CN112322767A - 一种以酵母当量表征黄酒微生物数量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以酵母当量表征黄酒微生物数量的方法，属于微生物绝对定量准确测定技术领域。本发明提供了一种测定发酵产品中的微生物生物量的方法，可以以酿酒酵母为计数基准，通过将血球计数板计数与qPCR相结合的方法，以酿酒酵母数量来衡量难以计数的霉菌的数量，即以酵母当量来表示其他微生物的数目，采用该种方法使得发酵过程的微生物能准确的测定其生物量。

Description

一种以酵母当量表征黄酒微生物数量的方法
技术领域
本发明涉及一种以酵母当量表征黄酒微生物数量的方法，属于微生物绝对定量准确测定技术领域。
背景技术
黄酒是深受人们喜爱的一种饮品，已有9000多年的历史，现代化黄酒酿造采用了含有酿酒酵母的强化酒母和黄曲霉SU16的强化熟麦曲以及生麦曲进行多菌种混合双边发酵的工艺，前期研究表明曲霉属与酿酒酵母等真菌是黄酒酿造过程中的优势功能微生物，在发酵醪中占到菌群结构50％以上。因此为了更好地分析优势功能微生物在黄酒酿造中的作用，需要快速准确地测定发酵过程中生物量的变化。
传统微生物的生物量测定方法有平板菌落计数法，紫外分光光度计法、干重法、血球板计数法、流式细胞仪法等等。酿酒酵母的生物量测定的传统方法主要是显微镜血球计数法和平板菌落计数法，前者方便操作，但后者常常需要24～48h，耗时较长；霉菌生物量测定的传统方法主要是平板菌落计数法，但是这种方法有它的局限性，在霉菌生长初期，菌丝大量生长而菌落数难以真实反映霉菌的生长。另外，霉菌涂布计数的方法需要约3-7d的长时间培养。
近年来，随着分子生物学的快速发展，宏基因组测序手段不断应用于发酵食品的菌落结构分析，但是传统的方法计数不够准确且费时费力。宏基因组测序是相对定量，不能确定微生物在发酵过程中的具体生物量。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。近年来，qPCR的方法逐渐应用于生物量测定中。
目前，已有学者采用微生物纯培养计数、PCR-DGGE和克隆文库分析技术等对黄酒酿造过程中的群落结构变化进行了分析研究，但是难以获得微生物的定量数据。
发明内容
本发明根据黄酒酿造过程中发酵醪液中酿酒酵母与总真菌含量变化趋势一致的现象，提供了一种以酿酒酵母当量表征黄酒微生物数量的方法，该方法可更好地分析优势微生物在黄酒酿造中的作用，提出来以酵母当量表征黄酒微生物数量的方法，可以在同一水平上对不同微生物进行比较分析，结果更为准确，并可以对黄酒中的微生物定量。
本发明的第一个目的是提供一种测定微生物数量的方法，所述黄酒微生物包括但不限于酿酒酵母、黄曲霉、米曲霉或总真菌；
所述方法包括如下步骤：
(1)分别采用特异性引物，对待测样品的基因组DNA进行qPCR，获得循环数Ct值；其中，以SEQ ID NO.1～2扩增酿酒酵母基因组DNA；以SEQ ID NO.3～4扩增黄曲霉基因组DNA，以SEQ ID NO.5～6扩增总真菌基因组DNA；
(2)将步骤(1)获得的循环数Ct值带入下述线性方程中计算；其中，Y表示细胞数量的log10值，X表示循环数Ct值；
酿酒酵母：Y＝-0.2985X+12.289；
黄曲霉和/或：Y＝-0.3137X+10.701；
总真菌：Y＝-0.2974X+10.345。
在一种实施方式中，所述方法用于检测发酵产品中的微生物数量。
在一种实施方式中，所述方法用于检测黄酒发酵醪液中的微生物数量。
在一种实施方式中，所述总真菌包括下述至少一种微生物：Saccharomycescerevisiae、Pichia kudriavzevii、Schizosaccharomyces pombe、Cryptococcusalbidus、Aspergillus flavus、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger、Aspergillusbrasiliensis、Lichtheimia corymbifera、Lichtheimia ramosa、Penicilliumchrysogenum、Monascus purpureus。
在一种实施方式中，所述方法还包括提取待测产品的基因组DNA，在将基因组DNA用于所述方法的步骤(1)的操作。
本发明还提供一种定量检测微生物含量的试剂盒，含有(a)～(c)至少一组引物：
(a)SEQ ID NO.1～2所示扩增酿酒酵母特异性片段的引物；
(b)SEQ ID NO.3～4所示扩增黄曲霉和/或米曲霉的特异性片段的引物；
(c)SEQ ID NO.5～6所示的扩增总真菌的特异性片段的引物。
在一种实施方式中，所述总真菌包括下述至少一种微生物：Saccharomycescerevisiae、Pichia kudriavzevii、Schizosaccharomyces pombe、Cryptococcusalbidus、Aspergillus flavus、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger、Aspergillusbrasiliensis、Lichtheimia corymbifera、Lichtheimia ramosa、Penicilliumchrysogenum、Monascus purpureus。
在一种实施方式中，所述试剂盒还含有逆转录试剂和qPCR试剂。
本发明还提供一种以酿酒酵母当量表征黄酒微生物数量的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)分别采用特异性引物，对待测样品的基因组DNA进行qPCR，获得循环数Ct值；其中，以SEQ ID NO.1～2扩增酿酒酵母基因组DNA；以SEQ ID NO.5～6扩增总真菌基因组DNA；
(2)将步骤(1)获得的循环数Ct值带入下述线性方程中计算；其中，Y表示细胞数量的log10值，X表示循环数Ct值；
酿酒酵母：Y＝-0.2985X+12.289；
总真菌：Y＝-0.2974X+10.345。
本发明还要求保护所述方法在研究黄酒发酵过程中微生物动态变化方面的应用。
有益效果：
1、本发明的方法操作更方便，与传统的平板涂布菌落计数方法相比节省时间；
2、本发明qPCR的检测结果准确性好，采用血球板计数法验证的结果与检测结果差异不大；具有良好的可重复性和回收率；
3、本发明可通过酿酒酵母的数量表征黄酒酿造过程中的黄酒微生物数量，可以有效地反应黄酒微生物在黄酒酿造中的作用；
附图说明
图1为一种以酵母当量表征的黄酒微生物数量的方法的流程图。
具体实施方式
实施例1
根据目的条带应为150bp以内大小，分别筛选特异性扩增酿酒酵母、黄曲霉以及总真菌的引物，结果如表1所示。
表1引物序列信息
Figure BDA0002746288540000031
采用从黄酒生产中筛选到的菌株基因组为模板(表2所示)，通过PCR扩增对引物进行验证；选用黄酒酿造过程中筛选到的酵母菌和霉菌进行基因组的提取，并选用上述引物PCR扩增并进行凝胶电泳分析，根据是否能够扩增出目的条带(单一目的条带)，评价引物的特异性。结果如表2所示。
表2引物特异性验证
Figure BDA0002746288540000032
Figure BDA0002746288540000041
注：“+”表示有目的电泳条带“-”表示没有目的电泳条带或者条带有多条；
分别应用引物SC-For/Rev和TF-For/Rev对酿酒酵母进行qPCR扩增，应用引物Ao-For/Rev对黄曲霉进行qPCR扩增，根据Tm值(DNA双链解链50％的温度)和荧光信号值绘制溶解曲线，所有样品进行三个平行，通过溶解曲线是否为单一溶解峰和扩增曲线是否为倒S曲线来评估引物专一性；结果显示，三对引物SC-For/Rev、Ao-For/Rev、TF-For/Rev的溶解曲线均为单一溶解峰、扩增曲线为典型的倒S曲线，说明溶解温度均一，扩增产物特异性好。
分别取108数量级的酿酒酵母细胞和108数量级黄曲霉孢子，提取基因组DNA，以10倍梯度稀释为模板，应用引物SC-For/Rev和TF-For/Rev对酿酒酵母进行扩增，应用引物Ao-For/Rev对黄曲霉进行qPCR扩增，建立标准曲线，每个样品取三个平行，扩增效率通过公式E＝10(-1/b)-1来计算，其中b是标准曲线的斜率，标准曲线中Y表示细胞数量的log值，X表示荧光定量的循环数Ct值；标准曲线如表3所示。
表3引物及标准曲线
Figure BDA0002746288540000042
Figure BDA0002746288540000051
注：Y表示细胞数量的log10值，X表示循环数Ct值；
标准曲线的可靠性通过可信度(R2)和扩增效率(Eff，95％～105％)来衡量。标准曲线的可信度均大于0.99，且扩增效率在95％-105％之间，说明标准曲线线性较好，样品重复性高。
实施例2
采用已知数量的酿酒酵母和黄曲霉对实施例1建立的方法的适用性进行验证。
将酿酒酵母在YPD培养基(10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖)中培养，获得菌体细胞；
黄曲霉在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中培养，获得黄曲霉孢子；
实验采用黄酒原料制作黄酒模拟液。取0.100kg米粉，加入0.86g麦曲及2L清水，添加2mL液化酶，90℃液化2h，用乳酸调节pH至4.0，加入2mL糖化酶，60℃糖化2h作为黄酒模拟液。
将一定量的酿酒酵母和黄曲霉添加入黄酒模拟液中，终浓度分别为1.56×106CFU/g和1.08×106CFU/g提取基因组后，按照实施例1的方法，分别采用SC-For/Rev、Ao-For/Rev对基因组进行qPCR扩增，扩增获得Ct值分别为20.36和14.52，将扩增结果分别代入表3的标准曲线中进行生物量计算，定量得到生物量为酿酒酵母1.63×106cfu/g、黄曲霉1.40×106cfu/g。
表4
Figure BDA0002746288540000052
回收率R1：
Figure BDA0002746288540000053
R1：荧光定量PCR方法回收率；
M1：实时荧光定量PCR方法检测到的细胞数量；
M0：黄酒模拟液中添加的细胞数量(显微镜计数)；
表4显示了血球板计数结果(第一列)与荧光定量PCR方法结果(第四列)，可以看出荧光定量PCR测定的结果与血球板计数结果同在一个数量级，并且回收率大于90％，说明荧光定量PCR方法具有较高的生产应用性。另外由于荧光定量PCR方法是根据细胞核中特定区域DNA的拷贝数表征生物量，更能准确反应细胞分裂的真实情况。
将一定量的酿酒酵母和黄曲霉添加入黄酒模拟液中，使酿酒酵母和黄曲霉在黄酒模拟液中的终浓度分别为1.56×106CUF/g和1.08×106CUF/g。提取基因组后，按照实施例1的方法，采用TF-For/Rev对基因组进行qPCR进行扩增，获得Ct值为12.81，将扩增结果代入表3总真菌的标准曲线中进行生物量计算，定量得到生物量为3.43×106CUF/g(以酵母计)，以表3中黄曲霉的标准曲线进行生物量计算，黄曲霉含量为1.40×106。
实施例3：对黄酒发酵过程中发酵醪液中的微生物进行定量检测
取黄酒发酵第120小时的发酵醪液，进行总基因组的提取；分别采用SC-For/Rev、Ao-For/Rev和TF-For/Rev对发酵醪液中的基因组DNA进行qPCR扩增，扩增获得Ct值分别为15.91、16.72和9.36；将扩增结果分别代入表3的线性方程中进行生物量计算，定量得到酿酒酵母生物量为3.46×107cfu/g发酵醪液，以酿酒酵母当量表示黄曲霉生物量，黄曲霉数量为2.85×105cfu/g发酵醪液；以酿酒酵母当量表示总真菌生物量，总真菌的生物量为3.65×107cfu/g发酵醪液，可见，在黄酒发酵醪液的总体微生物中，酿酒酵母数量占95％的比例，黄曲霉占1.5％。该检测结果与血球板计数法相比，准确性在90％以上，并且该方法能更精确的定量生物量，具有特异性强、灵敏度高、检测限低、快速准确的优势。
对比例1
具体实施方式同实施例1，区别在于，将扩增酿酒酵母的引物替换为SC2-For/SC2-Rev；
SC2-For：CAGTCATCTTTAACCTCATCCCACAA；
SC2-Rev：CATTTGGCCCAAGAATTCATGGAAT；
结果显示(表5)，SC2-For/REV除了扩增酿酒酵母之外还可以扩增毕赤酵母，特异性差。
对比例2
具体实施方式同实施例1，区别在于，将扩增黄曲霉的引物替换为β-For/β-Rev；
β-For：TCTTCATGGTTGGCTTCGCT；
β-Rev：CTTGGGTCGAACATCTGCT；
结果显示(表5)，β-For/Rev不仅对黄曲霉有较好的扩增效果，还可以扩增黄酒酿造过程中的其他丝状真菌(黑曲霉)，不适合作为特异性扩增黄曲霉的引物。
对比例3
具体实施方式同实施例1，区别在于，将扩增黄曲霉的引物替换为
F1-For：GCGGTAATTCCAGCTCCAATAG；
F1-Rev：GCCACAAGGACTCAAGGTTAG；
结果显示(表5)，F1-For/Rev不能扩增出Schizosaccharomyces pombe、Cryptococcus albidus、Aspergillus flavus、Lichtheimia corymbifera、Lichtheimiaramosa、Penicillium chrysogenum和Monascus purpureus，不适合作为扩增总真菌的特异性引物。
表5引物特异性验证
Figure BDA0002746288540000071
注：“+”表示有目的电泳条带“-”表示没有目的电泳条带或者条带有多条；
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
上海金枫酒业股份有限公司
<120> 一种以酵母当量表征黄酒微生物数量的方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccctcaaga acgaaatggt g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcaaaggca gaagcagaat cg 22
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtcgtcccct ctccgg 16
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctggaaaaag attgatttgc g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gagtcgagtt gtttgggaat gc 22
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tctctttcaa agttcttttc atcttt 26

Claims (10)

1.一种测定微生物数量的方法，其特征在于，所述微生物包括但不限于酿酒酵母、黄曲霉或米曲霉；
所述方法包括如下步骤：
(1)分别采用特异性引物，对待测样品的基因组DNA进行qPCR，获得循环数Ct值；其中，以SEQ ID NO.1～2扩增酿酒酵母基因组DNA；以SEQ ID NO.3～4扩增黄曲霉基因组DNA；
(2)将步骤(1)获得的循环数Ct值带入下述线性方程中计算；其中，Y表示细胞数量的log10值，X表示循环数Ct值；
酿酒酵母：Y＝-0.2985X+12.289；
黄曲霉和/或米曲霉：Y＝-0.3137X+10.701。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于检测发酵产品中的微生物数量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵产品为黄酒发酵醪液。
4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，提取待测样品的基因组DNA，再将基因组DNA用于步骤(1)的操作。
5.一种定量检测微生物含量的试剂盒，其特征在于，含有(a)～(c)至少一组引物：
(a)SEQ ID NO.1～2所示扩增酿酒酵母特异性片段的引物；
(b)SEQ ID NO.3～4所示扩增黄曲霉和/或米曲霉的特异性片段的引物；
(c)SEQ ID NO.5～6所示的扩增总真菌的特异性片段的引物。
6.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述总真菌包括下述至少一种微生物：Saccharomyces cerevisiae、Pichia kudriavzevii、Schizosaccharomyces pombe、Cryptococcus albidus、Aspergillus flavus、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger、Aspergillus brasiliensis、Lichtheimia corymbifera、Lichtheimia ramosa、Penicillium chrysogenum、Monascus purpureus。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述试剂盒还含有逆转录试剂和qPCR试剂。
8.一种以酿酒酵母当量表征黄酒微生物数量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)分别采用特异性引物，对待测样品的基因组DNA进行qPCR，获得循环数Ct值；其中，以SEQ ID NO.1～2扩增酿酒酵母基因组DNA；以SEQ ID NO.5～6扩增总真菌基因组DNA；
(2)将步骤(1)获得的循环数Ct值带入下述线性方程中计算；其中，Y表示细胞数量的log10值，X表示循环数Ct值；
酿酒酵母：Y＝-0.2985X+12.289；
总真菌：Y＝-0.2974X+10.345。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述总真菌包括下述多种微生物的混合物：Saccharomyces cerevisiae、Pichia kudriavzevii、Schizosaccharomyces pombe、Cryptococcus albidus、Aspergillus flavus、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger、Aspergillus brasiliensis、Lichtheimia corymbifera、Lichtheimia ramosa、Penicillium chrysogenum、Monascus purpureus。
10.权利要求8或9所述方法在研究黄酒发酵过程中微生物动态变化方面的应用。
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