CN112294982A - 一种用于带溃疡病菌猕猴桃花粉的钴辐射灭菌方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于带溃疡病菌猕猴桃花粉的钴辐射灭菌方法，将猕猴桃花粉分装于玻璃管中，置于60Co‑γ射线辐照仓辐照，辐照剂量为800‑1400Gry，密封保存。相对于未经处理的花粉，辐照处理后花粉样品的溃疡病菌灭菌率可达99.50%，花粉活力仅下降3.50％，植株座果率达到92％。该方法成本低、效果好，且可操作性高，可有效用于大规模的猕猴桃商业花粉灭菌。
Description
技术领域
本发明属于农产品杀菌技术领域，具体地涉及一种用于带溃疡病菌猕猴桃花粉的钴辐射灭菌方法。
背景技术
猕猴桃(Actinidia Lindl.)是20世纪由野生到商业栽培最成功的植物驯化范例，因其富含多种维生素和矿质元素，被誉为“水果之王”。中国是猕猴桃属植物的原产地和猕猴桃栽培品种的发源地，至2018年，中国猕猴桃栽培面积已超越意大利、新西兰及智利等各国种植面积总和，年产量占全球总产量的57％，成为世界最大的猕猴桃生产国。自2008年以来，丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae，Psa)引起的猕猴桃细菌性溃疡病大面积爆发，严重危害了世界猕猴桃产业的健康发展[1]。
近几年，新西兰及意大利专家陆续证实猕猴桃花粉会传播溃疡病菌。2019年，发明人所在的团队对国内各厂家提供的花粉进行了检测，发现大部分花粉产品均携带病菌，主要原因是国内公司供应的猕猴桃花粉从各园区直接收集混合，未经处理及检测。随意使用未经检测、质量不合格的带菌花粉会加速病害传播。
商品花粉存在跨区域、大面积传播溃疡病菌的隐患。因此，尽快开发出一种能有效杀灭猕猴桃花粉上的溃疡病菌，同时保持其活性的方法，对于确保猕猴桃产业安全、可持续发展意义重大。
传统的物理灭菌方法包括臭氧、红外/紫外、微波、加热等，大部分在杀灭病菌的同时，难以保持花粉活力，因此不适用于猕猴桃花粉灭菌。辐照技术(60Co-γ辐照)已广泛用于杀灭医疗保健用品、动物饲料、食品、药品和农产品中各种微生物，提高卫生质量、延长保质期。γ射线辐照射线穿透力强，能有效杀灭腐败性微生物及致病菌，可在不破坏外包装同时灭菌，避免了二次污染，并且辐照灭菌在常温下进行，不产生热效应，不改变加工物质的温度(又称为冷加工)，尤其对热敏物品是最佳的灭菌方法。
本发明以猕猴桃花粉为材料，比对研究了60Co-γ辐照、紫外、微波、低温至高温(35℃、50℃、80℃及沸水)水浴处理等多种物理灭菌方法对猕猴桃花粉灭菌率、活力及座果率的差异，结果发现辐照剂量为800-1400Gry的60Co-γ辐照均可有效用于猕猴桃花粉的快速灭菌，其中1000Gry的60Co-γ辐照效果最好，灭菌率高达99.50％，花粉活力仅3.50％，座果率为92％。该方法未来可以有效用于猕猴桃产业中花粉的大规模、高效、快速灭菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于带溃疡病菌猕猴桃花粉的钴辐射灭菌方法，该方法先将样品密封分装，经60Co-γ射线辐照，彻底杀灭溃疡病菌，并保持花粉活力。该方法成本低、效果好，且可操作性高。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于带溃疡病菌猕猴桃花粉的钴辐射灭菌方法：将猕猴桃花粉分装于玻璃管中，置于60Co-γ射线辐照仓辐照，辐照剂量为800-1400Gry，密封保存。
优选地，所述的辐照剂量为1000Gry。
优选地，花粉密封后在3～4℃短期保存，保存期在1周之内，或在零下18℃以下长期保存，保存期在1年内。与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：目前我国多个产区因为花粉传播溃疡病菌导致感病面积迅速增加，感病率急剧增高，溃疡病已成为制约中国猕猴桃产业发展的首要因素，对中国猕猴桃产业造成严重威胁。本发明通过对多项物理灭菌技术进行比对，最终筛选出钴辐照灭菌的方法，经实验证实，经辐照剂量为800-1400Gry的60Co-γ射线辐照，灭菌率高达99.50％，花粉活力仅下降3.50％，座果率为92％，该方法成本低、效果好，且可操作性高，可有效用于大规模的猕猴桃商业花粉灭菌
具体实施方式
实施例1
花粉已被证实为猕猴桃溃疡病大范围远距离传播的重要途径之一。为了尽可能消除商品花粉的带菌隐患，本发明采用60Co-γ辐照、紫外、微波加热、低温至高温(35℃、50℃、80℃及沸水)水浴处理等物理灭菌方法对猕猴桃花粉进行处理，结果表明，辐照剂量为800-1400Gry的60Co-γ辐照均可有效用于猕猴桃花粉的快速灭菌，其中1000Gry的60Co-γ辐照效果最好，灭菌率高达99.50％，花粉活力仅下降3.50％。
不同灭菌技术对猕猴桃花粉灭菌率及花粉活力影响(n＝3)
注：实验规模：花粉10g/次，花粉灭菌前活力：63.5％。
采用菌落计数方法确定灭菌率，具体方法如下：分别取各处理后的0.5g花粉于500μL 10mM MgSO4中，以未处理染菌花粉作对照，45Hz研磨120s后稀释涂布KB培养基平板，于24℃培养箱培养，隔天用菌落计数法进行计数，每个样本重复3次。
采用花粉萌发测定法测定灭菌后花粉活力，具体方法如下：在载玻片上涂上薄薄一层的培养液(蔗糖10g和琼脂粉末1g加入水100ml中煮沸，在载玻片上涂一薄层)，以制作发芽床。在培养皿中铺上一片滤纸，用无菌水浸湿。用牙签将处理后的花粉轻轻撒在载玻片上，并将载玻片放入培养皿中，加盖。在20-25℃下放置24小时使花粉发芽。以花粉管生长的长度大于或等于花粉直径的一半视为萌发，10倍显微镜下观察。每个样本取3个视野，每个视野的总花粉数不少于100个，每个样本重复3次。
本实施例在系统对比60Co-γ辐照、紫外、微波加热、低温至高温(35℃、50℃、80℃及沸水)处理等多种物理灭菌方法的效果后，以灭菌率、花粉活力为可行性指标，筛选出60Co-γ辐照灭菌技术，既可达到有效杀灭溃疡病菌的效果，又可最大限度抑制花粉活力的降低。所得工艺的可规模性、商业性操作性极强。
实施例2(花粉样品一)
于2020年4月至5月，在湖北省广水市猕猴桃果园进行田间验证。将采后猕猴桃花粉分装、密闭于15×100mm的玻璃管中，10g/瓶，共计20瓶，置入60Co-γ射线辐照仓辐照，辐照剂量为1000Gry，温度为25℃；将经过辐照后花粉放置于-18℃储藏；授粉前将花粉取出，提前2天将冷冻层内保存的花粉取出转移到3～4℃冰箱冷藏室进行解冻；将花粉与石松子粉按照质量比1:3比例充分混合后，对50株猕猴桃树上的12312朵雌花进行点授。通过菌落计数法可知溃疡病菌的灭菌率为98.94％。通过花粉萌发法测定花粉活力，对照花粉样品活力为63.63％，辐照花粉样品活力为60.11％。
对各处理花粉的座果率进行统计，具体方法如下：选取健康、无病害、树势相近的猕猴桃果树，5棵树为一试验组。授粉前，将所有雌花在大蕾期进行套袋，防止蜜蜂授粉，盛花期某一个清晨解开套袋并进行授粉，授粉后立即再套袋，防止蜜蜂进行二次授粉。待猕猴桃花瓣自然脱落，解开套袋，进行人工授粉时，以清晨授粉为宜，以确保能够有充分的授粉率。授粉结束1个月后，调查各处理花粉的座果率。授粉1个月后观察，座果率为91.62％。
实施例3(花粉样品二)
于2020年4月至5月，在湖北省赤壁市猕猴桃果园进行田间验证。将采后猕猴桃花粉分装、密闭于15×100mm的玻璃管中，10g/瓶，共计20瓶，置入60Co-γ射线辐照仓辐照，辐照剂量为1000Gry，温度为25℃；将经过辐照后花粉放置于-18℃储藏；授粉前将花粉取出，提前2天将冷冻层内保存的花粉取出转移到3～4℃冰箱冷藏室进行解冻；将花粉与石松子粉按照质量比1:3比例充分混合后，对50株猕猴桃树上的10352朵雌花进行点授。通过菌落计数法可知溃疡病菌的灭菌率为99.21％。通过花粉萌发法测定花粉活力，对照花粉样品活力为71.32％，辐照花粉样品活力为67.63％；授粉1个月后观察，座果率为91.34％。
实施例4(花粉样品三)
于2020年4月至5月，在湖北省武汉市猕猴桃果园进行田间验证。将采后猕猴桃花粉分装、密闭于15×100mm的玻璃管中，10g/瓶，共计20瓶，置入60Co-γ射线辐照仓辐照，辐照剂量为1000Gry，温度为25℃；将经过辐照后花粉放置于-18℃储藏；授粉前将花粉取出，提前2天将冷冻层内保存的花粉取出转移到3～4℃冰箱冷藏室进行解冻；将花粉与石松子粉按照质量比1:3比例充分混合后，对50株猕猴桃树上的13457朵雌花进行点授。通过菌落计数法可知溃疡病菌的灭菌率为99.36％。通过花粉萌发法测定花粉活力，对照花粉样品活力为58.77％，辐照花粉样品活力为54.69％；授粉1个月后观察，座果率为90.23％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对发明型作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (3)
1.一种用于带溃疡病菌猕猴桃花粉的钴辐射灭菌方法，其特征在于：将猕猴桃花粉分装于玻璃管中，置于60Co-γ射线辐照仓辐照，辐照剂量为800-1400Gry，密封保存。
2.根据权利要求1所述的用于带溃疡病菌猕猴桃花粉的钴辐射灭菌方法，其特征在于：所述的辐照剂量为1000 Gry。
3.根据权利要求1所述的用于带溃疡病菌猕猴桃花粉的钴辐射灭菌方法，其特征在于：花粉密封后在3～4℃短期保存，保存期在1周之内，或在零下18℃以下长期保存，保存期在1年内。
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