CN112322709B - 快速鉴定马铃薯晚疫病菌Cytb基因核苷酸点突变及其对吡唑醚菌酯抗性的方法 - Google Patents

快速鉴定马铃薯晚疫病菌Cytb基因核苷酸点突变及其对吡唑醚菌酯抗性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及马铃薯晚疫病菌细胞色素b基因Cytb核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂吡唑醚菌酯抗性检测中的应用，具体公开了两种快速鉴定马铃薯晚疫病菌Cytb基因406位核苷酸突变对吡唑醚菌酯产生抗性的分子检测方法及其专用引物。所述突变位点指马铃薯晚疫病菌中Cytb基因自5’末端起第406位核苷酸为A纯合，由此导致Cytb蛋白自N端起第136位氨基酸为纯合的精氨酸。本发明提供的分子检测方法灵敏度高、特异性强、检测周期短，可以实现马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯抗性菌株的快速鉴定，高通量监测田间马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯的抗性发生及发展情况，为我国马铃薯晚疫病的发生流行和抗性治理提供理论指导。

Description

快速鉴定马铃薯晚疫病菌Cytb基因核苷酸点突变及其对吡唑 醚菌酯抗性的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及马铃薯晚疫病菌细胞色素b基因Cytb核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂吡唑醚菌酯抗性检测中的应用，具体公开两种快速鉴定马铃薯晚疫病菌Cytb基因核苷酸点突变及其对吡唑醚菌酯抗性的分子检测方法及专用引物。
背景技术
致病疫霉(Phytophthora infestans)是卵菌纲疫霉属中重要的植物病原菌，为异宗配合，是引起晚疫病的专性寄生菌。晚疫病是马铃薯上一种最具毁灭性的病害，危害马铃薯的整个生育期，是制约马铃薯产业可持续发展的主要因素。
目前，生产中主要采用选育利用抗病品种、健康栽培、病情预测预报、生物防治和化学防治等多种手段防治马铃薯晚疫病。化学防治因其具有操作简便、见效快和防效高等优点，是病害防治的主要措施。市场上防治马铃薯晚疫病等卵菌病害的杀菌剂主要有百菌清、代森锰锌和氢氧化铜等保护性杀菌剂以及甲霜灵、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、霜脲氰、烯酰吗啉、氟吡菌胺和氟噻唑吡乙酮等内吸性杀菌剂。由于一些内吸性杀菌剂的频繁和不科学使用，马铃薯晚疫病菌等植物病原卵菌已经对甲霜灵、精甲霜灵等苯基酰胺类药剂产生了严重抗性。
吡唑醚菌酯(Pyraclostrobine)是德国巴斯夫公司在醚菌酯基础上开发的兼具吡唑结构的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，为线粒体呼吸抑制剂。吡唑醚菌酯能够有效防治由卵菌纲、子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类引起的植物病害，对马铃薯晚疫病具有良好防效。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂具有活性高和杀菌谱广等优点，但是该类杀菌剂的作用靶标蛋白细胞色素b是由突变率很高的线粒体基因所编码，基因突变极易引起靶标蛋白与药剂结合位点处的氨基酸发生改变，从而导致病原菌对该类杀菌剂产生抗性。国际杀菌剂抗性行动委员会(FRAC)已将甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂列为高抗药性风险杀菌剂。实际生产中，该类杀菌剂抗性发展速度很快，上市应用仅2年就在欧洲很多地区监测到抗性菌株。本研究室通过药剂驯化方法获得了马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯的抗性菌株，部分抗性菌株的生存适合度较高，表明抗性菌株存在发展成为田间优势群体的可能。加强监测和早期预警马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯的抗性发生发展情况，有助于指导该类杀菌剂的科学使用，延长药剂使用寿命和延缓抗药性发生。
植物病原菌的抗药性监测能够为植物病害抗药性流行预警和抗药性治理提供重要参考依据。传统的杀菌剂抗性检测或监测方法主要包括菌丝生长速率测定法、菌丝干重测定法、孢子萌发测定法和琼脂展布法等。这些传统方法需要先对病原菌进行分离纯化，然后接种于含药培养基或者接种于杀菌剂处理过的活体植株或组织上，再经过一定时间的培养才能对抗药性结果进行调查分析。马铃薯晚疫病菌培养时间相对较长，若利用菌丝生长速率测定法进行抗药性测定，需在含药黑麦蔗糖琼脂培养基上培养7～10d才能调查结果，且在培养过程中容易有杂菌污染。检测过程除周期较长外，还需设置多个处理和多次重复，工作量较大，成本较高。相比传统检测方法，等位基因特异性PCR技术(AS-PCR)和酶切扩增多态性序列(CAPS)标记技术等分子检测方法缩短了检测时间(一般不超过4h)，提高了检测效率和灵敏度，已经成为田间抗药性早期诊断的理想方法。
发明内容
本发明的第一个目的是提供两种检测或者辅助检测马铃薯晚疫病菌Cytb基因是否存在突变位点的方法及其专用引物。
本发明提供的第一种检测或者辅助检测马铃薯晚疫病菌中Cytb基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：
以待测马铃薯晚疫病菌基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为639bp片段，则所述待测马铃薯晚疫病菌Cytb基因存在或候选存在突变位点；
所述PCR扩增中，退火温度为65℃；
所述突变位点指马铃薯晚疫病菌中Cytb基因自5’末端起第406位核苷酸为A纯合。
本发明提供的第二种检测或者辅助检测马铃薯晚疫病菌中Cytb基因是否存在突变位点的方法，为方法甲或方法乙。
所述方法甲包括如下步骤：
以待测马铃薯晚疫病菌基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所述引物对进行PCR扩增，扩增得到802bp的Cytb基因片段，对所述Cytb基因片段用BsmAI进行酶切，如果酶切产物中含有314bp和488bp两个片段，则所述马铃薯晚疫病菌中Cytb基因片段存在或者候选存在突变位点；如果酶切产物仍为802bp，则所述马铃薯晚疫病菌中Cytb基因片段不含有突变位点。
所述方法乙包括如下步骤：
以待测马铃薯晚疫病菌基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所述引物对进行PCR扩增，扩增得到802bp的Cytb基因片段，对所述Cytb基因片段用BsmFI进行酶切，如果酶切产物仍为802bp，则所述马铃薯晚疫病菌中Cytb基因片段存在或者候选存在突变位点；如果酶切产物中含有334bp和468bp两个片段，则所述马铃薯晚疫病菌中Cytb基因片段不含有突变位点。
所述PCR扩增中，退火温度为58℃；
所述突变位点指马铃薯晚疫病菌中Cytb基因自5’末端起第406位核苷酸为A纯合。
本发明提供的第一种检测或者辅助检测马铃薯晚疫病菌中Cytb基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所述DNA分子组成。
本发明提供的第二种检测或者辅助检测马铃薯晚疫病菌中Cytb基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所述DNA分子组成。
本发明的第二个目的是提供马铃薯晚疫病菌中Cytb基因和蛋白的突变位点。
本发明提供的马铃薯晚疫病菌中Cytb基因的一个突变位点，为马铃薯晚疫病菌中Cytb基因自5’末端起第406位核苷酸为A纯合。所述Cytb基因自5’末端起第406位核苷酸也就是SEQ ID NO：5中自5’末端起第406位核苷酸。
本发明提供的马铃薯晚疫病菌中Cytb蛋白的一个突变位点，为马铃薯晚疫病菌中Cytb蛋白自N端起第136位氨基酸为精氨酸。所述Cytb蛋白自N端起第136位氨基酸也就是SEQ ID NO：6中自N端起第136位氨基酸。
上述任一突变位点在鉴定马铃薯晚疫病菌抗药性中的应用也属于本发明的保护范围；所述抗药性为对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的抗性。所述甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为吡唑醚菌酯。
上述应用中，存在所述突变位点的马铃薯晚疫病菌具有或候选具有抗药性。
本发明还保护SEQ ID NO：5所示基因。
本发明还保护SEQ ID NO：6所示蛋白。
本发明提供的检测马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯产生抗性的点突变方法，能特异性鉴定马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯的抗性菌株，并且可靠、稳定、可操作性强。该方法可以为生产中马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯抗性群体发展的动态监测、田间抗药性马铃薯晚疫病菌的流行预警及马铃薯晚疫病的综合防控提供参考和技术指导。
附图说明
图1为马铃薯晚疫病菌敏感菌株和抗性菌株的序列比对。A：敏感菌株和抗性菌株Cytb基因突变情况；B：抗性菌株中Cytb基因自5’末端起第406位核苷酸突变为A纯合。WY2、SCYB7、WG8、ND9为敏感菌株，WY2-R1、WY2-R13、WY2-R21、WY2-R24、WY2-R29、WY2-R31、WY2-R43、WY2-R49为抗性菌株。
图2为AS-PCR检测马铃薯晚疫病菌抗性菌株。A：以马铃薯晚疫病菌敏感菌株和抗性菌株基因组DNA为模板，4对AS-PCR引物在不同退火温度扩增下的琼脂糖凝胶电泳结果。B：引物Cytb-136-F4/R在65℃退火温度扩增下的琼脂糖凝胶电泳结果。M:100bpLadder(康为世纪，CW0636)。1：WY2；2：SCYB7；3：WG8；4：ND9。5：WY2-R1；6：WY2-R13；7：WY2-R21；8：WY2-R24；9：WY2-R29；10：WY2-R31；11：WY2-R43；12：WY2-R49。
图3为马铃薯晚疫病菌敏感菌株和抗性菌株BsmAI酶切位点及CAPS方法酶切检测结果。A：马铃薯晚疫病菌敏感菌株和抗性菌株BsmAI酶切位点。B：CAPS方法酶切检测结果。M:100bp Ladder(康为世纪，CW0636)。1～4泳道为敏感菌株，1：WY2；2：SCYB7；3：WG8；4：ND9。5～12泳道为抗性菌株，5：WY2-R1；6：WY2-R13；7：WY2-R21；8：WY2-R24；9：WY2-R29；10：WY2-R31；11：WY2-R43；12：WY2-R49。
图4为马铃薯晚疫病菌敏感菌株和抗性菌株BsmFI酶切位点及CAPS方法酶切检测结果。A：马铃薯晚疫病菌敏感菌株和抗性菌株BsmFI酶切位点。B：CAPS方法酶切检测结果。M:100bp Ladder(康为世纪，CW0636)。1～4泳道为敏感菌株，1：WY2；2：SCYB7；3：WG8；4：ND9。5～12泳道为抗性菌株，5：WY2-R1；6：WY2-R13；7：WY2-R21；8：WY2-R24；9：WY2-R29；10：WY2-R31；11：WY2-R43；12：WY2-R49。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
文中的“吡唑醚菌酯”购自山东海利尔化工有限公司，化学结构式如式(Ⅰ)所示，CAS编号为175013-18-0。
Figure BDA0002792401280000041
文中的“敏感菌株”为对吡唑醚菌酯敏感的马铃薯晚疫病菌；“抗性菌株”为对吡唑醚菌酯具有抗性的马铃薯晚疫病菌。
下述实施例中使用的马铃薯晚疫病菌菌株为：敏感菌株WY2、SCYB7、WG8、ND9，其中敏感菌株WY2为抗性菌株的亲本；抗性菌株WY2-R1、WY2-R13、WY2-R21、WY2-R24、WY2-R29、WY2-R31、WY2-R43、WY2-R49。
上述敏感菌株WY2、WG8分别于2017、2018年采自河北省围场县，SCYB7于2018年采自四川省宜宾市，ND9于2016年采自内蒙古自治区多伦县。抗性菌株WY2-R1、WY2-R13、WY2-R21、WY2-R24、WY2-R29、WY2-R31、WY2-R43、WY2-R49是通过对敏感亲本菌株WY2在室内药剂驯化获得的。上述马铃薯晚疫病菌菌株均经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定，均经过菌落生长速率测定法进行抗药性验证。
实施例1、马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯的敏感性测定。
1、菌株：4株马铃薯晚疫病菌敏感菌株，菌株编号为WY2、SCYB7、WG8和ND9；8株马铃薯晚疫病菌抗性菌株，菌株编号为WY2-R1、WY2-R13、WY2-R21、WY2-R24、WY2-R29、WY2-R31、WY2-R43和WY2-R49。
2、黑麦蔗糖琼脂培养基(Rye sucrose agar,RSA)：黑麦60g，蔗糖20g，琼脂粉12g，蒸馏水定容至1L，121℃湿热灭菌20分钟。
3、实验步骤如下：
将吡唑醚菌酯用丙酮配制成1000μg/mL母液，用无菌水进行系列稀释后，定量加入溶化后冷却至约50℃的RSA培养基中，混匀后倒入直径6cm的培养皿，每皿10mL，制成含吡唑醚菌酯5、1、0.5、0.1、0.05μg/mL的平板。以只含等量丙酮的RSA平板作为溶剂对照，以只含等量无菌水的RSA平板作为空白对照。每个处理3皿，每皿中央接种1个直径为0.5cm的菌饼，倒置于18℃培养箱中黑暗培养7～10d，至无菌水空白对照菌落长满培养皿时采用十字交叉法测量各处理菌落直径(cm)。计算各药剂浓度对菌丝生长的抑制率(％)，抑制率(％)＝(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)/(对照菌落生长直径-0.5)×100。通过DPS 7.05数据分析软件，进行药剂浓度对数值(x)与抑制率转对应的机率值(y)之间的线性回归分析，求出毒力回归方程y＝bx+a、相关系数(r)及有效抑制中浓度(EC50)。马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯的敏感基线为(0.0418±0.0235μg·mL-1)，按照“马铃薯晚疫病菌抗药性检测技术规程(DB13FF1420—2011)”的分级标准划分晚疫病菌菌株对吡唑醚菌酯的敏感型，1级，敏感菌株：抗性倍数≤敏感基线的95％置信限上限/敏感基线；2级，低抗菌株：敏感基线的95％置信限上限/敏感基线＜抗性倍数≤100；3级，中抗菌株：100＜抗性倍数≤500；4级，高抗菌株：抗性倍数＞500。抗性倍数＝抗性菌株的EC50/敏感亲本菌株的EC50。
结果见表1。
表1 12株马铃薯晚疫病菌菌株对吡唑醚菌酯的敏感性
Figure BDA0002792401280000061
实施例2、马铃薯晚疫病菌中Cytb基因和Cytb蛋白突变位点的发现
1、菌株：4株马铃薯晚疫病菌敏感菌株，菌株编号为WY2、SCYB7、WG8、ND9；8株马铃薯晚疫病菌抗性菌株，菌株编号为WY2-R1、WY2-R13、WY2-R21、WY2-R24、WY2-R29、WY2-R31、WY2-R43、WY2-R49。
2、实验步骤如下：
(1)菌株培养
配制RSA培养基，于18℃培养马铃薯晚疫病菌菌株。将预培养的马铃薯晚疫病菌敏感菌株和抗性菌株接种在铺有玻璃纸的RSA培养基上，18℃黑暗培养7～10d后收集菌丝，用于提取基因组DNA。
(2)参照新型植物基因组DNA提取试剂盒(康为世纪，CW0531)说明书提取基因组DNA。
(3)马铃薯晚疫病菌敏感菌株和抗性菌株Cytb基因片段扩增、测序和比对分析
分别以提取的敏感菌株WY2、SCYB7、WG8、ND9和抗性菌株WY2-R1、WY2-R13、WY2-R21、WY2-R24、WY2-R29、WY2-R31、WY2-R43、WY2-R49基因组DNA为模板，采用引物SEQ ID NO：3：Cytb(86-887)-F(TTGGATTCGGTTCGTTAGCC)和SEQ ID NO：4：Cytb(86-887)-R(CCGAACATTGCAACAACTCC)扩增Cytb基因片段。
PCR反应体系(20μL)如下：
Figure BDA0002792401280000071
PCR扩增程序为：
Figure BDA0002792401280000072
将扩增产物用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，纯化回收。PCR扩增得到的Cytb基因片段长度为802bp，为SEQ ID NO：5中86～887位核苷酸。
将以敏感菌株WY2、SCYB7、WG8、ND9和抗性菌株WY2-R1、WY2-R13、WY2-R21、WY2-R24、WY2-R29、WY2-R31、WY2-R43和WY2-R49基因组DNA为模板扩增获得的802bp Cytb基因片段进行测序，通过DNAMAN软件分析比对序列。结果显示：敏感菌株中SEQ ID NO：5所示Cytb基因自5’末端起第406位核苷酸为G纯合，SEQ ID NO：6所示Cytb蛋白自N端起第136位氨基酸为纯合的甘氨酸；抗性菌株中SEQ ID NO：5所示Cytb基因自5’末端起第406位核苷酸为A纯合，SEQ ID NO：6所示Cytb蛋白自N端起第136位氨基酸为纯合的精氨酸(图1A、B)。因此可以说明，406位核苷酸突变与马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯的抗性相关。
实施例3、检测马铃薯晚疫病菌中Cytb基因突变位点的方法
1、供试菌株：4株马铃薯晚疫病菌敏感菌株，菌株编号为WY2、SCYB7、WG8、ND9；8株马铃薯晚疫病菌抗性菌株，菌株编号为WY2-R1、WY2-R13、WY2-R21、WY2-R24、WY2-R29、WY2-R31、WY2-R43、WY2-R49。
2、AS-PCR检测方法
(1)引物设计
本方法上游引物的最后一个碱基与突变体一致，倒数第二个碱基同时也进行改变，并结合不同的退火温度进行PCR扩增，提高引物特异性。引物设计见表2。
表2 AS-PCR检测马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯抗性中使用的引物
SEQ ID 引物名称 引物序列
- Cytb-136-F1 TGGGTTATGTTTTACCTTGGA
- Cytb-136-F2 TGGGTTATGTTTTACCTTGAA
- Cytb-136-F3 TGGGTTATGTTTTACCTTGTA
NO：1 Cytb-136-F4 TGGGTTATGTTTTACCTTGCA
NO：2 Cytb-136-R GACATTGTCCAATCCAACCTAAT
(2)参照新型植物基因组DNA提取试剂盒(康为世纪，CW0531)说明书提取供试菌株基因组DNA。
(3)PCR扩增
PCR反应体系(25μL)如下：
Figure BDA0002792401280000081
PCR扩增程序为：
Figure BDA0002792401280000082
(4)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳
引物对Cytb-136-F1/R、Cytb-136-F2/R、Cytb-136-F3/R和Cytb-136-F4/R在退火温度为50～64℃时均能从敏感菌株和抗性菌株中扩增得到639bp产物条带，在退火温度为66℃时均不能从敏感菌株中扩增得到条带。Cytb-136-F4/R在退火温度为66℃时能够从抗性菌株中扩增得到比较明亮的639bp产物条带，扩增产物为SEQ ID NO：5中386～1024位核苷酸(图2A)。
(5)检测突变位点
以待测马铃薯晚疫病菌基因组DNA为模板，用引物对Cytb-136-F4和Cytb-136-R进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。如果从菌株基因组DNA中扩增得到639bp产物片段，则判定所述菌株为抗性菌株；若不能扩增得到片段，则判定所述菌株为敏感菌株。
PCR扩增体系与试验中一致，退火温度设置为试验中64℃和66℃的中间值，即65℃。
选取敏感菌株WY2、SCYB7、WG8、ND9和抗性菌株WY2-R1、WY2-R13、WY2-R21、WY2-R24、WY2-R29、WY2-R31、WY2-R43、WY2-R49基因组DNA为模板，用引物对Cytb-136-F4和Cytb-136-R在65℃退火温度下进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果表明：退火温度为65℃时，PCR扩增效果同上述试验中退火温度为66℃时扩增效果相同，即仅能从抗性菌株中扩增得到639bp产物条带，不能从敏感菌株中扩增得到条带(图2B)。因此采用引物对Cytb-136-F4和Cytb-136-R，在退火温度为65℃时可以有效检测对吡唑醚菌酯产生抗性的马铃薯晚疫病菌菌株。
3、CAPS检测方法
马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯敏感菌株和抗性菌株Cytb基因序列比对结果表明，敏感菌株中不具有BsmAI酶切位点，406位核苷酸突变导致抗性菌株中增加了一个BsmAI酶切位点。即敏感菌株中BsmAI酶切位点数量为0，抗性菌株中BsmAI酶切位点数量为1(图3A)。BsmAI酶切的识别位点为“GTCTC(1/5)^”。
马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯敏感菌株和抗性菌株Cytb基因序列比对结果表明，敏感菌株中具有1个BsmFI酶切位点，406位核苷酸突变导致抗性菌株中失去了所述BsmFI酶切位点。即敏感菌株中BsmFI酶切位点数量为1，抗性菌株中BsmFI酶切位点数量为0(图4A)。BsmFI酶切的识别位点为“GGGAC(10/14)^”。
(1)参照新型植物基因组DNA提取试剂盒(康为世纪，CW0531)说明书提取基因组DNA。
(2)以取得的基因组DNA作为模板，采用引物SEQ ID NO：3：Cytb(86-887)-F(TTGGATTCGGTTCGTTAGCC)和SEQ ID NO：4：Cytb(86-887)-R(CCGAACATTGCAACAACTCC)扩增Cytb基因片段。
PCR反应体系(20μL)如下：
Figure BDA0002792401280000091
PCR扩增程序为：
Figure BDA0002792401280000101
将扩增产物用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳并纯化回收。
(3)将纯化回收的Cytb基因片段进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳。
酶切体系甲：PCR扩增产物3.0μL，限制性内切酶BsmAI 0.5μL(2.5U)，10×CutSmart Buffer 2.0μL，ddH2O 14.5μL。酶切反应条件：55℃水浴锅中酶切15分钟。从电泳图来看，对于采用酶切体系甲酶切后的产物，吡唑醚菌酯敏感菌株均只显示一条802bp条带，吡唑醚菌酯抗性菌株均显示314bp和488bp两条条带(图3B)。
酶切体系乙：PCR扩增产物3.0μL，限制性内切酶BsmFI 0.5μL(1U)，10×CutSmartBuffer 2.0μL，ddH2O 14.5μL。酶切反应条件：65℃水浴锅中酶切1个小时，然后80℃水浴锅中放置20分钟使酶失活。从电泳图来看，对于采用酶切体系乙酶切后的产物，吡唑醚菌酯敏感菌株均显示334bp和468bp两条条带，吡唑醚菌酯抗性菌株均只显示一条802bp条带(图4B)。
结果表明，利用限制性内切酶BsmAI或者BsmFI，CAPS检测方法能够准确鉴定出对吡唑醚菌酯的敏感菌株和抗性菌株，可以用于马铃薯晚疫病菌对吡唑醚菌酯抗性菌株的检测。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 河北省农林科学院植物保护研究所
<120> 快速鉴定马铃薯晚疫病菌Cytb基因核苷酸点突变及其对吡唑醚菌酯抗性的方法
<130> GNCYX202717
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggttatgt tttaccttgc a 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacattgtcc aatccaacct aat 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttggattcgg ttcgttagcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgaacattg caacaactcc 20
<210> 5
<211> 1152
<212> DNA
<213> 致病疫霉（Phytophthora infestans）
<220>
<221> misc_feature
<222> (406)
<223> y=g或a
<400> 5
atgagatgga acaaaaaatc attatttgca gttattaata atcatttaat agattatcct 60
actcctatta atttaaatta tttttttgga ttcggttcgt tagccggtat tatgttagta 120
gtacaaattt taactggtat ttttttagca atgcattata caccacatat cgatttagct 180
tttaatagtg ttgaacatat tatgagagat gttaataatg gttggttaat tagatataca 240
catgcaaatg gagcttcttt tttttttatt gtagtataca tacatatttt tagaggttta 300
tattatggtt cttatataac accgagagaa gctatatggt gctcaggtgt aattattttt 360
attttaatga tggctactgc ttttatgggt tatgttttac cttggygaca aatgagtttt 420
tggggtgcaa ctgttattac taatttattt tctgcaatcc ctttaatagg taaagatatt 480
gttgattggt tatggggagg ttttgctgtt gataatccaa cattaaatcg tttttttagt 540
ttacatttta ctcttccttt tataatagta ggtgctgtat tagttcactt aattttatta 600
catgaagttg gttctaataa tccattaggt attacattaa aaactgaaaa tatacctttt 660
tacccttatt tttatacaaa agatttattc ggtttaatgg ttttattttt agttttcttt 720
atttttgttt tttattatcc aaatacttta ggtcatccag ataattatat tgaagcaaat 780
ccaatgaaaa cacctttaca tattgttcct gaatggtatt tcttaccttt ttatgcaatt 840
ttaagatcta ttcctaataa aattggtgga gttgttgcaa tgttcggttc attaataatt 900
ttattaacta taccttttac aaactcatct gaaattagaa gtacagcttt tagacctatt 960
tttaaagttt gttattggtt attagttata gctttcttaa tattaggttg gattggacaa 1020
tgtccagttg aatatcctta tactgaaatt ggtattataa gtatgattta ttattttttt 1080
ttttttatca taattatacc atttttaggt aaatttgaag catatttagt acgttatagt 1140
attaataaat aa 1152
<210> 6
<211> 383
<212> PRT
<213> 致病疫霉（Phytophthora infestans）
<220>
<221> VARIANT
<222> (136)
<223> Gly为Arg
<400> 6
Met Arg Trp Asn Lys Lys Ser Leu Phe Ala Val Ile Asn Asn His Leu
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Pro Thr Pro Ile Asn Leu Asn Tyr Phe Phe Gly Phe Gly
20 25 30
Ser Leu Ala Gly Ile Met Leu Val Val Gln Ile Leu Thr Gly Ile Phe
35 40 45
Leu Ala Met His Tyr Thr Pro His Ile Asp Leu Ala Phe Asn Ser Val
50 55 60
Glu His Ile Met Arg Asp Val Asn Asn Gly Trp Leu Ile Arg Tyr Thr
65 70 75 80
His Ala Asn Gly Ala Ser Phe Phe Phe Ile Val Val Tyr Ile His Ile
85 90 95
Phe Arg Gly Leu Tyr Tyr Gly Ser Tyr Ile Thr Pro Arg Glu Ala Ile
100 105 110
Trp Cys Ser Gly Val Ile Ile Phe Ile Leu Met Met Ala Thr Ala Phe
115 120 125
Met Gly Tyr Val Leu Pro Trp Gly Gln Met Ser Phe Trp Gly Ala Thr
130 135 140
Val Ile Thr Asn Leu Phe Ser Ala Ile Pro Leu Ile Gly Lys Asp Ile
145 150 155 160
Val Asp Trp Leu Trp Gly Gly Phe Ala Val Asp Asn Pro Thr Leu Asn
165 170 175
Arg Phe Phe Ser Leu His Phe Thr Leu Pro Phe Ile Ile Val Gly Ala
180 185 190
Val Leu Val His Leu Ile Leu Leu His Glu Val Gly Ser Asn Asn Pro
195 200 205
Leu Gly Ile Thr Leu Lys Thr Glu Asn Ile Pro Phe Tyr Pro Tyr Phe
210 215 220
Tyr Thr Lys Asp Leu Phe Gly Leu Met Val Leu Phe Leu Val Phe Phe
225 230 235 240
Ile Phe Val Phe Tyr Tyr Pro Asn Thr Leu Gly His Pro Asp Asn Tyr
245 250 255
Ile Glu Ala Asn Pro Met Lys Thr Pro Leu His Ile Val Pro Glu Trp
260 265 270
Tyr Phe Leu Pro Phe Tyr Ala Ile Leu Arg Ser Ile Pro Asn Lys Ile
275 280 285
Gly Gly Val Val Ala Met Phe Gly Ser Leu Ile Ile Leu Leu Thr Ile
290 295 300
Pro Phe Thr Asn Ser Ser Glu Ile Arg Ser Thr Ala Phe Arg Pro Ile
305 310 315 320
Phe Lys Val Cys Tyr Trp Leu Leu Val Ile Ala Phe Leu Ile Leu Gly
325 330 335
Trp Ile Gly Gln Cys Pro Val Glu Tyr Pro Tyr Thr Glu Ile Gly Ile
340 345 350
Ile Ser Met Ile Tyr Tyr Phe Phe Phe Phe Ile Ile Ile Ile Pro Phe
355 360 365
Leu Gly Lys Phe Glu Ala Tyr Leu Val Arg Tyr Ser Ile Asn Lys
370 375 380

Claims (6)

1.一种检测马铃薯晚疫病菌中Cytb基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：
以待测马铃薯晚疫病菌基因组DNA为模板，用序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对进行PCR扩增，若能扩增出639 bp产物条带，则所述马铃薯晚疫病菌中Cytb基因存在突变位点；
所述PCR扩增中，退火温度为65℃；
所述突变位点指马铃薯晚疫病菌中Cytb基因自5’末端起第406位核苷酸为A纯合，由此导致Cytb蛋白自N端起第136位氨基酸为纯合的精氨酸。
2.一种检测马铃薯晚疫病菌中Cytb基因是否存在突变位点的引物对，由序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示DNA分子组成；
所述突变位点指马铃薯晚疫病菌中Cytb基因自5’末端起第406位核苷酸为A纯合，由此导致Cytb蛋白自N端起第136位氨基酸为纯合的精氨酸。
3.一种检测马铃薯晚疫病菌中Cytb基因是否存在突变位点的方法，为方法甲或方法乙；
所述方法甲包括如下步骤：
以待测马铃薯晚疫病菌基因组DNA为模板，用序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物对进行PCR扩增，扩增得到802 bp的Cytb基因片段，对所述Cytb基因片段用BsmAI进行酶切，如果酶切产物中含有314 bp和488 bp两个片段，则所述马铃薯晚疫病菌中Cytb基因片段存在突变位点；如果酶切产物仍为802 bp，则所述马铃薯晚疫病菌中Cytb基因片段不含有突变位点；
所述方法乙包括如下步骤：
以待测马铃薯晚疫病菌基因组DNA为模板，用序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物对进行PCR扩增，扩增得到802 bp的Cytb基因片段，对所述Cytb基因片段用BsmFI进行酶切，如果酶切产物仍为802 bp，则所述马铃薯晚疫病菌中Cytb基因片段存在突变位点；如果酶切产物中含有334 bp和468 bp两个片段，则所述马铃薯晚疫病菌中Cytb基因片段不含有突变位点；
所述PCR扩增中，退火温度为58℃；
所述突变位点指马铃薯晚疫病菌中Cytb基因自5’末端起第406位核苷酸为A纯合，由此导致Cytb蛋白自N端起第136位氨基酸为纯合的精氨酸。
4.权利要求1或3所述方法或者权利要求2所述引物对在鉴定马铃薯晚疫病菌抗药性中应用；所述抗药性为对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的抗性。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为吡唑醚菌酯。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：具有所述突变位点的马铃薯晚疫病菌具有抗药性。
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