CN112294955A - 一种复合免疫佐剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合免疫佐剂，所述复合免疫佐剂包含人参皂苷和纳米乳剂。本发明利用纳米乳剂与人参皂苷的协同免疫增强作用，以提高抗原的免疫原性和增强疫苗的免疫效果。本发明的配方可用作灭活疫苗、减毒疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗、蛋白质疫苗或多肽疫苗的免疫佐剂。

Description

一种复合免疫佐剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种复合免疫佐剂及其应用。
背景技术
人参(Panaxginseng C.A.Mey)是一种药食两用的药用植物，具有抗肿瘤、抗疲劳、增强免疫力及抗衰老等功效。人参皂苷(Ginsenoside，GS)是其发挥功效的重要成分之一，皂苷是一种免疫调节剂，具有广泛的药理活性，对心血管、中枢神经系统、内分泌以及免疫系统等都具有显著的作用。人参皂苷按其苷元的化学结构可分为三类：1)人参二醇系皂苷，包括Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd；2)人参三醇系皂苷，包括Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1及三七皂苷(notoginsenoside)R1；3)齐墩果酸(oleanolicacid)为苷元的人参皂苷Ro。其中，Rg1属于原人参三醇型(Protopanaxatriol type，PPT)，人参皂苷Rg1作为人参的主要成分，具有抗肿瘤作用和类固醇激素样作用；可提高小鼠的非特异性免疫功能，但机制尚不明确。其中，Rg1结构如式I所示。
Figure BDA0002747431520000011
纳米乳剂包括MF59、Stable emulsion、AS04、AF03等。其中，MF59是Chiron公司研制的一种水包油乳剂，含角鲨烯、聚山梨酯80和三油酸山梨坦。与未加佐剂的流感疫苗相比，含MF59佐剂疫苗对婴幼儿和老年人的同种和异种流感毒株均产生更强和持久的抗体反应。1997年，首个MF59TM佐剂季节性流感疫苗在欧洲批准用于65岁以上人群，目前已在近30个国家批准上市。对2,600多名不同年龄的志愿者(主要是65岁以上人群)进行含MF59佐剂流感疫苗Fluad的安全性和免疫原性临床评价，结果显示MF59佐剂三价流感疫苗的耐受性较好且免疫原性优于传统疫苗。与铝佐剂类似，MF59的作用机制尚不完全清楚，但有研究提示MF59等佐剂可诱导促炎细胞因子和趋化因子，这种促炎反应与注射部位抗原提呈细胞的招募、活化和成熟有关。
当前纯度高，成分明确且安全性好的新型疫苗在临床上正逐渐取代减毒及灭活疫苗，然而前者也存在免疫原性弱、单独应用难以诱导机体产生有效免疫应答的问题，需要添加佐剂增强其免疫效果。铝盐佐剂是最早被批准使用的一类人用疫苗佐剂，存在一定的局限性：主要诱导体液免疫，诱导的细胞免疫弱，无法清除病毒的胞内感染；缓释时间长，免疫应答产生滞后；诱发注射部位红肿；而且金属铝对人类神经系统的毒性作用也不容忽视。此外铝佐剂也无法应对疫苗应用范围扩大(预防苗→预防苗和治疗苗)以及应用方式多样化(肌肉注射→肌肉注射、口服、滴鼻等)的发展趋势，对新型佐剂的需求愈发迫切。因此，需要找到一种新型佐剂来解决上述问题。
发明内容
本发明的一个方面，是针对现有技术中的免疫佐剂辅助免疫效果差，免疫应答产生滞后以及给药方式单一的缺点，提供了一种复合免疫佐剂及其应用。
本发明提供的技术方案为：
一种复合免疫佐剂，所述复合免疫佐剂包含人参皂苷和纳米乳剂。
本发明技术方案将纳米乳剂联合人参皂苷按照相应的方法配制成复合免疫佐剂，然后与抗原配伍。利用纳米乳剂与人参皂苷的协同免疫增强作用，以提高抗原的免疫原性和增强疫苗的免疫效果。
在本发明中，如无特殊解释，所述纳米乳剂为水包油纳米乳剂，该纳米乳剂可以按常规方法制备成水包油的形式。
在本发明中，所述复合免疫佐剂还可以包含任意合适的添加剂或药用辅料，其作用可能为增加复合免疫佐剂的特定功能及性质，例如，稳定剂、赋形剂、溶剂，等等。但本发明复合免疫佐剂中至少包含人参皂苷和纳米乳剂(NE)两种组分。
在本发明中，所述复合免疫佐剂中的人参皂苷和纳米乳剂可以以任意合适的比例配比，其均可以实现本发明的目的。同时，在本发明的一个实施方式中，发明人还研究了高浓度的人参皂苷对本发明复合免疫佐剂所起到的积极效果。因此，作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述人参皂苷的浓度为600～1200ug/ml。更优选地，所述人参皂苷的浓度为1200ug/ml。
人参皂苷(Ginsenoside)是一种固醇类化合物，又称三萜皂苷，其分子结构中含有由30个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核。作为优选，在本发明的实施方式中，所述人参皂苷为人参二醇系皂苷、人参三醇系皂苷和/或齐墩果酸为苷元的人参皂苷Ro，其中，所述人参二醇系皂苷为选自Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc或Rd中的一种或几种，所述人参三醇系皂苷为选自Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1或三七皂苷中的一种或几种。
更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述人参皂苷为Rg1。所述人参皂苷Rg1如式I所示。
Figure BDA0002747431520000031
上述人参皂苷可使用任意市售的商品化人参皂苷，例如，成都曼思特生物科技有限公司生产的人参皂苷Rg1，也可以使用任意合适的现有技术中的方法进行制备，例如，《人参的提取工艺和人参皂苷的转化研究》，张留记等，《中医临床研究》2016年第34期，5-10页中记载的方法。
在本发明中，所述纳米乳剂(NE，nanoemulsion)可以为选自MF59、AS04或AF03中的一种或几种。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述纳米乳剂为MF59。
上述纳米乳剂可使用任意市售的商品化纳米乳剂。也可以使用任意合适的现有技术中的方法进行制备，例如：
1.机械法制备纳米乳剂
机械法制备纳米乳剂的常规过程有两步：首先是粗乳液的制备，通常按照工艺配比将油，水，表面活性剂及其他稳定剂成分混合，利用搅拌器得到一定粒度分布的常规乳液；然后是纳米乳剂的制备，利用动态超高压微射流均质机或超声波与高压均质机联用对粗乳液进行特定条件下的均质处理得到纳米乳剂。
利用高压均质机或超声波发生器能量的方法通常被叫做高能乳化法。研究表明，这些设备能在最短的时间内提供所需要的能量并获得液滴粒径最小的均匀流体。动态超高压微射均质机在国内外纳米乳剂领域的研究中被广泛应用。超声波乳化在降低液滴粒径方面相当有效，仅仅适用于小批量生产。
2.低能乳化法
低能乳化法是利用在乳化作用过程中曲率和相转变发生的原理。乳剂转换点EIP(Emulsioninversion point)法由Marszall和Shick首先发明。在恒定温度下，乳化过程中不断改变组分就可以观察到相转变。Sadurni等研制的O/W型纳米乳剂，粒径小至14nm，同时还具有高的动力学稳定性。转相乳化PIT(phase inversion temperature)法由Shinoda和Saito首先发明。在恒定组分条件下，调节温度得到目标乳化体系。此法在实际应用中多用来制备0/W型乳液。研究表明，在不添加任何表面活性剂的情况下，自发的乳化也会产生，并获得纳米乳剂。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述纳米乳剂由免疫刺激功能的3.5-5.0％角鲨烯、0.5-1.0％吐温80和0.5-1.0％司盘85通过高压匀质配制而成。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述复合免疫佐剂在制备疫苗中的用途。
上述疫苗可以为，例如，灭活疫苗、减毒疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗、蛋白质疫苗或多肽疫苗。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述疫苗为乙肝疫苗。
本发明的另一个方面，是提供了一种疫苗，包括免疫原和佐剂，所述佐剂为上述复合免疫佐剂。
上述疫苗可以为，例如，灭活疫苗、减毒疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗、蛋白质疫苗或多肽疫苗。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述免疫原和复合免疫佐剂的体积比为1:1。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述疫苗通过注射及黏膜免疫途径接种产生免疫应答。上述注射途径可以为肌肉注射、腹腔注射、皮下注射或皮内注射等途径。上述黏膜途径可以为经鼻、经口或经泌尿生殖道等途径。
上述免疫应答包括体液免疫应答和细胞免疫应答。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述疫苗为乙型肝炎疫苗。所述乙型肝炎疫苗包括乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和上述复合免疫佐剂。
在所述乙型肝炎疫苗的复合免疫佐剂中，所述人参皂苷的浓度为600～1200ug/ml。更优选地，所述人参皂苷的浓度为1200ug/ml。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述人参皂苷为Rg1。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述乙肝疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)制备复合佐剂；
2)制备乙肝表面抗原；
3)乙肝表面抗原与复合佐剂混合。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所使用的HBsAg是用酵母表达。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述乙肝表面抗原和复合免疫佐剂的体积比为1:1。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述乙肝疫苗通过注射及黏膜免疫途径接种产生免疫应答。上述注射途径可以为肌肉注射、腹腔注射、皮下注射或皮内注射等途径。上述黏膜途径可以为经鼻、经口或经泌尿生殖道等途径。
上述免疫应答包括体液免疫应答和细胞免疫应答。
本发明的另一个方面，是提供了上述疫苗在制备预防或治疗乙肝的产品中的用途。
本发明的有益效果为：
本发明利用纳米乳剂与人参皂苷的协同免疫增强作用，以提高抗原的免疫原性和增强疫苗的免疫效果。本发明的配方可用作灭活疫苗、减毒疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗、蛋白质疫苗或多肽疫苗的免疫佐剂。
附图说明
图1为本发明复合免疫佐剂乙肝疫苗免疫小鼠后血清anti-HBs滴度结果图；
图2为本发明复合免疫佐剂乙肝疫苗免疫小鼠后血清中anti-HBs IgG2a&IgG1结果图；
图3为本发明复合免疫佐剂乙肝疫苗免疫小鼠ELISPOT检测IFN-γ、IL-2斑点数结果图；
图4为本发明复合免疫佐剂乙肝疫苗免疫小鼠流式ICS检测IFN-γ、IL-2分泌CD8+T细胞比例结果图；
图5为本发明复合免疫佐剂流感疫苗免疫小鼠后血清血凝抑制抗体滴度结果图；
图6为本发明复合免疫佐剂流感疫苗免疫小鼠后体重和生存率结果图；
图7为本发明复合免疫佐剂中不同剂量及不同种类的人参皂苷免疫小鼠后血清anti-HBs滴度结果图；
图8为本发明复合免疫佐剂中不同剂量及不同种类的人参皂苷免疫小鼠ELISPOT检测IFN-γ、IL-2斑点数结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种复合免疫佐剂及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。以下就对本发明中出现的部分术语加以解释。
术语“纳米乳剂”又称微乳液(microemulsion)，是由水、油、表面活性剂和助表面活性剂等自发形成，粒径为1～100nm的热力学稳定、各向同性，透明或半透明的均相分散体系.一般来说，纳米乳剂分为三种类型，即水包油型纳米乳剂(O/W)、油包水型纳米乳剂(W/O)以及双连续型纳米乳剂(B.C)，1943年由Hoar和Schulman首次发现并报道了这一分散体系。直到1959年，Schulman才提出“microemulsion”这一概念。此后，纳米乳剂的理论和应用研究获得了迅速的发展。纳米乳化技术已渗透到日用化工、精细化工、石油化工、材料科学、生物技术以及环境科学等领域，成为当今国际上具有巨大应用潜力的研究领域。
纳米乳剂具有许多其它制剂无可比拟的优点：①为各向同性的透明液体，属热力学稳定系统，经热压灭菌或离心也不能使之分层；②工艺简单，制备过程不需特殊设备，可自发形成，纳米乳粒径一般为1～100nm；③黏度低，可减少注射时的疼痛；④具有缓释和靶向作用；⑤提高药物的溶解度，减少药物在体内的酶解，可形成对药物的保护作用并提高胃肠道对药物的吸收，提高药物的生物利用度。因此纳米乳剂作为一种药物载体受到广泛的关注。
术语“免疫佐剂”即非特异性免疫增生剂，指那些同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。佐剂可以具有免疫原性，也可无免疫原性。佐剂种类很多，目前尚无统一的分类方法，应用最多的是弗氏佐剂和细胞因子佐剂。佐剂的免疫生物学作用是增强免疫原性、增强抗体的滴度、改变抗体产生的类型、引起或增强迟发超敏反应，但佐剂的作用机制尚未完全明了，不同佐剂作用的机制也不尽相同。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：复合免疫佐剂溶液的制备
主要材料来源：
人参皂苷Rg1购自成都曼思特生物科技有限公司，纳米乳剂由免疫刺激功能的3.5-5.0％角鲨烯、0.5-1.0％吐温80和0.5-1.0％司盘85通过高压匀质配制而成；SPF级鸡血购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
NE+Rg1溶液的制备：
准确称量Rg1 100mg，溶于10ml生理盐水中，即为10mg/ml浓度。将2×NE与10mg/mlRg1溶液按一定比例混匀，使复合免疫佐剂中人参皂苷Rg1的终浓度为1200ug/ml，2-8℃保存备用。
实施例2：复合免疫佐剂作为乙肝疫苗佐剂的免疫效果评价
主要材料来源：
HRP标记羊抗鼠IgG1及IgG2a购自美国South Biotech公司；ICS(Intracellularcytokine staining testing)试剂购自BD公司；SPF级BALB/c雌性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
将实施例1中的复合免疫佐剂作为疫苗佐剂，以酿酒酵母重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)作为抗原。以制备1ml的疫苗为例，取500μl NE+Rg1溶液，加入500μl HBsAg溶液迅速混匀(1:1体积比)，置于2-8℃保存。检测小鼠血清中anti-HBs、IgG1/IgG2a，脾细胞酶联免疫斑点实验(enzyme-linked immunespot assay，ELISPOT)检测IFN-γ和IL-2SFC数量，流式ICS检测分泌IFN-γ和IL-2CD8+T细胞比例。
给药剂量：实施例1中制备的Rg1：300-600μg/ml；HBsAg：5-20μg/ml。
分组：1)HBsAg+Al；
2)HBsAg+NE；
3)HBsAg+NE+Rg1；
4)HBsAg+Rg1。
免疫方式：肌肉注射，100μl/只。
免疫方案：动物按照免疫分组免疫后3周加强免疫，末次免疫后1周每组随机取出4只小鼠，进行脾淋巴细胞的ELISPOT和流式ICS检测。初次免疫后30周以酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)定量检测血清anti-HBs和IgG1/IgG2a。
1、ELISA法定量检测血清中anti-HBs效价：
实验结果：
从1针后3w体液免疫结果来看，S+NE+Rg1组抗体水平高于S+Al及S+NE组，但差异无统计学意义；S+NE+Rg1组抗体水平明显高于S+Rg1组(P＜0.001)(如图1所示，其中，S指乙型肝炎表面抗原HBsAg)。
2、间接ELISA法检测IgG1和IgG2a
实验结果：
血清IgG1水平与anti-HBs结果相似，但S+NE+Rg1组高于S+Al组(P＝0.0013)。对于IgG2a水平，S+NE+Rg1组显著高于S+Al组(P<0.01)和S+NE组(P＝0.0081)。因此，NE+Rg1对乙型肝炎病毒表现出一定的协同免疫增强作用，IgG2a水平升高提示Rg1协同NE可增强HBsAg的细胞免疫水平(如图2所示)。
3、ELISPOT检测IFN-γ、IL-2的斑点形成数
实验结果：
S+NE+Rg1免疫组小鼠较NE免疫组诱导的特异性IFN-γ和IL-2表达细胞数绝对值更高，但差异无统计学意义，但NE+Rg1组SFCs显著高于氢氧化铝和Rg1组(P<0.05，P<0.01)(如图3所示)。
4、流式ICS检测分泌IFN-γ和IL-2CD8+T细胞比例
实验结果：
结果显示，与ELISPOT结果类似，NE+Rg1表现出较NE略高的增强作用，但差异无统计学意义。NE+Rg1较Al有更明显的增强作用(P＜0.05)(如图4所示)。
对比例1：复合免疫佐剂中不同种类及不同剂量人参皂苷的免疫效果比较
例如，对Rg1、Rb1和原人参二醇进行比较，方法同实施例2。
1、ELISA法定量检测血清中anti-HBs效价：
分组：
1)S+NE-Rg1-low；
2)S+NE-Rg1-high；
3)S+NE-Rb1-low；
4)S+NE-Rb1-high；
5)S+NE；
6)S+Al
免疫程序：单次免疫，14d检测anti-HBs抗体水平。
免疫剂量：HBsAg：5-20μg/ml；Rg1与Rb1低剂量：50-200μg/ml，Rg1与Rb1高剂量：600-1200μg/ml。
结果如图7所示：从结果可见，NE+Rg1高剂量组诱导anti-HBs抗体水平最高，且统计学分析显示仅NE+Rg1高剂量组与铝佐剂组差异有统计学意义(P＝0.026)。同时，NE+Rg1组诱导anti-HBs抗体水平高于NE+Rg1组。
2、ELISPOT检测IFN-γ、IL-2的斑点形成数
结果如图8所示：ELISPOT结果显示，NE+Rg1高剂量组诱导的IL-2与INF-γ斑点形成细胞数最高，显著高于Rb1及铝佐剂组。同时，NE+Rg1组显著高于NE+Rb1组。
实施例3：复合免疫佐剂作为流感疫苗佐剂的免疫效果评价
主要材料来源：
A/Puerto Rico/8/34(H1N1)流感毒株市售或由本室保存；(H1N1)A/Brisbane/2/2018购自长春生物制品研究所有限责任公司；RDE(Ⅱ)(340122)购自日本生研株式会社。SPF级鸡血购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；SPF级BALB/c雌性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，其中血凝抑制效价测定为每组8只小鼠，攻毒保护实验为每组10只小鼠。
给药剂量：Rg1：10-200μg/小鼠；HA：0.5-4.5μg/小鼠。
分组：
1)HA+Al；
2)HA+NE；
3)HA+NE+Rg1；
4)HA+Rg1；
5)NS对照
1、血凝抑制效价测定
实验结果：
HAI结果显示，1剂免疫后HA+NE血抑效价明显高于单独HA组(约为8倍)，与NE+Rg1无明显差异；2剂结果显示，HA+NE与HA+NE+Rg1血抑效价相当，均较单独HA组血抑效价高约16倍，但无统计学意义。而HA+NE+Rg1血抑效价明显高于HA+Rg1(P＜0.001)(如图5所示)。
2、攻毒保护性实验
将50只小鼠随机分为5组(10只/组)，分组及免疫剂量同HAI。加强免疫后14d，A/Puerto Rico/8/34(H1N1)流感毒株以10LD50进行滴鼻攻毒试验，观察并记录14d内小鼠存活和体重状况，并绘制生存曲线。
实验结果：
攻毒保护(体重及死亡率)结果显示，10LD50攻毒后连续观察14天并每天称重。第14天，HA、HA+NE、HA+NE+Rg1、HA+Rg1、NE组小鼠存活率分别为0、100、100、30、0。从体重变化曲线来看，单HA与HA+Rg1均在第7天左右下降至低谷，随后逐渐上升，而NE+Rg1与NE组体重略有下降后又开始逐渐恢复。NE+Rg1组并未表现出较NE组更明显的优势。分析NE与Rg1对于流感HA抗原并没有发挥协同免疫增强和保护作用(与联合HBsAg观察到的结果不太一致，说明相同佐剂联合不同抗原可表现出不同的甚至相反的结果)(如图6所示)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种复合免疫佐剂，其特征在于，所述复合免疫佐剂包含人参皂苷和纳米乳剂。
2.根据权利要求1所述的复合免疫佐剂，其特征在于，所述人参皂苷的浓度为600～1200ug/ml。
3.根据权利要求1所述的复合免疫佐剂，其特征在于，所述人参皂苷为人参二醇系皂苷、人参三醇系皂苷和/或齐墩果酸为苷元的人参皂苷Ro，其中，所述人参二醇系皂苷为选自Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc或Rd中的一种或几种，所述人参三醇系皂苷为选自Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1或三七皂苷中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的复合免疫佐剂，其特征在于，所述人参皂苷为Rg1。
5.根据权利要求1所述的复合免疫佐剂，其特征在于，所述纳米乳剂为选自MF59、AS04或AF03中的一种或几种，优选为MF59。
6.如权利要求1-5任意一项中所述的复合免疫佐剂在制备疫苗或试验用免疫试剂中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述疫苗为治疗或预防性乙肝疫苗。
8.一种疫苗，包括免疫原和佐剂，其特征在于，所述佐剂为如权利要求1～5任意一项中所述的复合免疫佐剂。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述免疫原和复合免疫佐剂的体积比为1:1。
10.如权利要求8或9所述的疫苗在制备预防或治疗乙肝的产品中的用途。
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