CN112305210A - 一种兽用三分类血细胞分析试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种兽用三分类血细胞分析试剂，包括稀释液、溶血剂和清洗液，所述稀释液的成分为抗凝剂、渗透压调节剂、分散剂、缓冲液A、pH值调节剂A和纯水；所述溶血剂的成分为缓冲液B、季铵盐、防腐剂、电导率调节剂和纯水，所述防腐剂为甲醛；所述清洗液的成分为无机盐、表面活性剂、碱性蛋白酶、pH值调节剂B和纯水。稀释液中添加了分散剂，有利于细胞形态的保持和分散，便于分类计数；溶血剂中添加了甲醛防腐剂，有利于血红蛋白的稳定，便于提高血红蛋白的测试精度；清洗液中添加了碱性蛋白酶，可以更好地溶解和清洗液路系统残留的污渍和血渍，有效减少堵孔现象的发生，提高循环测试精度。
Description
技术领域
本发明涉及一种医疗诊断仪器用试剂，具体涉及一种兽用三分类血细胞分析试剂及其制备方法。
背景技术
兽用血细胞分析在畜牧业的研究、养殖，宠物疾病的预防、治疗以及兽用实验研究方面，有很重要的价值，对兽用各种疾病的诊断是必不可少的。对红细胞及血红蛋白的检查，能查清贫血的病因；检测兽用的血小板数量能诊断出血性疾病。对白细胞总数及分类的检测能推断细菌性或病毒性炎症，也可诊断寄生虫感染性疾病和皮肤病。在我国，随着科学技术进步和社会经济条件的发展，兽用血细胞分析的应用越来越普遍。
目前，在我国对人血细胞的分析技术已经很成熟，特别是白细胞从三分类发展到五分类，完全实现了自动化，对血红蛋白的检测从含氰化物到无氰的试剂。但是，对兽用血细胞的自动化分析研究甚少，国内的血细胞分析仪生产厂家把人的血细胞分析仪及试剂直接应用到兽用血细胞分析上，这是很不科学的。在光学显微镜下观察，人和兽用之间的血细胞形态结构、大小差别很大，而且，不同种群的兽用之间也有很大的差别，因此，不能把人的血细胞分析仪和相应的试剂，直接应用到兽用血细胞分析上来，这样，就造成分析很不准确。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何满足兽用血细胞分析的精度的问题，提供了一种兽用三分类血细胞分析试剂及其制备方法。
为实现上述目的，本申请提供了一种兽用三分类血细胞分析试剂，包括稀释液、溶血剂和清洗液，所述稀释液的成分为抗凝剂、渗透压调节剂、分散剂、缓冲液A、pH值调节剂A和纯水；所述溶血剂的成分为缓冲液B、季铵盐、防腐剂、电导率调节剂和纯水，所述防腐剂为甲醛；所述清洗液的成分为无机盐、表面活性剂、碱性蛋白酶、pH值调节剂B和纯水。
作为本申请的进一步改进，所述甲醛的质量百分含量为0.1％～0.5％；所述溶血剂的电导率为11.0ms/cm～12.0ms/cm。
作为本申请的进一步改进，所述稀释液中：所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠，所述渗透压调节剂为氯化钠、氯化钾中的至少一种，所述分散剂为聚乙二醇400、甘油中的至少一种，所述缓冲液A为磷酸盐、硼酸盐、乙醇胺中的任意一种，所述pH值调节剂A为柠檬酸；所述溶血剂中：所述缓冲液B为硼砂、硼酸中的至少一种，所述电导率调节剂为硫酸钠，所述季铵盐为十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵中的任意一种；所述清洗液中：所述无机盐为氯化钠、氯化钾中的至少一种，所述表面活性剂为月桂醇聚氧乙烯醚，所述pH值调节剂B为乙醇胺。
作为本申请的进一步改进，所述分散剂为聚乙二醇400和甘油的组合，所述聚乙二醇400和甘油的组合分散剂的质量百分含量为0.2％～5％。
作为本申请的进一步改进，所述聚乙二醇400和甘油的组合分散剂中所述聚乙二醇400和所述甘油的质量比为1:7～1:30。
作为本申请的进一步改进，所述聚乙二醇400和甘油的组合分散剂中所述聚乙二醇400和所述甘油的质量比为1:15。
作为本申请的进一步改进，所述月桂醇聚氧乙烯醚和所述碱性蛋白酶的质量比为1:1～4:1。
作为本申请的进一步改进，所述季铵盐为十二烷基三甲基氯化铵，所述十二烷基三甲基氯化铵的质量百分含量为0.5％～5％。
为实现上述目的，本申请还提供了一种兽用三分类血细胞分析试剂的制备方法，如下：稀释液的制备步骤：依次将抗凝剂、渗透压调节剂、分散剂、缓冲液A、pH值调节剂A充分溶解到少量纯水中，混合均匀，定容，得到稀释液；溶血剂的制备步骤：依次将缓冲液B、季铵盐、防腐剂、电导率调节剂充分溶解到少量纯水中，混合均匀，定容，得到溶血剂；清洗液的制备步骤：依次将无机盐、表面活性剂、碱性蛋白酶、pH值调节剂B充分溶解到少量纯水中，混合均匀，定容，得到清洗液。
作为本申请的进一步改进，应用0.22μm的聚丙烯膜对所述稀释液、所述溶血剂和所述清洗液进行过滤。
本发明的有益效果在于，本申请提供了一种兽用三分类血细胞分析试剂，包括稀释液、溶血剂和清洗液，所述稀释液的成分为抗凝剂、渗透压调节剂、分散剂、缓冲液A、pH值调节剂A和纯水；所述溶血剂的成分为缓冲液B、季铵盐、防腐剂、电导率调节剂和纯水，所述防腐剂为甲醛；所述清洗液的成分为无机盐、表面活性剂、碱性蛋白酶、pH值调节剂B和纯水。稀释液中添加分散剂的作用是有利于细胞形态的保持和分散，便于分类计数；在所述溶血剂中添加甲醛防腐剂，不仅具有防腐功能，还有利于血红蛋白的稳定，有助于兽用血细胞的分类和血红蛋白的测试；所述的清洗液中添加了碱性蛋白酶，该碱性蛋白酶与表面活性剂的组合可以更好地溶解和清洗液路系统残留的污渍和血渍，有效减少堵孔现象的发生，提高循环测试精度。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
为了更精确的分析兽用血细胞，本申请提供了一种兽用三分类血细胞分析试剂，包括稀释液、溶血剂和清洗液，所述稀释液的成分为抗凝剂、渗透压调节剂、分散剂、缓冲液A、pH值调节剂A和纯水，所述稀释液的pH值范围控制在6～8之间，所述稀释液的电导率范围设置为18.0ms/cm～21.0ms/cm；所述溶血剂的成分为缓冲液B、季铵盐、防腐剂、电导率调节剂和纯水，所述防腐剂为甲醛；所述清洗液的成分为无机盐、表面活性剂、碱性蛋白酶、pH值调节剂B和纯水。优选的，所述分散剂为聚乙二醇400、甘油中的至少一种。
本申请的技术方案适用于各种兽类血细胞分析，如猪、狗、羊、猫、犬、猴等，为验证本申请技术方案的有益效果，本申请选取了两组物种兽用血液样本进行了分析，第一组物种为犬类，第二组物种为猫类，每组物种选取了11例动物血液样本进行分析，研究探索过程中，发明人选取了市面上常规的对兽用血细胞分析较稳定的IDEXX三分类血细胞试剂，应用IDEXX三分类血细胞分析仪对上述两组物种兽用血液样本进行了分析测试，测试的细胞种类主要有红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、白细胞(WBC)、淋巴细胞(LYM)、单核细胞(MONO)、粒细胞(GRAN)，得出了上述两组物种兽用血液样本的实际测量值，数据如表一所示。
表一：犬类和猫类血液样本的三分类血细胞分析
本申请中，兽用血细胞计数的关键一方面在于细胞形态的保持和分散，在稀释液中添加分散剂，有利于分散兽用血液中的各种细胞以及维持细胞形态，便于计数。为证明分散剂的有益效果，本申请中针对有无分散剂的稀释液以及含有不同种类分散剂的稀释液以犬类血液样本为案例进行了三分类血细胞分析空白计数测量，检测数据如表二所示，主要分析稀释液中红细胞、血红蛋白、血小板、白细胞及其三分类白细胞的数量。
表二：不同稀释液血细胞三分类分析测试结果
由表二可知，含有聚乙二醇或甘油分散剂的稀释液较不含分散剂的稀释液，在进行兽用血液样本三分类血细胞分析测试时，检测结果更接近实际测量值，因此，含有分散剂的稀释液对兽用血细胞的分散效果更好；从上表的检测数据可知，聚乙二醇和甘油均对兽用血液样本内血细胞具有很好的分散效果，由于聚乙二醇400是亲水的，可以很好的跟有较低亲水亲油平衡值(HLB value)的甘油形成稳定的分散体系，本发明中特别针对聚乙二醇400和甘油的组合分散剂进行了详细的研究，经实验验证，聚乙二醇400和甘油的组合分散剂更有利于细胞形态的保持和分散，便于分类计数，优选的，所述聚乙二醇400和所述甘油的组合分散剂的质量百分含量为0.2％～5％，在所述聚乙二醇400和甘油的组合分散剂中优选所述聚乙二醇400和所述甘油的质量比为1:7～1:30，且当聚乙二醇和甘油的质量比为1:15时，稀释液对兽用血液样本内血细胞的分散效果最好。
本申请中，为达到更好的分析兽用血细胞的目的，所述稀释液中：所述抗凝剂优选为乙二胺四乙酸二钠，所述乙二胺四乙酸二钠溶解度高，在低温时不会结晶，因具有还原性，所以也起到稳定血红蛋白的作用；所述渗透压调节剂优选为氯化钠、氯化钾中的至少一种，所述渗透压调节剂的作用适用于调节稀释液的渗透压，所述稀释液的渗透压值控制在250mosm/kg～260mosm/kg，因为兽用细胞适宜的渗透压在260mosm/kg到320mosm/kg之间，略低于生理渗透压，在短时间内保持血细胞体积不发生变化，而当加入溶血剂后又有利于红细胞快速溶解；所述缓冲液A为磷酸盐、硼酸盐、乙醇胺中的任意一种，所述pH值调节剂A用于调节稀释液的pH值，优选为柠檬酸。
本申请中，一般在白细胞分类试剂中添加防腐剂，可以抑制试剂在长期放置过程中微生物的滋生，防止试剂变质，延长试剂的储存和使用时间，保证试剂在有效期内性能稳定，但本方案中在所述溶血剂中添加甲醛防腐剂，不仅具有防腐功能，还有利于血红蛋白的稳定，有助于兽用血细胞的分类和血红蛋白的测试，为验证甲醛的技术效果，本申请还对含不同浓度甲醛的溶血剂进行了验证性试验，选取犬类血液样本为待检测兽用血液样本，实际测量值及理论值范围参考表一，应用含不同浓度甲醛的溶血剂对上述的待检测兽用血液样本进行处理，甲醛的浓度按质量百分含量计算，并进行了三分类血细胞分析，分析结果如表三所示。
表三：不同浓度甲醛的溶血剂对犬类血液样本的三分类血细胞分析
由表三可知，当溶血剂中不含甲醛时，血液样本中血红蛋白的计数值严重偏离了实际测量值，因此，甲醛对兽用血液样本中血红蛋白的稳定起到了积极的促进作用，但当甲醛的含量过高时，反而会影响溶血剂的渗透压，因此，当溶血剂中甲醛的质量百分含量为0.1％～0.5％时，应用该溶血剂对兽用血液样本处理后，血液样本中的血红蛋白的测量值与血液样本的实际测量值更接近，因此，甲醛有助于稳定血红蛋白，有助于精确的测定兽用血液中的血红蛋白。
本申请中，为精确分析兽用血细胞，所述的兽用三分类血细胞分析试剂的组分优选如下：所述溶血剂中：所述缓冲液B为硼砂、硼酸中的至少一种，所述电导率调节剂为硫酸钠，所述季铵盐为十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵中的任意一种；所述溶血剂中的电导率调节剂主要用于调节溶血剂的电导率，所述溶血剂电导率进一步调节为11.0ms/cm～12.0ms/cm；进一步的，所述季铵盐进一步优选为十二烷基三甲基氯化铵或十二烷基三甲基溴化铵，所述十二烷基三甲基氯化铵或所述十二烷基三甲基溴化铵的质量百分含量优选为0.5％～5％。所述溶血剂中只采用了一种表面活性剂，即季铵盐，便达到了预期的溶血效果。
本申请中，为精确分析兽用血细胞，所述的兽用三分类血细胞分析试剂的组分优选如下：所述清洗液中：所述无机盐为氯化钠、氯化钾中的至少一种，所述表面活性剂为月桂醇聚氧乙烯醚，所述pH值调节剂B用于调节清洗液的pH值，优选为乙醇胺，乙醇胺为有机碱，同时具有缓冲作用，有利于调节清洗液的pH值到所需值。且碱性蛋白酶与表面活性剂的组合可以更好地溶解和清洗液路系统残留的污渍和血渍，有效减少堵孔现象的发生，提高测试精确度。本发明方案中，为验证碱性蛋白酶的有益效果，还提供了三组实验数据进行对比，该实验的主要过程为：首先，进行第一次样本检测完成之后，应用不同类型的清洗液清洗仪器管路；其次，再应用仪器进行第二次检测之前，进行本底试剂空白计数检测，主要检测试剂中血红蛋白的数量，血红蛋白的数量越少，说明清洗液的洗涤效果越好，实验结果如表四所示：
表四：第二次检测前检测试剂中血红蛋白计数
| 清洗液中的组分类别 | 血红蛋白(HGB)计数 |
| 月桂醇聚氧乙烯醚 | 0.34g/L |
| 月桂醇聚氧乙烯醚和碱性蛋白酶质量比1:1 | 0.08g/L |
| 月桂醇聚氧乙烯醚和碱性蛋白酶质量比3:1 | 0 |
| 月桂醇聚氧乙烯醚和碱性蛋白酶质量比4:1 | 0.12g/L |
由表四可知，应用表面活性剂和碱性蛋白酶的组合可以更好地溶解和清洗液路系统残留的污渍和血渍，提高测试精确度，有效减少堵孔现象的发生。本申请中，所述表面活性剂优选为月桂醇聚氧乙烯醚，所述月桂醇聚氧乙烯醚和所述碱性蛋白酶的质量比优选为1:1～4:1，且月桂醇聚氧乙烯醚和碱性蛋白酶质量比为3:1时，清洗效果最佳。
为证明本申请的技术方案对兽用血细胞进行三分类血细胞分析时，具有更好的分析效果，本申请提供了两组本发明方案制备的兽用三分类血细胞分析试剂，从市面上采购常用人血细胞检测用三分类血细胞检测试剂作为对比例，应用三种试剂同时对兽用血液样本进行三分类血细胞分析。
实施例1
第一组兽用三分类血细胞分析试剂：包括稀释液、溶血剂和清洗液，所述稀释液、所述溶血剂和所述清洗液的具体组分如下：
在1L所述稀释液中：所述乙二胺四乙酸二钠为0.2g，所述氯化钠为3.8g，所述氯化钾为0.4g，所述聚乙二醇400为1g，所述甘油为15g，所述乙醇胺为0.5g，所述柠檬酸为0.8g，余量为纯水；该所述稀释液的pH值为6.96，所述稀释液的电导率为19.3ms/cm，所述稀释液的渗透压为252mosm/kg；
在1L所述溶血剂中：所述硼砂为0.2g，所述硼酸为2g，所述十二烷基三甲基氯化铵为21g；所述甲醛为1g；所述硫酸钠为5.3g，余量为纯水；所述溶血剂的pH值为7.36，所述溶血剂的电导率为11.2ms/cm；
在1L所述清洗液中：所述氯化钠为3.833g，所述氯化钾为10.2g，所述聚氧乙烯月桂醇醚为1.3g，所述碱性蛋白酶为1.3g，所述乙醇胺为0.001g；所述清洗液的pH值为6.7。
实施例2
第二组兽用三分类血细胞分析试剂：包括稀释液、溶血剂和清洗液，所述稀释液、所述溶血剂和所述清洗液的具体组分如下：
在1L所述稀释液中：所述乙二胺四乙酸二钠为0.2g，所述氯化钠为11g，所述氯化钾为0.3g，所述聚乙二醇400为0.5g，所述甘油为15g，所述乙醇胺为0.5g，所述柠檬酸为0.8g，余量为纯水；该所述稀释液的pH值为7.06，所述稀释液的电导率为19.7ms/cm，所述稀释液的渗透压为255mosm/kg；
在1L所述溶血剂中：所述硼砂为0.2g，所述硼酸为2g，所述十二烷基三甲基氯化铵为17g；所述甲醛为3g；所述硫酸钠为5.7g，余量为纯水；所述溶血剂的pH值为7.29，所述溶血剂的电导率为11.6ms/cm；
在1L所述清洗液中：所述氯化钠为3.833g，所述氯化钾为10.2g，所述聚氧乙烯月桂醇醚为2.7g，所述碱性蛋白酶为0.9g，所述乙醇胺为0.001g；所述清洗液的pH值为6.5。
对比例
从市面上采购常用人血细胞检测用三分类血细胞检测试剂。
分别应用三种试剂同时对兽用血液样本进行三分类血细胞分析，检测数据如表五所示，本申请中选取了两组物种兽用血液样本进行分析，两组物种包括猫类和犬类，实际测量值及理论值范围参考表一。
表五：兽用与人血细胞用三分类血细胞分析试剂效果对比
由表五可知，采用本申请的兽用三分类血细胞分析试剂对待测兽用血液样本进行三分类血细胞分析时，检测结果较常用的人血细胞检测用三分类血细胞检测试剂更精确，检测值更贴近待测兽用血液样本的实际测量值。
本申请还提供了一种兽用三分类血细胞分析试剂的制备方法，稀释液的制备步骤：依次将抗凝剂、渗透压调节剂、分散剂、缓冲液A、pH值调节剂A充分溶解到少量纯水中，混合均匀，定容，得到稀释液；溶血剂的制备步骤：依次将缓冲液B、季铵盐、防腐剂、电导率调节剂充分溶解到少量纯水中，混合均匀，定容，得到溶血剂；清洗液的制备步骤：依次将无机盐、表面活性剂、碱性蛋白酶、pH值调节剂B充分溶解到少量纯水中，混合均匀，定容，得到清洗液。上述稀释液、溶血剂和清洗液在配制过程中依次按药剂顺序加入试剂，且需等上一组分充分溶解后再加入下一组分。药剂配制完成后，需要应用0.22μm的聚丙烯膜对所述稀释液、所述溶血剂和所述清洗液进行过滤，该步骤的主要作用是有效去除稀释液、溶血剂和清洗液中的微生物和杂质。
综上所述，本申请提供了一种兽用三分类血细胞分析试剂，包括稀释液、溶血剂和清洗液，所述稀释液的成分为抗凝剂、渗透压调节剂、分散剂、缓冲液A、pH值调节剂A和纯水；所述溶血剂的成分为缓冲液B、季铵盐、防腐剂、电导率调节剂和纯水，所述防腐剂为甲醛；所述清洗液的成分为无机盐、表面活性剂、碱性蛋白酶、pH值调节剂B和纯水。稀释液中添加分散剂的作用是有利于细胞形态的保持和分散，便于分类计数；在所述溶血剂中添加甲醛防腐剂，不仅具有防腐功能，还有利于血红蛋白的稳定，提高了兽用血红蛋白的测试精度；所述的清洗液中添加了碱性蛋白酶，该碱性蛋白酶与表面活性剂的组合可以更好地溶解和清洗液路系统残留的污渍和血渍，有效减少堵孔现象的发生，提高循环测试精度。
以上仅结合目前考虑的最实用的优选实施例对本申请进行描述，需要理解的是，上述说明并非是对本申请的限制，本申请也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本申请的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本申请的保护范围。
Claims (10)
1.一种兽用三分类血细胞分析试剂，其特征在于，包括稀释液、溶血剂和清洗液，所述稀释液的成分为抗凝剂、渗透压调节剂、分散剂、缓冲液A、pH值调节剂A和纯水；所述溶血剂的成分为缓冲液B、季铵盐、防腐剂、电导率调节剂和纯水，所述防腐剂为甲醛；所述清洗液的成分为无机盐、表面活性剂、碱性蛋白酶、pH值调节剂B和纯水。
2.如权利要求1所述的兽用三分类血细胞分析试剂，其特征在于，所述甲醛的质量百分含量为0.1％～0.5％；所述溶血剂的电导率为11.0ms/cm～12.0ms/cm。
3.如权利要求1所述的兽用三分类血细胞分析试剂，其特征在于，
所述稀释液中：所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠，所述渗透压调节剂为氯化钠、氯化钾中的至少一种，所述分散剂为聚乙二醇400、甘油中的至少一种，所述缓冲液A为磷酸盐、硼酸盐、乙醇胺中的任意一种，所述pH值调节剂A为柠檬酸；
所述溶血剂中：所述缓冲液B为硼砂、硼酸中的至少一种，所述电导率调节剂为硫酸钠，所述季铵盐为十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵中的任意一种；
所述清洗液中：所述无机盐为氯化钠、氯化钾中的至少一种，所述表面活性剂为月桂醇聚氧乙烯醚，所述pH值调节剂B为乙醇胺。
4.如权利要求3所述的兽用三分类血细胞分析试剂，其特征在于，所述分散剂为聚乙二醇400和甘油的组合，所述聚乙二醇400和甘油的组合分散剂的质量百分含量为0.2％～5％。
5.如权利要求4所述的兽用三分类血细胞分析试剂，其特征在于，所述聚乙二醇400和甘油的组合分散剂中所述聚乙二醇400和所述甘油的质量比为1:7～1:30。
6.如权利要求5所述的兽用三分类血细胞分析试剂，其特征在于，所述聚乙二醇400和甘油的组合分散剂中所述聚乙二醇400和所述甘油的质量比为1:15。
7.如权利要求3所述的兽用三分类血细胞分析试剂，其特征在于，所述月桂醇聚氧乙烯醚和所述碱性蛋白酶的质量比为1:1～4:1。
8.如权利要求3所述的兽用三分类血细胞分析试剂，其特征在于，所述季铵盐为十二烷基三甲基氯化铵，所述十二烷基三甲基氯化铵的质量百分含量为0.5％～5％。
9.一种兽用三分类血细胞分析试剂的制备方法，应用于权利要求1-7中的任意一项所述的兽用三分类血细胞分析试剂，其特征在于，
稀释液的制备步骤：依次将抗凝剂、渗透压调节剂、分散剂、缓冲液A、pH值调节剂A充分溶解到少量纯水中，混合均匀，定容，得到稀释液；
溶血剂的制备步骤：依次将缓冲液B、季铵盐、防腐剂、电导率调节剂充分溶解到少量纯水中，混合均匀，定容，得到溶血剂；
清洗液的制备步骤：依次将无机盐、表面活性剂、碱性蛋白酶、pH值调节剂B充分溶解到少量纯水中，混合均匀，定容，得到清洗液。
10.如权利要求9所述的兽用三分类血细胞分析试剂的制备方法，其特征在于，应用0.22μm的聚丙烯膜对所述稀释液、所述溶血剂和所述清洗液进行过滤。
Priority Applications (1)
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