CN112322547A - 来自海洋的假交替单胞菌hl9及其产磷脂酶b的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种来自海洋的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）HL9，其菌种保藏号为CGMCC NO.20408。本发明还公开了利用假交替单胞菌HL9产磷脂酶B的方法，将假交替单胞菌HL9接种到种子培养基中，转数180rpm，装液量20%，25℃培养9h得到种子液；种子液接种于产酶培养基中，180rpm，25℃培养48h，8000rpm离心30min，取上清液即得磷脂酶B粗酶。本发明菌株HL9革兰氏阴性杆菌，无鞭毛，无荚膜，在25℃时菌株HL9生长的最好，在pH为8时生长的最好。菌株HL9产酶方法简单，所产的酶适合作用pH为7.5。在pH7‑8时保持较高活性。

Description

来自海洋的假交替单胞菌HL9及其产磷脂酶B的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种分离自中国黄海深49米处海泥的海洋假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）HL9；本发明还公开了交替单胞菌HL9株产磷脂酶B的方法与应用。

背景技术

磷脂酶是指能够特异性水解底物磷脂不同酯键的一类水解酶的统称，可广泛的应用于医药，油脂精炼，磷脂改性，食品加工等。

磷脂酶根据作用底物位置的不同可以分为磷脂酶A1，磷脂酶A2，磷脂酶B，磷脂酶C，磷脂酶D。其中磷脂酶B能够水解 Sn-1 及 Sn-2 的酰基，释放出溶血磷脂和两个脂肪酸。与此同时还具有溶血磷脂酶和转酰基酶活性。研究发现，磷脂酶B在人体和动物的表皮细胞、细菌和真菌中大量存在。对于磷脂酶B的研究在国内有些已经开始朝着基因重组表达方向上研究，但依然有研究者在筛选新的产磷脂酶B菌株，以期筛选到性质更佳的磷脂酶B。目前，磷脂酶B已被应用在各个行业。在油脂精炼方面，磷脂酶B在脱胶上起着关键性作用，可以有效地将非水合磷脂转化为相应的水合形式，通过离心进行分离和去除。与传统脱胶方法相比，减少了化学药品的消耗，同时也产生很少的废物。在有价值的磷脂衍生物的生产方面也有着不可忽视的作用。 除此之外，磷脂酶B还被应用于医药与化妆品行业。

因此，研究可以产磷脂酶的新的菌株具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产磷脂酶B的来自海洋的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）HL9。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述来自海洋的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）HL9的产磷脂酶B的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。

本发明的特征包括假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.）HL9菌株本身以及利用该菌株生产磷脂酶B的方法。

本发明所涉及的菌株HL9是在中国黄海深49米处海泥中分离到的假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.）HL9，该菌株已于2020年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.20408，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话：010-64807355。

本发明所述来自海洋的假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.）HL9产磷脂酶B的方法，其步骤如下：

（1）将假交替单胞菌HL9接种到种子培养基中，转数180rpm，装液量20%，25℃培养9h得到种子液；

（2）将种子液以2% 的接种量接种于产酶培养基中，180rpm，25℃培养48h，8000rpm离心30min，取上清液即得磷脂酶D粗酶；

种子培养基的组成为：葡萄糖10 g·L^-1，胰蛋白胨10 g·L^-1，陈海水，pH8；

产酶培养基的组成为：10 g· L^-1麸皮和5 g· L^-1鱼粉蛋白胨，NaCl为20 g· L^-1，pH8.0。

本发明菌株具有以下特征：假交替单胞菌HL9（Pseudoalteromonassp.）为革兰氏阴性杆菌；在含有蛋黄卵磷脂的固体培养基上的菌落特征：表面光滑，湿润、边缘整齐、白色不透明菌落；该菌株不能够利用大部分糖醇，精氨酸脱酸酶，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶，苯丙氨酸脱羧酶，氧化酶等试验，呈阳性。

菌株的生长特性为：假交替单胞菌HL9的生长适应于大部分碳源和有机氮源，在无机氮源下几乎不生长，生长温度范围为20-40℃，生长pH范围为6-9，生长的NaCl浓度范围为5g·L^-1-100 g·L^-1。假交替单胞菌HL9最适生长温度为25℃，最适生长pH为8.0，最适生长NaCl为30 g·L^-1。

假交替单胞菌HL9所产磷脂酶B的理化性质为：磷脂酶B的适合作用温度为45℃，在30℃-60℃时该酶有催化活性。在55℃时仍有50%的活性。该酶适合作用pH为7.5, 在pH7-8之间酶活性较稳定。Ca²⁺ ，Co²⁺， Mn²⁺，等金属离子对酶活性有促进作用，Ni²⁺，Mg²⁺等对酶活性有抑制作用。有机溶剂对酶活性有抑制作用，但抑制作用不大，残余酶活力基本上都保持在80%以上。

本发明产磷脂酶B将其运用于水解卵磷脂，条件包括温度，pH对水解卵磷脂的影响；然后再用TLC和气相色谱的方法对水解卵磷脂的产物进行分析。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明是在中国黄海深49米处海泥中分离到的海洋细菌假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.）HL9，菌株HL9革兰氏阴性杆菌，无鞭毛，无荚膜。在含有蛋黄卵磷脂的固体培养基中，能产生透明圈；不能够利用大部分糖醇，精氨酸脱酸酶，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶，苯丙氨酸脱羧酶，氧化酶等试验，呈阳性。在25℃时菌株HL9生长的最好，在pH为8时生长的最好。菌株HL9产酶方法简单，所产的酶适合作用pH为7.5。在7-8时保持较高活性。

附图说明

图1为菌株形态图；

图2为菌株扫描电镜图；

图3为菌株HL9系统进化树图；

图4为碳源对菌株HL9生长的影响图；

图5为氮源对菌株HL9生长的影响图；

图6为温度对菌株HL9生长的影响图；

图7为初始pH对菌株HL9生长的影响图；

图8为NaCl浓度对菌株HL9生长的影响图；

图9为碳源对菌株HL9产酶的影响图；

图10为氮源对菌株HL9产酶的影响图；

图11为碳源添加量对菌株HL9产酶的影响图；

图12为氮源添加量对菌株HL9产酶的影响图；

图13为初始pH对菌株HL9产酶的影响图；

图14为发酵温度对菌株HL9产酶的影响图；

图15为接种量对菌株HL9产酶的影响图；

图16为NaCl浓度对菌株HL9产酶的影响图；

图17为发酵时间对菌株HL9产酶的影响图；

图18为酶作用温度对酶活的影响图；

图19为酶作用pH对酶活的影响图；

图20为酶水解产物TLC图； 图中：1：磷脂酰胆碱标准物质；2:磷脂酸标准物质；3:溶血磷脂酰胆碱标准物质；4：软脂酸标准物质；5：空白不反应产物；6：反应产物；

图21为水解产物气相色谱图；

注：图4，5，9，10中的差异显著性分析来自SPSS中的S-N-K（S）。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）HL9菌株的筛选：

1、菌株HL9的筛选方法

1.1培养基：

富集培养基：蛋黄卵磷脂1 g·L^-1，陈海水，pH自然。

分离培养基：蛋黄卵磷脂2 g·L^-1，琼脂20 g·L^-1，陈海水，pH自然。

基础发酵培养基：酵母粉10 g·L^-1，葡萄糖10 g·L^-1，陈海水，pH8。

种子培养基：葡萄糖10 g·L^-1，胰蛋白胨10 g·L^-1，陈海水，pH8。

硼砂卵黄固体培养基：硼酸10.9 g·L^-1，硼砂1.9 g·L^-1，琼脂粉20 g·L^-1，蛋黄20 g·L^-1，pH7.2～7.4。

1.2菌株的筛选方法

将从中国黄海深49米处采集的泥样取1g接入50mL富集培养基中 ，30℃,180rpm,摇瓶活化培养24h,将富集培养液稀释到1～10^-7分离涂布到分离培养基上，挑选带有透明圈的菌落，纯化保藏。

2、菌株HL9的形态特征与生理生化特征。

2.1形态特征：

菌株HL9革兰氏阴性杆菌（见图1），菌株HL9无芽孢，无鞭毛，无荚膜。在含有蛋黄卵磷脂的固体培养基中，能产生透明圈（见图2）。

2.2 生理生化特征：

该菌株不能够利用大部分糖醇，精氨酸脱酸酶，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶，苯丙氨酸脱羧酶，氧化酶等试验，呈阳性。部分生理生化结果见表1。

表1 菌株HL9的生理生化特征

注：“＋”为阳性，“－”为阴性。OF：分为发酵型细菌，氧化型细菌，不利用糖类细菌。

2.3 菌株HL9的分子生物学鉴定

杭州宝赛试剂盒提取菌株HL9的基因组，选用扩增原核微生物16S rDNA序列的通用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGCTT-3’）。反应体系：总体系20μL，DNA模板2μL，10×PCR Buffer 2μL，前后引物各0.5μL，dNTP 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，补 ddw 至14.3μL。扩增条件：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸 1.5 min，30个循环；72 ℃延伸 5min，4 ℃保存。将提取的DNA送至华大基因测序，将测得序列互补反向拼接，获得1401bp的碱基片段序列。将菌株HL9的16S rDNA基因序列提交GenBank数据库，通过16S rDNA序列同源性比较，可以初步确定该菌株为假交替单胞菌属HL9（Pseudoalteromonassp.）。将亲缘关系较近的菌株16S rDNA运用MEGA软件进行多重比较，用中邻接法（Neibor-joing method）建系统进化树，从进化树表明菌株HL9与Pseudoalteromonassp.亲缘关系最近。见图3。

3、菌株HL9的生长特性

菌株HL9，对其生长特性进行了细致的研究，获得了该菌株的生长条件。

3.1 种子液的制备：将菌株HL9斜面种子接种到种子培养基中，30℃，180rpm，装液量20%，培养9h。

3.2碳源对菌株HL9生长的影响

将菌株按3%的接种量接种到采用不同的10 g·L^-1的碳源（葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，乳糖，可溶性淀粉，马铃薯淀粉，玉米粉，大麦粉，米糠，麸皮，糊精），胰蛋白胨10 g·L^-1，陈海水，pH自然的培养基中，30℃,180rpm，摇床培养14h。于OD600 nm测菌体浓度。菌株HL9菌对多种碳源适应，最适碳源为葡萄糖，考虑到成本问题最终选择价廉易得的米糠作为菌株的最适碳源。见图4。

3.3氮源对菌株HL9生长的影响

将菌株按3%的接种量接种到采用不同的10 g·L^-1的氮源（胰蛋白胨，鱼粉蛋白胨，大豆蛋白胨，酵母粉，花生粉，羽毛粉，干酪素，尿素，硫酸铵，氯化铵，硝酸钠），米糠10 g·L^-1，陈海水，pH自然的培养基中，30℃,180rpm，摇床培养14h。于OD600 nm测菌体浓度。菌株HL9对有机氮源比较适应，最适生长氮源为酵母粉，在无机氮源下几乎不生长。最终选择酵母粉作为生长氮源。见图5。

3.4温度对菌株HL9生长的影响

将菌株按3%的接种量接种到含米糠10 g·L^-1，酵母粉10 g·L^-1，陈海水，pH自然的培养基中。采用不同温度（20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃）,180rpm，摇床培养14h。于OD600nm测菌体浓度。菌株HL9在20℃-40℃生长良好，在45℃时菌株不生长。在25℃时菌株HL9生长的最好，故选择25℃为最适生长温度。见图6。

3.5初始pH对菌株HL9生长的影响

将菌株按3%的接种量接种到由米糠10 g·L^-1，酵母粉10 g·L^-1，自来水，30 g·L^-1NaCl组成的培养基中。培养基pH用不同的10mmol·L^-1的缓冲液（MES,PIPES,HIPES)进行调节（pH为5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9, 10, 11）。25℃，180rpm，摇瓶培养14h。菌株HL9在pH为6-9时生长良好，在pH为8时生长的最好，但在pH为5-5.5和10-11之间时不生长。见图7。

3.6 NaCl对菌株HL9生长的影响

将菌株按3%的接种量接种到由米糠汁10 g·L^-1，酵母粉10 g·L^-1，自来水，不同浓度的NaCl的培养基中，pH为8.0。25℃，180rpm，摇瓶培养14h。菌株HL9在NaCl为5 g·L^-1-100g·L^-1范围内生长良好，其中在30 g·L^-1的时候菌株HL9生长的最好，在不添加NaCl的培养基里不生长。见图8。

4、菌株HL9产磷脂酶B的方法

4.1碳氮源对菌株HL9产酶的影响

碳源：10 g·L^-1碳源（葡萄糖，蔗糖，可溶性淀粉，马铃薯淀粉，蛋黄卵磷脂，米糠，麸皮，糊精）和氮源：10 g·L^-1氮源（胰蛋白胨,鱼粉蛋白胨，大豆蛋白胨，酵母粉，羽毛粉，花生粉，干酪素，尿素，硫酸铵）用于替换基础发酵培养基中的酵母粉和葡萄糖，接种后在30℃摇床培养48h后分别用硼砂卵黄平板法测磷脂酶B活力。结果表明，麸皮与葡萄糖在所选的碳源中，促进产磷脂酶B的能力比较好，而鱼粉蛋白胨，大豆蛋白胨在所选的氮源中，促进产磷脂酶B的能力也较为可观。见图9-10。最终选用10 g·L^-1麸皮和10 g·L^-1鱼粉蛋白胨作为产酶培养基的碳氮源。

4.2碳氮源添加量对菌株HL9产酶的影响

碳源：麸皮（5 g·L^-1，10 g·L^-1，15 g·L^-1，20 g·L^-1，25 g·L^-1，30 g·L^-1，40 g·L^-1）和氮源：鱼粉蛋白胨（5 g·L^-1，10 g·L^-1，15 g·L^-1，20 g·L^-1，25 g·L^-1，30 g·L^-1，40g·L^-1）用于替换培养基中10 g·L^-1麸皮和10 g·L^-1鱼粉蛋白胨，接种后在30℃摇床培养48h后分别用硼砂卵黄平板法测磷脂酶B活力。结果表明，10 g·L^-1麸皮和5 g·L^-1鱼粉蛋白胨产磷脂酶B效果较好。见图11-12。最终选用10 g·L^-1麸皮和5 g·L^-1鱼粉蛋白胨作为产酶培养基的碳氮源浓度。

4.3培养基初始pH对菌株HL9产酶的影响

以3%接种量接种至不同初始pH（6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5）的发酵培养基，于30℃培养48h后分别用硼砂卵黄平板法测磷脂酶B活力。结果表明，菌株HL9在pH7-9范围内产磷脂酶B效果较好，在pH为8.0时产磷脂酶B效果最好。见图13故最终选用pH8.0为发酵培养基的初始pH。

4.4发酵温度对菌株HL9产酶的影响

以3%接种量接种至发酵培养基中，摇床180rpm,温度（15℃，20℃，25℃,30℃，35℃，40℃，45℃）培养48h后分别用硼砂卵黄平板法测磷脂酶B活力。结果表明，从15℃-25℃产酶效果一直呈上升趋势，在25℃时达到最佳。随后开始降低，在40℃时不产酶。见图14。故选用25℃为菌株HL9的发酵产酶温度。

4.5接种量对菌株HL9产酶的影响

将活化好的菌株以不同的接种量接到发酵培养基中，摇床180rpm，25℃培养48h后分别用硼砂卵黄平板法测磷脂酶B活力。结果表明，在接种量为2%时产酶较好。见图15。

4.6 NaCl浓度对菌株HL9产酶的影响

以2%的接种量接种到含有不同浓度NaCl的培养基中，摇床180rpm，25℃培养48h后分别用硼砂卵黄平板法测磷脂酶B活力。结果表明，在NaCl浓度为20 g·L^-1时产酶较好，在NaCl浓度范围为30-80 g·L^-1时产酶平稳。NaCl浓度为90 g·L^-1时产酶能力开始下降。见图16。

4.7发酵时间对菌株HL9产酶的影响

以2%的接种量接种到发酵培养基中，摇床180rpm，25℃培养。从12h起每隔6h取样一次，分别用硼砂卵黄平板法测磷脂酶B活力。结果表明，从12h起产酶量逐步递增，一直到48h。48h后产酶能力开始下降。见图17。

5菌株HL9磷脂酶B的性质

5.1粗酶液的制备

将菌株HL9（Pseudoalteromonassp.）菌株接种到种子培养基中，180rpm，装液量20%，25℃培养9h，得种子液以3%的接种量至发酵培养基中，180rpm，25℃培养48h后，将酶液8000rpm离心30min，取上清液，4℃保藏备用。

5.2酶作用温度对酶活性的影响

将100μL待测液置于等距放置在硼砂卵黄平板上的牛津杯中，不同温度（30℃，35℃，40℃，45℃，50℃ ，55℃, 60℃）下温育 ，所产生的晕圈的大小即代表酶活力的高低。结果表明，磷脂酶B在30-60℃之间均有催化活性，在45℃时催化活性较好。见图18。

5.3酶的作用pH对酶活性的影响

用50 mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0-6.0)、50 mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0-7.5)和50 mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5-9.0)将硼砂卵黄平板中培养基的pH调至（4, 5, 5.5, 6，7，7.5，8，9），再将100μL待测液置于等距放置在硼砂卵黄平板上的牛津杯中，45℃温育，所产生的晕圈的大小即代表酶活力的高低。结果表明，该酶适合作用pH为7.5。在7-8时保持较高活性。图19。

5.4金属离子对酶的作用

将（ Ca²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Si²⁺，Zn²⁺，Ba²⁺，Fe³⁺，K⁺，Cu²⁺）等离子盐按1mM浓度添加到硼砂卵黄培养基中。取100μL的待测液置于等距放置在硼砂卵黄平板上的牛津杯中，45 ℃温育，所产生的晕圈的大小即代表酶活力的高低。如表2所示，Ca²⁺ ，Co²⁺， Mn²⁺，Si²⁺，Zn²⁺，Ba²⁺对酶活性有促进作用，Ni²⁺，Mg²⁺，Fe³⁺，K⁺，Cu²⁺对酶活性有抑制作用。

表2 金属离子对磷脂酶B稳定性的影响

5.5有机溶剂对酶的影响

将有机溶剂与酶液，缓冲液按1:2:7的比例混合。取100μL的待测液置于等距放置在硼砂卵黄平板上的牛津杯中，45 ℃温育。结果表明，有机溶剂对酶活性有抑制作用。但抑制作用不大，残余酶活力基本上都保持在80%以上。

表3 有机溶剂对磷脂酶B稳定性的影响

5.6磷脂酶B酶活测定

采用硼砂卵黄平板牛津杯法初步测定酶活大小。将用缓冲液稀释过5倍的粗酶液置于等距离放置在硼砂卵黄平板上的牛津杯中，45℃温育24 h，所产生的晕圈的大小即为酶活力大小。

5.7 水解产物TLC和气相色谱分析

将0.25 mL的卵磷脂（5 mg/mL）加入1 mL 粗酶液，30 ℃恒温摇床180 rpm孵育12 h，加入0.5 mL EDTA （50 mmol/L）和5 mL 三氯甲烷 －甲醇( 体积比2∶1) 混合液，剧烈振荡后静置分层，取出有机相真空蒸发得到的白色残留物，加 0.2 mL 三氯甲烷 －甲醇( 体积比1∶1) 混合液溶解，用来做薄层层析用，薄层板采用 GF254 硅胶薄层板。展开剂为氯仿 －甲醇 －乙酸( 体积比40∶15∶6) ，用碘熏蒸显色。如图20所示，由菌株HL9筛选所得到的磷脂酶，其水解产物中有溶血磷脂酰胆碱，有与脂肪酸标准物质所代表的斑点在同一水平线上的脂肪酸，但难以判断水解的是Sn-1酰基还是Sn-2酰基。这说明筛选的磷脂酶可能为磷脂酶A1，A2或B。但具体的是磷脂酶A1还是A2，亦或是磷脂酶B，还需要进一步的研究。

采用0.25 mL（5 mg/mL）1－棕榈酰－2－油酰－Sn－甘油－3－磷脂酰胆碱与1 mL粗酶液，30 ℃恒温摇床180 rpm孵育12 h。将水解产物与软脂酸，油酸标准物质分别进行脂肪酸甲酯化。步骤如下：取水解产物1 mL，软脂酸，油酸各2 mg放置于具塞试管中，加入1 mL1%氢氧化钠甲醇溶液，震荡混匀，充1 min氮气。75 ℃水浴皂化15min，冷却至室温。加入2mL 5%盐酸甲醇溶液，震荡混匀，充1 min氮气。75 ℃水浴15 min进行甲酯化，冷却至室温。加入2 mL正己烷（色谱级）萃取。将待测液装入进样瓶中待测。色谱条件：DB-1毛细管色谱柱：30 m × 0.530 mm ×3 μm，载气为N2，进样量1 μl，流速2.5 mL/min，分流比 15 : 1，进样口温度 250 ℃，柱温从170 ℃以5 ℃/min 上升至 250 ℃，保持 28 min，检测器温度250 ℃。运用气相色谱定性分析，如图21所示，水解产物脂肪酸出峰时间有两个，分别与软脂酸，油酸的出峰时间相一致。这说明，筛选的磷脂酶可以同时水解Sn-1酰基和Sn-2酰基，筛选的磷脂酶为磷脂酶B。通过比对水解产物中软脂酸与油酸的峰面积，发现软脂酸占水解产物的29.33%。油酸占水解产物的70.67%。这说明筛选的磷脂酶B更多的是水解Sn-2酰基。

Claims (2)

1.一种来自海洋的假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）HL9，其特征在于：其菌种保藏号为CGMCC NO.20408。

2.一种如权利要求1所述来自海洋的假交替单胞菌HL9产磷脂酶B的方法，其特征在于，其步骤如下：

将假交替单胞菌HL9接种到种子培养基中，转数180rpm，装液量20%，25℃培养9h得到种子液；

（2）将种子液以2% 的接种量接种于产酶培养基中，180rpm，25℃培养48h，8000rpm离心30min，取上清液即得磷脂酶B粗酶；

种子培养基的组成为：葡萄糖10 g·L^-1，胰蛋白胨10 g·L^-1，陈海水，pH8；

产酶培养基的组成为：10 g· L^-1麸皮和5 g· L^-1鱼粉蛋白胨，NaCl为20 g· L^-1，pH8.0。

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