2M的K2HPO4溶液。进而环氧开环反应的效率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述环氧开环反应是在25～60℃的条件下进行4～24小时。进而环氧开环反应充分，核酸探针分子可最大化固定在经过硅烷化处理的固相基体上。
根据本发明的实施例，表面修饰之后、固定核酸探针分子之前进一步包括：对经过硅烷化处理的固相基体进行第一洗涤。进而将多余的环氧硅烷和羟基硅烷从固相基体表面洗掉，进一步提高芯片的抗非特异性吸附能力。
根据本发明的实施例，固定核酸探针分子之后进一步包括：对固定有核酸探针分子的固相基体进行第二洗涤。进而将多余的没有固定的核酸探针分子或非特异性结合从固相基体表面洗掉，进一步提高芯片的抗非特异性吸附能力。
根据本发明的实施例，第一洗涤是用乙醇或异丙醇，水交替清洗。
根据本发明的实施例，第二洗涤是依次使用3XSSC与0.1％的Triton组成的混合液，0.1M～2MMK2HPO4，150mMHEPES与150mMNaCl溶液和超纯水来清洗。
在本发明的第三方面，本发明提出了利用前面所述的方法制备的芯片。根据本发明实施例的芯片具有较优的表面性能，对核酸的非特异性吸附低、利于大量探针固定上以及均匀分布，应用于核酸捕获检测，利于获得数据量大、质量高的检测结果，特别适用于高精确要求的核酸检测，例如单分子水平的核酸检测。
附图说明
图1是根据本发明实施例的测序芯片的工艺示意图；
图2是根据本发明实施例的不同杂交浓度下的表面杂交荧光点数变化的结果图；
图3是根据本发明实施例的不同混合比例下的表面杂交荧光点数变化的结果图；以及
图4是根据本发明实施例的不同混合比例下的表面非特异吸附荧光点数变化的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。示例中的试剂、检测仪器等，如无特殊说明，可自配或者通过市售途径获取。
在以下实施例中，CY3和CY5为核酸标记分子，Cy5和Cy3都属于水溶性3H-吲哚菁型生物荧光标示染料，分别能够在650nm和550nm的激光照射下发出红光色荧光和绿色荧光。
基底芯片为空载芯片，不含探针。
环氧硅烷可以采用3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，缩水甘油醚氧基丙基乙氧基硅烷，缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷，缩水甘油醚氧基丙基甲基二甲氧基硅烷，2-(3，4-环氧环已烷)-乙基三甲氧基硅烷，2-(3，4-环氧环已烷)-乙基三乙氧基硅烷等。以下实施例中以3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷为例。
第一硅烷可以采用羟基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷，3-氨丙基三甲氧基硅烷，3-脲丙基三乙氧基硅烷，3-脲丙基三甲氧基硅烷，(3，3，3-三氟丙基)甲基二甲氧基硅烷，(3，3，3-三氟丙基)甲基二乙氧基硅烷，3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，甲基丙烯酰氧基丙基三(三甲基硅氧基)硅烷等。以下实施例中以羟基丙基三甲氧基硅烷为例。
实施例1制备芯片
(1)清洗，活化玻璃表面：用乙醇或异丙醇，水交替清洗直径为40mm玻璃表面，使用Piranha溶液活化玻璃，使表面产生足够多活性羟基基团；
(2)表面接枝：配制1：100的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷和羟基丙基三甲氧基硅烷混合水溶液，调整pH＝5.5，将玻璃片浸泡在该溶液中，室温下反应12小时，反应完，用乙醇或异丙醇，水交替清洗三次。
实施例2制备芯片
(1)同实施例(1)；
(2)同实施例(2)；
(3)引物固定：将接枝后的玻璃片吹干后，置于浓度为1.0M的氨基修饰的PolyT核酸引物的K2HPO4溶液中，K2HPO4溶液的浓度为150mM，反应1小时，依次用3XSSC溶液(含0.1％的Triton)，0.2M K2HPO4溶液，150mMHEPES与150mMNaCl混合溶液，及超纯水清洗后，含有PolyT引物(探针)的基底芯片制作完成。
为方便理解，发明人将根据实施例2的制备流程简单表示如图1。
实施例3
吹干上述基底芯片后，分别杂交不同浓度的PolyA-CY3于上述基底芯片，杂交浓度为0.2nM，0.4nM，0.6nM,0.8nm，重复三次，在显微镜下统计每平方微米视野内的平均荧光点数。如图2所示。由图2可知：1，不同杂交浓度下均有荧光点，说明引物成功固定在基底玻璃表面；2，0.46nM后，提高杂交浓度，杂交点数均没有明显变化，这说明表面固定引物数量一定，杂交点数在一定浓度后不随点数变化。
实施例4
根据实施案例1或2中方法，混合物包含3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷和羟基丙基三甲氧基硅烷，分别调整混合液中3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷和羟基丙基三甲氧基硅烷比例为1：1，1：10，1:100，1：1000制作不同比例的基底芯片各3张，然后用同一浓度0.6nM的PolyA-CY3杂交，在荧光显微镜下统计每平方微米视野内的平均荧光点数，如图3所示。结果显示：1)不同比例下，表面引物均成功固定在基底玻璃上；2)通过调整硅烷混合液比例，可以有效调整表面固定密度。
实施例5
将实施例4中不同比例基底芯片，一起浸泡在含有5％的含CY5的C碱基溶液中，室温反应5分钟后，依次用2XPBS溶液和超纯水清洗后，得到吸附了一定碱基的芯片，在显微镜下统计每平方微米视野内的平均荧光点数。如图4所示：1，混合比例为1：1000的基底芯片具有最少的荧光点数，说明此表面的抗碱基非特异吸附较强；2，随着比例变小，荧光点数呈递减趋势，说明基底芯片的抗碱基非特异吸附可以通过调整混合比例来实现。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种对固相基底进行化学修饰的方法，其特征在于，包括：
对固相基底进行表面修饰，所述表面修饰包括利用混合物对所述固相基底的表面进行处理，所述混合物包含1:1～1:1000摩尔比的环氧基团和亲水基团末端。
2.一种制备芯片的方法，所述芯片包括固相基底，其特征在于，包括利用权利要求1的方法对所述固相基底进行化学修饰。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：
将核酸探针分子固定在表面修饰后的固相基底上。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述环氧基团来自环氧硅烷，所述环氧硅烷具有硅烷基团末端和至少一个环氧基团末端；和/或
所述亲水基团末端来自第一硅烷，所述第一硅烷具有硅烷基团末端和至少一个亲水基团末端。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述环氧硅烷和/或所述第一硅烷的硅烷基团选自一甲基硅烷，二甲基硅烷，三甲基硅烷，一甲基氧硅烷，二甲氧基硅烷和三甲氧基硅烷中的至少之一种；
任选地，所述环氧硅烷和/或所述第一硅烷具有连接基团，所述连接基团和所述硅烷基团连接，所述连接基团为1～12个烷烃链或者1～8乙氧基链。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述环氧硅烷选自3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，缩水甘油醚氧基丙基乙氧基硅烷，缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷，缩水甘油醚氧基丙基甲基二甲氧基硅烷，2-(3，4-环氧环已烷)-乙基三甲氧基硅烷和2-(3，4-环氧环已烷)-乙基三乙氧基硅烷中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一硅烷选自羟基丙基三甲氧基硅烷，3-氨丙基三乙氧基硅烷，3-氨丙基三甲氧基硅烷，3-脲丙基三乙氧基硅烷，3-脲丙基三甲氧基硅烷，(3，3，3-三氟丙基)甲基二甲氧基硅烷，(3，3，3-三氟丙基)甲基二乙氧基硅烷，3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和甲基丙烯酰氧基丙基三(三甲基硅氧基)硅烷中的至少一种。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表面修饰在液相和/或气相中进行，
任选地，所述环氧基团来自环氧硅烷，所述亲水基团末端来自第一硅烷，所述混合物中环氧硅烷和第一硅烷的总含量为1％-3％，
优选地，进行所述表面修饰之前，对所述固相基底进行表面活化，以使所述固相基底的表面带有羟基，
任选地，所述核酸探针分子为经过末端氨基化修饰的核酸分子。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述环氧硅烷为3’-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，所述第一硅烷为羟基丙基三甲氧基硅烷，
任选地，表面修饰之后、固定核酸探针分子之前进一步包括：对经过表面修饰的固相基底进行第一洗涤，
任选地，固定核酸探针分子之后进一步包括：对固定有核酸探针分子的固相基底进行第二洗涤。
10.一种芯片，其特征在于，所述芯片是利用权利要求2～9任一方法制备的芯片。
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