CN112292221B - 制造铸件的方法 - Google Patents

Abstract

一种制造铸件的方法，该方法包括将基板施加到牺牲模具上，该牺牲模具包括成形的非平面接收表面以接收基板并提供具有与接收表面相对应的成形结构的基板的铸件；使所述牺牲模具和铸件经受冷冻干燥条件，并从所述铸件升华所述牺牲模具，以形成包括所述成形非平面结构的铸件。

Description

制造铸件的方法

技术领域

本申请涉及一种使用牺牲模具制造铸件的方法，以及由此形成的铸件。

背景技术

在广泛的技术领域中，有许多形成铸件的方法。然而，根据所采用的方法，这些方法可能有许多缺点，包括：昂贵、劳动密集以及费时；限于狭窄的材料范围；限于某些应用；以及限于所得铸件的材料和几何性能，例如提供形状复杂和/或细节精细的铸件。

通常，期望提供一种相对简单且成本有效的形成模具、毛坯或冲模的方法，所述方法可以用作模板，以从(由)多种的不同材料形成形状复杂且细节精细的铸件。这种方法将在各种应用和技术领域中找到用途。

尽管如此，下面的讨论是关于组织工程应用的，其中组织(如，器官)可以在支架上制备或以其他方式(在支架上)生长，所述支架通常由模具形成。使用支架和模具形成合成组织提供了困难的挑战。这是因为组织本身是具有复杂结构的生物材料的复杂组合。

尽管(取得了)巨大的进步和创新，但该领域仍无法满足对于细胞密集的整个组织和器官的需求。由于氧气、营养物质以及废物的扩散限制以适当地支持细胞生存能力，诸如使用可吸收和多孔支架以支持和调节细胞生长和功能的普遍策略在大小和厚度上受到限制。人体的天然遍布的血管网络通过为生长大型组织提供足够的扩散接近度(diffusionproximity)来解决这些限制。然而，在形式和功能上类似的有效合成血管系统在体外尚未成功模仿。所述天然血管系统由复杂的网络组成，所述网络的范围从较大的血管(直径0.4至8毫米)到毛细管和微血管(直径10至50微米)不等。所述天然血管系统是分级的，反映了沿所述系统的各种功能位置，所述功能的范围从加压的血液运输到促进低流速扩散。这样的结构难以在合成血管系统内复制，如使用模具或支架形成的(合成血管系统)，因为当前的材料和方法论缺乏同时赋予机械强度、生物活性以及制造成分级网络结构的灵活性的能力。

在构造更大的血管(直径大于6毫米)(方面)已经取得了进展，主要用于移植和嫁接目的。同时，已经开发出多种策略来形成用于体外组织工程的毛细血管和微血管网络，包括诱导毛细管网络的自组装和缩微成像(micro-patterning)。然而，功能性合成血管系统必须在整个结构中同时拥有大血管和小毛细血管，而不是从线性血管到网络和回路。所述分级系统必须论证细胞浸润、氧气和营养物质的输送、机械压力和柔度，以及组移植组织和宿主脉管系统之间的手术吻合术。迄今为止，还没有合成血管系统能够完全满足这些要求。

在说明书中对任何现有技术的引用不是承认或暗示该现有技术在任何管辖范围内构成公知常识的一部分，或者该现有技术可以合理地期望被本领域技术人员理解，视为相关和/或与其他现有技术结合。

发明内容

在本申请的第一方面，提供了一种制造铸件的方法，所述方法包括：

应用基底到牺牲模具上，所述牺牲模具包括成形的非平面的接收表面以接收所述基底并提供所述基底的铸件，所述基底的铸件具有与所述接收表面相对应的成形结构；和

使牺牲模具和铸件经受冷冻干燥条件，并从所述铸件升华牺牲模具，以形成包括所述成形的非平面结构的铸件制品。

所述方法有利地允许将所述铸件制品形成为各种不同和/或复杂的形状，同时允许所述模具易于被移除。

在一种实施方式中，升华所述牺牲模具以从所述铸造(过程)移除所述牺牲模具包括使铸件经受冷冻干燥过程。

在一种实施方式中，所述牺牲模具是刚性的。在一种形式中，所述牺牲模具由具有至少为0.1GPa的杨氏模量的材料制成。所述杨氏模量更优选为至少0.5GPa。更优选地，所述杨氏模量为至少1GPa。甚至更优选地，所述杨氏模量为至少2GPa。甚至更优选地，所述杨氏模量为至少4GPa。最优选地，所述杨氏模量为至少8GPa。

在一种实施方式中，所述牺牲模具由冷冻材料形成，如冰或干冰。在一种形式中，所述牺牲模具包括冰，基本上由，或由冰组成。然而，应当理解的是，所述牺牲模具可以包括其他添加剂，例如金属盐或溶解的有机化合物，以改变所述冰模具的性能。举例来说，可以使用添加剂来改变冰的熔点和/或改变冰对应用到冰的表面的基底的亲和性。在存在添加剂的实施方式中，优选的是所述模具由冰和0.1wt％或更少的一种或多种添加剂组成。更优选地，所述模具由冰和0.05wt％或更少的一种或多种添加剂组成。最优选地，所述模具由冰和0.01wt％或更少的一种或多种添加剂组成。

本领域技术人员将理解的是，达到所述牺牲模具升华所需的温度和压力。然而，发明人已经发现，约-40℃至-120℃范围的温度和小于约300μB的压力可用于冰。优选地，温所述度在约-50℃至约-102℃的范围内，并且所述压力小于约＜250uB的压力。所述优选的温度是-55℃。冷冻干燥过程的持续时间根据结构体的大小变化，但是例如可以长达16小时。

在一种实施方式中，所述基底包括，基本上由，或由一种或多种选自以下组的材料组成：聚合物(热塑性和热固性聚合物)、树脂、低聚物、单体、蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、糖、无机纤维、有机纤维、植物或动物组织、植物或动物细胞、食品材料、陶瓷材料、以及包括前述至少一种的复合材料、以及所述材料的混合物。

在一个或多个实施方式中，以基底组合物的形式提供所述基底，所述基底组合物包括，基本上由或由上面列出的一种或多种基底材料组成，所述材料分散在溶剂中。在这样的实施方式中，优选在使牺牲模具经受冷冻干燥条件的步骤中升华所述溶剂。

本领域技术人员将理解的是，可以使用多种溶剂，并且溶所述剂的选择取决于形成所述基底的材料。举例来说，溶剂的非限制性公开包括：非极性溶剂、例如戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯、1,4-二恶烷、氯仿、二乙醚或二氯甲烷；极性非质子溶剂，例如四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、硝基甲烷或碳酸亚丙酯；极性质子溶剂，例如甲酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、乙醇、甲醇、乙酸或水。优选的溶剂是水，因为水相对于其他列出的溶剂显示出许多优点。例如，水便宜、易于获得以及无毒。此外，在优选的实施方式中，当所述基底是生物材料时，水是生物相容的并且不需要洗涤步骤，而其他材料可能是这种情况(需要洗涤步骤)。

在一种实施方式中，其中在将基底应用到所述牺牲模具的步骤之前，所述方法还包括从下选择的方法形成所述牺牲模具：从固态牺牲模具材料雕刻或加工所述牺牲模具；或浇铸或3D打印液态模具材料并固化所述液态模具材料以形成所述牺牲模具。

在一种实施方式中，形成所述牺牲模具的步骤包括3D打印所述液态模具材料。优选地，所述3D打印所述液态模具材料的步骤在温度比所述液态模具材料的固相线温度低的环境中进行。优选地，所述温度比所述固相线温度至少低10℃。更优选地，所述温度比所述固相线温度至少低20℃。甚至更优选地，所述温度比所述固相线温度低至少25℃。最优选地，所述温度比所述固相线温度至少低40℃。在所述液体模具材料是水的所述实施方式的一个特定示例中，3D打印的步骤在设置为-30℃的冰柜中进行。在所述液体模具材料是水的所述实施方式的另一示例中，3D打印的步骤在设置为-80℃的冰柜中进行。

在上述实施方式的一种形式中，所述液态模具材料是水。在一种形式中，所述液态模具材料包括水，基本上由，或由水组成。在该实施方式的一种特定形式中，所述液体模具材料由水和0.1wt％或更少的一种或多种添加剂组成。优选地，所述液态模具材料由水和0.05wt％或更少的一种或多种添加剂组成。最优选地，所述液体模具材料由水和0.01wt％或更少的一种或多种添加剂组成。

在液体模具材料是水的上述实施方式的形式中，合适的添加剂可以包括盐或有机化合物。所述盐的添加改变了冰的融化温度。这在3D打印所述液态模具材料的步骤的实施方式中是有用的，包括由液态模具材料3D打印第一模具组分，所述液态模具材料由液体和一种或多种溶解的添加剂(如前述的0.1wt％或更少)组成，将第二模具组分应用到所述第一模具组分的至少一部分上，所述第二模具组分(与第一模具组分相比)由相同的液体形成但组成不同，使得所述第一模具组分和所述第二模具组分的熔点不同。优选地，所述第一模具组分的熔点低于第二模组分的熔点。这个实施方式在3D打印盐水冰的第一模具组分时是有用的，(所述3D打印第一模具组分的步骤)在切换回第二模具组分的淡水冰之前。

在一种实施方式中，所述接收表面是外接收表面，并且将基底应用到所述牺牲模具的步骤包括用所述基底涂覆所述外接收表面的至少一部分。优选地，通过将所述牺牲模具浸涂到所述基底中或者将所述基底喷涂到所述牺牲模具，将所述基底应用到所述牺牲模具的外接收表面上。技术人员将理解的是，可以使用类似的涂覆工艺。

在一种实施方式中，将基底应用所述到牺牲模具的步骤包括：将第一基底材料应用到所述牺牲模具的所述接收表面，以在所述牺牲模具的接收层上形成所述第一基底材料的第一层，并将第二基底材料应用到所述第一层的至少一部分上，以在第一层上形成所述第二基底材料的第二层。应当理解的是，可以应用一个或多个更多的基底层以形成多层基底和/或应用到第一层的不同部分。所述第一基底、所述第二基底和任何更多基底可以相同或不同。在由牺牲模具形成的铸件制品具有管或血管的结构的情况下，该过程可以使沿着管的长度改变管壁的厚度，在所述长度内所述管腔具有或多或少的恒定直径。根据该实施方式，还可以沿着管的长度改变管壁的厚度，在所述长度内所述管腔具有变化的直径。

利用牺牲模具来改变管或血管的壁厚同时保持恒定的管直径的另一种选择是利用内部和外部牺牲冰支架。在该实施方式中，所述内部和外部牺牲模具形成布置，使得在形成铸造制品的基底的到所述模具的接收表面的应用中，所述内部牺牲模具限定并形成铸造制品的内表面并且所述外部牺牲模具限定并形成铸件的外表面。通过相对于所述内部牺牲模具的所述接收表面改变所述外部牺牲模具的所述接收表面，可以在保持腔体直径的同时改变壁厚。还可以通过形成或适应外部牺牲模具的接收表面，以在铸件的外壁上提供图案或重复构造，从而在铸件制品的外壁上限定图案。还可以沿着管的长度改变管壁的厚度，在所述长度内所述管腔具有变化的直径。在一种实施方式中，所述内部牺牲模具可以与所述外部牺牲模具一体地形成。

尽管对所述基底的壁厚没有特别限制，但是在一种实施方式中，将基底应用到牺牲模具上以在所述牺牲模具的表面上形成基底层的步骤包括形成一层基底层，所述基底层层厚为10毫米或更小。优选地，所述层厚为7mm或更小。更优选地，所述层厚为5mm或更小。甚至更优选地，所述层厚为4mm或更小。最优选地，所述层厚为3mm或更小。另外地或可替代地，在某些形式上，所述壁厚为0.1mm或更大。

在一种实施方式中，将基底应用到牺牲模具的步骤包括在牺牲模具的一个或多个接收表面周围(例如在牺牲模具的管状接收表面周围)形成基底的管状层。

在一种实施方式中，模具包括使得当模具涂覆有基底时能够以血管或管的形式从基底形成铸件或铸造制品的形状。在该实施方式中，所述模具的所述接收表面可以限定血管的腔表面。

在一种实施方式中，模具的接收表面包括一个或多个凹槽、狭缝或裂缝，每个凹槽、狭缝或裂缝使得当模具涂覆有基底时能够从基底在铸件制品或铸件的腔表面形成瓣片(flap)或膜。优选地，所述凹槽、狭缝或裂缝被构造成使得能够形成瓣片或隔膜，以控制通过包含有瓣片或隔膜的血管铸件的腔的流体的速度或方向。更优选地，所述凹槽、狭缝或裂缝位于模具的接收表面上，以在用作阀的铸件的腔表面形成一个或多个瓣片或膜的布置。

在一种实施方式中，在从所述基底升华所述牺牲模具的步骤之前将，所述方法还包括将一个或多个涂层应用到所述铸件的至少一个表面上，和形成涂覆的和/或多层的铸件。替代地或另外地，在一种实施方式中，在从所述基底升华所述牺牲模具的步骤之后，所述方法还包括将一个或多个涂层应用到所述铸件制品的表面的至少一部分上，和形成涂覆的和/或多层的铸件制品。应当理解的是，可以应用一个或多个涂层以形成多层涂层和/或应用以涂覆铸件和/或铸件制品的表面的不同部分。所述一个或多个涂层可以由与基底相同的材料或不同的材料形成。

在一种实施方式中，所述铸件和/或铸件制品包括至少一个呈管状的部分。

在本申请的第二方面，提供了一种制造具有内部分级结构的生物材料的方法，所述方法包括：

涂覆生物材料组分到具有分级结构的牺牲冰模的外接收表面的至少一部分上，并在冰模的外表面上形成生物材料组分的铸件，所述铸件具有与牺牲冰模的外表面相对应的内部分级结构；和

使所述铸件经受温度和压力以冻干来自所述铸件的所述牺牲冰模，以形成具有内部分级结构的铸件生物材料。

在本申请的第三方面，提供了一种制造具有分级结构的铸件或铸件制品的方法，所述方法包括：

-在形成具有由模具(通过涂覆)的外表面限定的分级结构的铸件的条件下，用基底涂覆牺牲模具的外表面的分级结构的至少一部分；和

-使铸件和/或模具经受为了模具分离的条件，使铸件能够从铸模中脱模；

由此制造出具有分级结构的铸件。

在第三方面的一个实施方式中，包括以下步骤：使已经应用到模具的外部接收表面的至少一部分上的基底交联或固化，所述基底的所述交联或固化由此在模具上形成具有由模具的外表面限定的分级结构的铸件。

在一种实施方式中，所述铸件和/或模具经受用于升华或冻干所述模具的条件，由此分离所述模具以从所述模具中释放所述铸件。

在一种实施方式中，使铸件经受温度和压力以冻干来自铸件的所述牺牲冰模的步骤包括使铸件经受冷冻干燥过程。

尽管对于铸件和/或铸件生物材料的壁厚没有特别限制，但是在一种实施方式中，所述铸件和/或铸件生物材料的壁厚为10mm或更小。优选地，所述壁厚为7mm或更小。更优选地，所述壁厚为5mm或更小。甚至更优选地，所述壁厚为4mm或更小。最优选地，所述壁厚为3mm或更小。附加地或可替代地，在某些形式上，所述壁厚为0.1mm或更大或0.1至1.0mm、或0.3、或0.6或0.9mm。

在一种实施方式中，所述铸件或铸件生物材料是独立的分级血管结构。

在一种实施方式中，所述铸件的分级结构包括至少一个父血管，从所述父血管的末端延伸的多个子血管，以及以某些形式，从一个或更多或每个子血管的末端延伸的多个孙血管。将理解的是，所述进一步的分支是可能的，例如提供孙和曾孙血管(等等)。优选的是，所述层级结构(如果存在)遵守默里定律(Murray’s law)。即，当父血管分支成子血管时，父血管的半径的立方等于子血管半径的立方的总和。

所述子、孙和曾孙血管可以是血管结构的形式，包括回路、分叉、多叉以及/或所述回路、分叉、多叉的组合。为了清楚起见，术语分级结构包括具有分叉和汇聚的子、孙以及曾孙血管的结构，例如两个或更多个直径较小的血管汇聚在一起以形成一个直径较大的血管。

在一种实施方式中，所述血管可以具有封闭端。

本方法的一个优点是允许形成狭窄的血管。在一种优选形式中，所述分级结构包括至少一个血管，所述血管的横截面积对应于直径2mm或更小。优选地，所述横截面面积对应于1.5mm或更小的直径。更优选地，所述横截面面积对应于1mm或更小的直径。最优选地，所述横截面积对应于0.5mm或更小的直径。使用所述方法形成的所述分级结构中的任何特定血管的直径没有特定的尺寸上限。人体血管系统中最大的血管是直径约20毫米的主动脉。应当理解的是，其他动物具有较大直径的血管，并且所述方法可用于形成这些较大的血管。在其他实施方式中，所述直径可以大于20mm，例如25至50mm，尤其是在需要用于除血管系统之外的其他血管结构的情况下。

在一种实施方式中，通过将所述牺牲模具的外接收表面浸涂到所述基底中或者将所述基底喷涂到所述牺牲模具的外接收表面上，将所述基底应用到所述牺牲模具的外接收表面上。技术人员将理解的是，可以使用类似的涂覆工艺。

在一种实施方式中，其中在将基底或生物材料涂覆到所述牺牲冰模的至少一部分外接收表面的步骤之前，所述方法还包括通过3D打印水形成所述牺牲冰模以形成所述牺牲冰模。

在上述实施方式的一种形式中，所述3D打印所述液态模具材料的步骤在比所述液态模具材料的固相线温度至少冷5℃的环境中进行。优选地，所述温度比所述固相线温度至少低10℃。更优选地，所述温度比所述固相线温度至少低20℃。甚至更优选地，所述温度比所述固相线温度低至少25℃。最优选地，所述温度比所述固相线温度至少低40℃。在该液体模具材料是水的该实施方式的一个特定示例中，3D打印的步骤在设置为-30℃的冰柜中进行。在所述液体模具材料是水的所述实施方式的另一示例中，3D打印的步骤在设置为-80℃的冰柜中进行。

在上述实施方式的另一形式中，3D打印液态模具材料的步骤包括沉积所述液态模具材料并用液氮喷涂所述液态模具材料以冻结所述液态模具材料。

在一种实施方式中，将基底或生物材料组合物应用到牺牲模具上的步骤包括在应用基底或生物材料组合物后，将另外的材料应用到铸件或生物材料浇铸层的至少一部分上以在铸件或生物材料浇铸层表面上形成所述另外的材料的层。应当理解的是，所述另外的材料的另外的层可以被应用以在生物材料组合物的表面上和/或应用至所述第一层的不同部分形成多层基底。所述生物材料、基底以及任何另外的基底可以相同或不同。

在一种实施方式中，在冻干所述牺牲冰模的步骤之后，所述方法还包括将一个或多个涂层应用到铸件生物材料的表面上，并形成涂覆的和/或多层的铸件生物材料。将理解的是，可以应用一个或多个涂层以形成多层涂层和/或应用以涂覆铸件生物材料的表面的不同部分。所述一个或多个涂层可以由与铸造生物材料相同的材料或不同的材料形成。

在一种实施方式中，所述方法最初包括获得血管结构的图像，和3D打印所述血管结构的负冰模。所述图像可以，例如，从患者血管结构的CT/MRI扫描或从血管结构数据库中获取。以这种方式，本申请的方法提供了用于制备血管(或其他)结构的定制方法。

在本申请的第二或第三方面的实施方式中，其中所述铸件或铸件制品包括血管或管构造，如关于本申请的第一方面所述，所述壁厚可以在固定腔直径的区域上变化，或者所述壁厚可以在腔直径变化的区域上变化。

在本申请的第二或第三方面的一个实施方式中，其中所述铸件或铸件制品包括血管或管构造，如关于本申请的第一方面所述，所述腔表面可以设置有一个或多个用于控制流体速度或方向的瓣片或膜。

在本申请的第四方面，提供了根据本申请的第一、第二或第三方面的方法及实施方式制造的铸件制品，例如铸件生物材料。

在本申请的第五方面，提供了根据本申请的第一、第二或第三方面的方法及实施方式形成的分级血管结构。

在本申请的第六方面，提供了一种用于血管系统的铸件制品，所述铸件制品根据本申请的第一、第二或第三方面的方法形成，并且包括：

-第一层，所述第一层具有限定血管腔的内表面，所述第一层由能够使营养物和/或气体扩散到所述血管腔和所述从血管腔扩散的多孔聚合物组成；

-第二层，所述第二层形成在所述第一层的外表面上，所述第二层能够使血管细胞浸润和/或附着；

以及可选的：

-第三层，所述第三层在第二层的外表面上形成，所述第三层用于为所述铸件制品提供机械强度和可能的缝合和缝合固持强度。

在一种实施方式中，所述第一层可以包括琼脂糖，所述第二层可以包括细胞外蛋白，例如弹性蛋白或胶原蛋白和/或一个或多个细胞，例如成纤维细胞或内皮细胞，并且第三层可以包括合成聚合物，如聚己内酯。

优选地，所述铸造制品适合用于动脉或静脉系统。所述制品可以适用于淋巴系统。本申请的其他方面以及在前面段落中描述的方面的进一步的实施方式将从以下描述中变得显而易见，所述描述是通过示例的方式并参考附图给出的。

附图说明

图1a示出了一个设计阶段，在所述阶段中，在浸入聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)中以创建阴模之前，首先对阳模进行数字化设计并进行3D打印。

图1b示出了浇铸阶段，在所述浇铸阶段中，先将水注入PDMS模具中，然后快速冷冻，再形成由冰制成的牺牲模具。

图1c示出了涂覆阶段，在所述涂覆阶段中，牺牲冰模浸涂有基底，在这种情况下(所述基底)是溶解的原弹性蛋白。将所述基底涂覆的牺牲模具快速冷冻以固化该基底涂层。随后的冻干去除了牺牲冰模，而不影响基底涂层。最后，原弹性蛋白基底涂层的热稳定造成原弹性蛋白的血管结构。

图1d示出了使用此方法可以制造的各种各样的血管结构，包括分叉血管、小直径线性血管、多个分叉血管、主动脉弓、大直径线性血管以及厚壁血管。

图1e示出了可以涂覆到牺牲冰模上的一系列基底材料，包括但不限于原弹性蛋白、与聚己内酯(polycaprolactone，PCL)组合的原弹性蛋白、与PDMS组合的原弹性蛋白，丝以及与PDMS组合的丝。

图2a是具有直径小于10μm的孔(比例尺，10μm)的原弹性蛋白血管的腔表面的SEM图像。放大的图像显示，这些孔与血管壁内的子结构连接(比例尺，2μm)。

图2b是原弹性蛋血管的横截面的SEM图像，所述图像示出了在腔和外腔壁之间径向连接的通道(比例尺，100μm)。放大的图像显示，径向对齐的通道的宽度大约为2μm(比例尺为2μm)。

图2c是示出了原弹性蛋白血管的外腔表面有小于腔表面上的孔的孔(比例尺，10μm)的SEM图像。放大的图像显示，外腔表面上的孔的直径通常小于2μm，并且还连接到血管壁内的子结构(比例尺，2μm)。

图2d是原弹性蛋白血管的循环测试的代表性应力-应变曲线。500个循环的叠加曲线表明没有机械降解的迹象，并且保留了弹性。所述材料示出了两相加载阶段，其中最初的高刚度随后降低了，并且最初的低柔度随后增加了。刚度和柔度改变的点称为临界应力。

图2e是示出了明显的滞后性的图，并且在整个循环测试中也是一致的，证明了在测试期间机械性能的保持。

图2f是示出了通过作为次要基底的PCL的添加显著改善原弹性蛋白血管的破裂压力的图。这相当于人大隐静脉(灰色区域)的破裂压力。

图2g是示出了通过PCL的添加显著改善原弹性蛋白血管的弹性模数的图。需要三层PCL才能提供与人大隐静脉相当的弹性模量。误差棒表示标准偏差，p值：*<0.05,**<0.01,***<0.001,****<0.0001。

图2h是示出了通过PCL的添加显著改善原弹性蛋白血管的极限抗张强度(ultimate tensile strength，UTS)的图。5层PCL产生的UTS与人大隐静脉相当。误差棒表示标准偏差，p值：*<0.05,**<0.01,***<0.001,****<0.0001。

图2i是示出了通过PCL的添加改善缝合固持强度的图，所述强度比大鼠腹主动脉和人大隐静脉强。误差棒表示标准偏差，p值：*<0.05,**<0.01,***<0.001,****<0.0001。

图3a示出了在100％胎牛血清(foetal bovine serum，FBS)或磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)中培养的血管的2周降解试验，表明保留了结构完整性。

图3b是示出了在FBS或PBS中培养的2周降解期间的原弹性蛋白血管的质量保留率分析的图。此质量损失在3天后稳定下来，在FBS中培养的血管的第3天至第14天之间未观察到明显的质量损失。误差棒表示标准偏差，p值：*<0.05,**<0.01,***<0.001,****<0.0001。

图3c是示出了在4小时的过程中，随着注入葡萄糖的PBS通过原弹性蛋白血管泵送，在外腔空间中测得的葡萄糖浓度增加的图。误差棒表示标准偏差，p值：*<0.05,**<0.01,***<0.001,****<0.0001。

图3d是显示在原弹性蛋白血管的腔表面增殖的人脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cells，HUVECs)的DNA定量的图，表明第1天至第7天细胞数量显著增加。误差棒表示标准偏差，p值：*<0.05,**<0.01,***<0.001,****<0.0001。

图3e是在原弹性蛋白血管腔表面上HUVEC增殖的一系列共焦显微镜图像。在7天的增殖期间内，HUVEC种群逐渐融合(比例尺，100μm)。

图3f是一系列3Dz-堆视图，示出了形成了特征性单层的所述HUVECs(比例尺，100μm)。

图3g是示出了脉动压力波引起原弹性蛋白血管扩张和膨胀的图。在一个压力波期间拍摄的连续照片显示，原弹性蛋白血管显示出总的弹性回缩，没有观察到物理形变。

图4a示出了血管结构的数字设计，在将打印指令发送到3D打印机以精确打印牺牲冰模之前，已对所述血管结构进行了数字化设计和优化以冰打印。

图4b是示出了3D打印机组件的示意图。所述3D打印机安装在零度以下的环境中，以方便打印冰块。3D打印机控制器和输水泵位于零下的周围环境之外，以防止输水管线的损坏和(管线中)水的冻结。

图4c显示了3D打印条件的优化。高保真度打印需要一致的墨滴生成，并且可以通过一定的压力和驱动频率组合(突出显示)(比例尺，5mm)实现一致的墨滴生成。

图4d说明3D打印机的保真度足以制造基本血管系统形状的冰牺牲模具，包括分叉、网络和回路(所有比例尺均为2mm)。

图5a示出了分叉血管设计(比例尺，4mm)。

图5b示出了血管网络设计(比例尺，4mm)。

图5c示出了血管回路设计(比例尺，4mm)。

图6是用于微分配阀的驱动电子装置的示意图。

图7是打印头模块的示意图(所有尺寸以毫米为单位)。

图8是铸件的壁厚测量值的散点图。(所述比例尺，500μm)

图9是3维模具成形的图像。(比例尺，4mm)。

图10是描述用于形成具有不同壁厚的铸件的内部和外部冰支架的图像。

图11是示出具有一个或多个凹槽的冰支架的图像，所述凹槽用于形成包含内部阀结构的铸件。

图12是示出了冰支架的选择性涂覆的示意图。

具体实施方式

本申请涉及一种形成铸件制品(cast article)的方法，所述方法大体上包括在牺牲模具的接收表面上涂覆基底以在牺牲模具上形成所述基底的铸件；并且升华牺牲模具以从铸件上去除牺牲模具并形成铸件制品。

所述方法可以应用以由多种材料形成铸件。然而，在本申请的优选形式中，所述牺牲模具由冰形成。鉴于此，发现所述方法，特别是与基底一起使用，可以应用于足够使冰模融化最小的温度(例如10℃或更低)。优选地，所述基底在4℃或更低的温度下应用。

所述基底通常以液体形式应用到牺牲模具上。所述基底本身可以是液体(例如，与牺牲模具接触时固化或在较高温度下固化/凝胶化的液体)，或溶解在液体溶剂中。可选地，所述基底可以以粉末的形式提供，例如通过涂覆牺牲模具的粉末(提供)。合适的基底包括聚合物(热塑性和热固性聚合物)、树脂、低聚物、单体、蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、糖、无机纤维、有机纤维、植物或动物组织、植物或动物细胞、食品材料、陶瓷材料、包括前述至少一种的复合材料及前述材料的混合物。

在将基底应用到牺牲模具上以形成基底涂覆的牺牲模具之后(例如通过浸涂或喷涂或其他类似工艺)，可以使基底经受处理工艺，例如可以使基底经受表面处理工艺和/或涂覆其他层。举例来说，可以使基底经受固化反应或交联反应。本领域技术人员将理解的是，所述固化或交联反应可为例如包括将基底暴露于一种或多种其他反应物、UV光或其他刺激下。

随后，将涂覆有基底的牺牲模具暴露于温度和压力条件下，以使牺牲模具从基底升华并形成铸件。同样，在本申请的优选形式中，牺牲模具由冰形成。水的三相点为273.16K，局部蒸气压为611.657帕斯卡。因此，从冰到水蒸气的升华在低于这些值的适当温度和压力下进行。合宜地，该将所述冰升华或冻干的步骤可以在冷冻干燥机中进行。技术人员将理解的是，所述牺牲模具可以由在有用的温度和压力范围内升华的其他材料制成。

所述牺牲模具可以通过铸造或3D打印来制备。也就是说，以一种或多种形式，液态模具材料可以被铸造或打印并固化以形成牺牲模具。尽管如此，发明人已经发现3D打印的使用可以提供具有精细和细节特征的牺牲模具。这种牺牲模具在生物学环境中尤其有用，例如在制备用于生产血管组织的模具中。

下面将结合用于形成具有内部分级结构的生物材料的铸件的制造方法的优选实施方式来描述和举例说明本申请。所述方法广泛地包括以下步骤：将生物材料涂覆到具有分级结构的牺牲冰模具的外表面的至少一部分上，并在冰模具上形成生物材料的铸件，所述铸件具有与牺牲冰模的外表面相对应的内部分级结构；使所述铸件经受温度和压力以从所述铸件中冻干所述牺牲冰模。本领域技术人员将理解的是，尽管所述方法是特定实施方式的说明，但是本申请并不旨在受到这种材料、应用以及方法论的限制。

示例

本申请所述的概念和方法对于建造整个分级血管系统特别有用。在这样的实施方式中，使用冰制造牺牲模具是特别重要的，在所述模具上可以涂覆生物和合成材料以形成血管结构。通过使用冰，所述方法简单、经济高效并且适用于其他涂覆(涂层)材料。此外，冰不会留下有毒残留物，实现了完全清洁和生物相容的制造过程。这些有利的特性简化了所述制造过程，使监管审批效率更高，并鼓励将来大规模制造。

与以前用于牺牲模具的其他较软的聚合物相比，冰还具有所需的结构刚度用于以高保真度制造轮廓分明的形状和尺寸。利用这些特性，发明人开发了用于铸造和3D打印的冰模的技术，所述冰模可以被制造得精细细节、分辨率较高以及复杂。使用这些技术，可以制造的功能性血管结构的设计的创意和范围得以扩展。在这些具体示例中，除了具有制造复杂血管形状的能力外，还有确保动态血流的适当条件的需要。

用于制造脉管系统的铸冰模具的方法

本申请描述是铸冰模具在制造血管中的使用。冰具有完全的生物相容性、通过冻干很容易地去除，无毒化合物(free from toxic compound)或残留物、并且具有结构刚性以允许以高保真度建造复杂且独立的血管建设。这优于基于水凝胶或生物墨水的牺牲模子的传统方法，所述方法难以创建独立的血管设计并且需要多个洗涤步骤以去除可能对细胞有毒的残留物。此外，获得水作为制造材料并无成本或数量限制，这为有效的商业升级提供了独特的机会。

冰是一种通用材料，可以由它形成牺牲模具，因为可以根据不同血管设计的分辨率和复杂性的要求，铸造和3D打印冰(或视情况而定为水)以形成牺牲冰模。这些牺牲模具可以另外涂覆有各种不同的材料，以形成合成血管壁。

为了证明这种方法的多功能性，发明人研究了验证以这种方式制造的血管的功能性的关键问题。具体而言，发明人表明：(a)这种方法可以灵活地创建各种大小和形状，且复杂程度不同的血管结构；(b)该方法与使用多种材料形成血管壁相配；(c)所述血管以高精度建造，并且可以设计成有利于非湍流的分叉流体流动；(d)可以调节人造血管流动系统以维持加压的血液流动、吻合的手术处理、以及可行的葡萄糖营养输送；(e)原弹性蛋白的使用提供了生物相容的血管壁，所述血管壁支持人脐静脉内皮细胞增殖。总的来说，所报告的实验和理论发现证明了一种新的平台制造系统，所述平台制造系统用于分级血管结构的设计和建造，不仅支持复杂的工程组织，而且还支持患者定制的血管移植，例如由患者血管的CT/MRI扫描驱动3D打印复制。

尽管可以使用多种材料作为基底，但本示例主要集中在原弹性蛋白作为主要材料来涂覆冰模和构建工程血管的血管壁的使用。原弹性蛋白是弹性蛋白的组成部分，是哺乳动物血管细胞外基质中最普遍和持久的成分。为了实现生物制造人造血管的要求目标，原弹性蛋白是一种极具吸引力的材料候选材料，因为：(i)具有酶促和非酶促交联成多种弹性蛋白基材料的多功能性；(ii)通过由补充(recruit)人冠状动脉和微血管内皮细胞来促进内皮化，具有为了血管作用的正确的生物学信号；(iii)防止内膜增生和再狭窄；(iv)促进血管生成；(v)可以为了长期保存期限干燥保存，随后在水合作用时转变为天然弹性状态。

在本示例中，铸造冰模的过程可拆分为设计、铸造以及涂覆三个主要阶段。在设计阶段(图1a)，对定制的阳模进行了数字化设计和3D打印。这为要设计的一系列血管结构提供了灵活性。然后将3D打印的阳模浸入聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)中，以生产惰性且可重复使用的阴模。具在浇铸阶段(图1b)，将水注入阴模并快速冷冻以形成原始数字设计形状的冰。快速冷冻的使用是可选的。然而，与将充水的PDMS模具放在冰柜中相比，快速冷冻大大加快了所述过程。

然后可以将冰从PDMS脱模以用作牺牲模具。然而，由于冰的脆性，对于非常薄的冰模，脱模的动作难度增加。因此，这种铸造方法最适合大直径血管设计。一旦将牺牲冰支架从PDMS模具或打印床(如果已进行3D打印)中移除，就可以选择经受进一步的快速冷冻过程，例如在液氮中。这有助于确保在涂覆过程之前将冰模完全冷冻。

在最后的涂覆阶段(图1c)，在冰模上浸涂溶解的原弹性蛋白以形成血管结构壁。再次将基底涂覆的冰模快速冷冻，以固化材料涂层。所述涂覆过程可以在正常的环境温度和条件下进行。在这个示例中，溶解的基底本身处于＜10℃的温度。这样，一旦基底与冰接触，温度差就最小化冰的融化。

现在介绍一种评估原弹性蛋白基铸件壁厚的方法。简而言之，通过将冰支架浸入溶解的原弹性蛋白中一段可变的时间长度(n＝3)来创建原弹性蛋白血管。将所得血管纵向切成三段，并在SEM下观察。分别在圆周周围大约0°、90°、180°以及270°处从每个横截面图进行4次壁厚测量。这样就对每个血管样品进行了12次均匀度测量。还包括涂覆PCL(使用浸入的原弹性蛋白血管<1秒)的样品，参见图8。

可以使用各种方法将冰支架选择性地涂覆多种材料(图12)。图12A示出了不同材料(i-iii)的三个不同层的添加。这可用于复制代表内膜、中膜以及外膜的天然血管结构。图12B示出了三个不同材料的不同层的选择性添加。通过在不同位置选择性地涂覆冰支架，可变的功能和壁厚(x，y和z)可以被赋予血管壁。例如，材料(i)可以是可渗透养分的多孔聚合物(例如琼脂糖)并且可用于输送养分，材料(ii)可以是促进血管细胞浸润的生物衍生的细胞外基质成分(例如原弹性蛋白，或胶原蛋白)，以及材料(iii)可以是合成的聚合物(例如聚己内酯)，所述合成的聚合物可以提高吻合处缝线保持的机械强度。图12C示出了通过不同方法将不同材料选择性添加至冰支架的不同部分。在该示例中，一种材料可以被直接涂覆在冰支架(i)上，另一种材料可以被直接浸涂在所述冰支架(ii)上，另一种材料可以被直接喷涂到冰支架上和/或直接喷涂到先有材料涂层(iii)，并且最终材料可以被浸涂到任何现有材料(iv)上。与图12B一样，以这种方式的材料的应用可以赋予血管壁可变的功能和壁厚(x、y以及z)。

在冰被在基底涂覆之后，再次快速冷冻。在以液体或液体溶液形式提供基底的情况下，该步骤尤其重要。涂覆后即时，所述基底可能仍处于液态。此时的快速冷冻使基底涂层冻结，以将所述基底涂层锁定为正确/所需的形状。该步骤还有助于防止基底融化冰模(由于涂覆即时存在温差)。快速冷冻后，可以将基底涂覆的冰模长期保存安全地在液氮中。

最后，冻干从基底涂层中去除了牺牲冰模和溶剂。发明人证明了使用冰模生产直径和壁厚不同的线性血管、分叉血管、多个分叉血管以及主动脉弓(图1d)。该总体过程使得将各种血管设计转变为独立的血管结构成为可能。

该示例报告了原弹性蛋白作为基底候选物的使用，(作为)一种既可溶于水又易于通过热处理稳定的蛋白。这是特别有利的，因为它避免了可能导致有毒残留物的化学溶剂或交联剂的使用。这种制冰系统的多功能性也允许所述模具被涂覆各种基底，以及不同基底的多涂层。尤其地，本文证明了使用原弹性蛋白、聚己内酯(polycaprolactone，PCL)、PDMS、丝及其组合制成的血管(图1e)。可以自由利用不同基底的组合，为针对特定机械和生物学应用调整血管提供了机会。

用于复杂血管设计的3D打印冰

为了改进冰模的制造，发明人开发了3D打印冰模以更精细的分辨率创建更复杂的血管设计的能力。3D打印冰直接到所需的模具中比铸造冰模具更具优势，因为这避免了将复杂而脆弱的冰模设计脱模的困难。对于3D打印冰模，首先创建数字化设计，然后输入切片器程序，以优化在冰印刷(图4a)期间内打印头移动的路径。这产生了打印脚本，所述脚本然后被加载到3D打印机中，所述3D打印机执行在冰上复制原始设计的指令。整个所述3D打印机放置在零下的温度下，其中水从外部血管中气动地输送到打印头(图4b)。使水以液体形式输送到打印头，但在沉积时冻结成冰，是必要的。为了防止冷凝损坏，所述3D打印机控制器被放置在零下环境之外。所述打印头外壳包括带有铝外壳的市售液滴发生器，所述铝外壳经过定制设计和加工以允许直接集成到原始打印机系统中(图7)。(所述打印头)还装有一个微分配阀，所述阀以可控的方式分配水以形成冰结构。水的热调节对于控制打印的保真度很重要。因此，所述定制的打印头还装有加热元件，所述元件提供对打印头组件的热控制，这对于在打印期间将水保持为液体是必要的。

打印的冰特征的分辨率与从微分配阀喷射的水流的质量成正比。该参数是驱动频率和气压的函数(图4c)。对于该示例，发明人发现需要最小为0.09atm的压力才能从微分配水阀中排出水，并产生水流。然而，在(水)流的稳定性上存在明显的差异，凭此(水)流倾向于在较低的频率和压力下喷射。这将显著降低3D打印冰的保真度和分辨率。为了评估排出的水的质量，发明人分析了由微分配阀排出的水滴的稠度。发明人发现，对于该特定设置，尽管较高压力0.1Hz和较高频率400Hz造成改善的液滴分辨率和稠度，200Hz的最小驱动频率产生规则间隔和大小的液滴。在理想条件下，液滴的直径测得约为0.5毫米。本领域技术人员将理解的是，对于不同的水喷射系统可能需要不同的压力和频率(完全不包括压力或频率)。

通过优化微分配阀的压力和驱动频率以及打印期间打印头的移动路径，复杂且详细的血管设计可以被准确地变成冰模。这样允许将3D打印的冰块特征的尺寸减小到大约1毫米直径。为了证明，发明人3D打印了分叉、网络以及回路的三个主要基本血管形状中的每一个的冰模设计，同时保持了打印特征的精度和一致性(图4d)。

冰支架可以被制作成带有外部支架的构造，所述外部支架也由冰制成(图10)。这样，材料可以被注入到内部和外部支架之间的腔体中以形成涂层。该构造还允许根据内部和/或外部支架的几何形状来改变壁厚的替代方法。在此示例中，所得壁厚将在x和y的尺寸之间逐渐减小。

可以制造具有附加表面特征的冰支架，以能够在铸件中制造腔体结构(图11)。在该示例中，所述冰支架被创建为包含肋状特征。这些腔体将被材料涂层浸润并复制所述结构。这可用于创建诸如静脉应用的腔体阀的特征。

3D打印机的改装以打印水

所有3D打印均使用蚕茧制造(Cocoon Create)3D打印机(Winplu，惟意，澳大利亚)执行，所述3D打印机使用定制设计的打印头进行了改装，以允许自动水沉积。技术人员将理解的是，可以使用任何可改装的3D打印机。所述打印头装有一个微分配阀(Lee Company，李公司)，用于分配气动控制的蒸馏水。微分配阀由驱动器(李公司)与微控制器板(ArduinoLLC，阿迪诺)生成的方波控制信号一起控制(图6)。

图6是用于微分配阀的驱动电子装置的示意图。所述电路允许来自3D打印机或手动优先特征(manual override feature)的信号驱动Arduino微处理器。所述Arduino微处理器随后向阀驱动器发送一个0V至+5V的方波控制信号。所述方波控制信号决定所述阀驱动器致动微分配阀的频率。为了操作所述阀，所述阀驱动器操作一个+21V的尖峰电压来致动所述阀，但很快又回到一个+3.3V的较低保持电压，所述电压足以维持所述阀的打开位置而不会使所述阀本身过热。

微控制器板可以手动和自动操作。在手动操作下，瞬时开关控制所述微控制器板以发出和终止方波控制信号。该控制信号被发送到所述微型阀的所述驱动器。在自动操作下，所述微分配阀能够与3D打印机轴向运动同步打开或关闭。手动操作的所述控制信号优先于自动操作的信号。

所述定制打印头旨在最大程度地减少与3D打印机集成的改装的需求(图7)。所述打印头模块是用铝加工而成的，由两个通孔组成，分别装有热传感器和加热元件，以及一个带中心螺纹的通孔，所述通孔中装有微分配阀。这种设计允许所述打印头装有原料(stock)加热元件和温度传感器以提供热控制。输水管在加热的打印头和位于零下周围环境外部的所述储水器之间充当输水器。所述3D打印机(包括所述打印机的改装)被放入冰柜(SANYO，三洋)，所述冰柜可提供-30℃的必要环境温度，以使喷出的水在沉积时冻结成冰。使用绝缘材料和与恒温器相连的绳索加热器(OmegaEngineeringInc.，欧米茄工程有限责任公司)的组合，将零下周围环境内部的输送管中的水保持在冰点以上。为避免冷凝的潜在有害影响，将所述电源和打印机控制单元放置在零下环境之外。

分级血管结构的设计与制造

3D打印冰还为给广泛的血管设计创建冰模提供了机会。然而，对于复杂的血管结构，必须考虑分级尺寸，以具有有效的流体流动。通过3D打印提高分辨率的最大优势之一是还可以对血管的尺寸有更好的控制，允许发明人制造真正的分级血管结构。就发明人所知的，这是新颖的，因为它利用诸如默里定律的设计参数作为使用生物材料工程化复杂的独立式血管结构的过程的一部分。作为概念的证明，发明人集中于在血管分支、网络以及回路中引入分级尺寸(hierarchical dimensioned)的分支。

在第一个实例中，发明人将分级尺寸引入了分叉的血管结构(图5a)。父分支的直径经过3D打印，比分叉的子分支更大，以便于节省质量并维持非湍流液体流动。这些直径之间的理想关系是由默里定律定义在前的，所述定律将分叉的子分支的尺寸与基于内腔(lumen-based)的系统的父分支关联。发明人证实，沿着分级中的每个分叉的子支和母支之间的关系与默里定律描述的理论一致(图5a)。

为了增加复杂性，在血管网络设计中引入了分级尺寸。在这种情况下，所述血管网络被定义为在所述网络的分支分级中包括多个层级的设计(图5b)。所述3D打印的冰模还被默里定律验证包含了遵循理论关系的父子分支(图5b)。此血管网络设计附带说明了3D打印系统的下限是大约1毫米直径的分支。该限制由当前的硬件决定，并将随着系统的进一步优化和升级而提高(改善)。当前系统不对可打印分级网络的上限强加此类限制。因此，可以对直径范围内的分级血管网络3D打印冰模。

最终，发明人将分级尺寸引入血管回路设计。在这种情况下，血管回路被定义为一种设计，所述设计分叉到分级中较小直径的分支，但又汇聚回到相同结构内的较大直径分支。(图5c)在此3D打印模具中，默里定律验证了父和子分支之间的关系，所述分支沿着沿层级的分叉和汇聚分支(图5c)。所述3D打印冰模用于分级血管回路的能力是(作为)制造血管床结构以支持体外合成组织生长的概念性先驱。

接下来，将用于分级血管分叉、网络以及回路的冰模浸涂在丝中以形成独立的血管结构(图5d-f)。这些血管结构随后被证实可被灌注液体(图5g-i)。共同地，这些步骤证明了设计、涂覆和实施有效的分级血管设计的简单性。

用于更错综和复杂脉管系统的3D打印冰模为血管结构提供了巨大潜力，所述血管结构是为了特定目的而设计。这些范围可以是从患者受损的分叉血管的替换到为支持合成组织生长的整个分级血管网络系统。对于这些应用，这种制造方法具有复制生物脉管系统和设计合成血管系统的能力。后者需要考虑流体流动的机械效应，尤其是在分叉区域。

图9展示了制造冰支架的能力，所述冰支架是独立的并且可以分支到空间中。所述分级尺寸在制造过程中得以保留，以三个分级的级为例(分别标记为A、B以及C)。A级分支的直径为4毫米、B级分支的直径为3.17毫米、C级分支的直径为2.5毫米。

物理机械性能

然后使制成的血管经受一系列的物理和机械测试，以验证所述血管对移植的适合性。在扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)下的检查显示，原弹性蛋白血管具有多孔的腔表面，所述腔表面的孔的直径小于10μm(图2a)。这些孔连接到血管壁内的子结构(图2a缩放)。原弹性蛋白血管的横截面显示了在腔体和外腔表面之间径向连接的通道(图2b)。这些通道的宽度大约为2μm(图2b缩放)，允许在腔体和外腔表面之间的扩散。由于横截面血管壁中的均匀且规则的结构，原弹性蛋白血管被认为是横向各向同性的，使得在圆周和纵向方向上的机械性能是相等的。所述外腔表面也是多孔的(图2c)，尽管所述孔的大小比在腔表面观察到的小得多。类似于腔表面，外腔表面上的孔也连接到血管壁内的子结构(图2c缩放)。共同地，所述腔和外腔表面之间的渗透性表明了在所述腔和外腔空间之间营养物扩散的潜在功能。

接下来，本发明人以50mm/min的应变速率和15％的延伸率使原弹性蛋白血管经受了循环拉伸测试。所得的循环应力-应变曲线在形状和大小上相似，表明材料在生理环境典型的应变条件范围内得一致的机械性能(图2d)。滞后性在循环应力-应变曲线中很明显，对于所有测试样品，在整个500个循环中计算出的能量损耗为76.60±1.40％(图2e)。尽管关于人类血管中确切能量损失的信息有限，但是与文献中15-20％的血管的范围相比，原弹性蛋白血管的计算能量损失相对较高。然而，这种差异可能归因于原弹性蛋白血管中平滑的肌肉组织和胶原蛋白的缺乏。这样，发明人期望植入后的细胞浸润和随后的重塑将导致两种成分的增加，使得能量损失可以随时间在原位改善。尽管有这种能量损失，所述叠加的应力应变循环表明在测试条件下所述血管没有塑性变形。

原弹性蛋白血管的循环应力-应变图的加载阶段反映了双相机械性能，凭此所述刚度最初较高，但在第二阶段降低，而柔度最初较低，但在第二阶段提高(图2d)。刚度和柔度改变的点称为临界应力。关于破裂压力，该性能表明小变形随着所述原弹性蛋白血管支撑压力增加，直到临界应力，此后压力的小幅增加将导致大变形。因此，所述临界应力有效地定义了所述血管的所述破裂压力。对于原弹性蛋白血管，该破裂压力不足以维持动脉血压。因此，本申请人用聚己内酯(polycaprolactone，PCL)(一种常用的且经FDA批准的生物材料)附加涂覆了原弹性蛋白的血管。与没有PCL的原弹性蛋白血管的破裂压力21.23±0.71mmHg相比，涂覆PCL的原弹性蛋白实现了1128.33±68.82mmHg的破裂压力。这种改进的破裂压力更接近于人体大隐静脉的破裂压力(1599±877mmHg)(图2f)，这是目前自体血管移植的基准标准。最初的外科手术植入时原弹性蛋白/PCL血管将承受超生理学血压，这表明了在移植应用中立即手术成功的有利条件。

与没有PCL的原弹性蛋白血管相比，原弹性蛋白血管中PCL的添加(附加)也显著增加了杨氏模量。这种增加取决于添加的PCL的层数，更多的PCL层显著提高了杨氏模量。尤其地，五层PCL产生的杨氏模量可与大隐静脉的圆周模量和纵向模量相当(图2g)。同样，PCL的添加也会提高极限抗拉强度(ultimate tensile strength，UTS)。与没有PCL的原弹性蛋白血管相比，至少需要3层PCL的添加才能显著提高(图2h)。5层PCL的添加产生的UTS更接近大隐静脉的周向极限拉伸强度(1.8±0.8MPa)。

与没有PCL的原弹性蛋白相比，通过以层依赖(layer dependent)的方式向原弹性蛋白血管添加PCL，缝合固持强度也显著提高(图2h)。比较无PCL的原弹性蛋白、无原弹性蛋白的3层PCL以及有3层PCL的原弹性蛋白的缝合固持强度时，观察到了加性关系。这表明原弹性蛋白/PCL血管的缝合固持强度是原弹性蛋白和PCL的缝合强度之和。这进一步显示，所述机械性能可以通过组合不同的材料模块化。与大鼠腹主动脉和人隐静脉的缝合固持强度(196±2gf)相比，原弹性蛋白/PCL血管的缝合固持强度更高。

生物整合的特征

接下来，从生物学的角度研究了人造血管的性能。100％胎牛血清(foetalbovineserum，FBS)中原弹性蛋白血管的降解(模拟了体内条件)，被相对于作为基线控制(对照)的磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered solution，PBS)评估。所述原弹性蛋白血管14天后仍能保持血管的物理完整性(血管保持管状)(图3a)。在PBS中培养后，所述原弹性蛋白血管在最初6小时后的质量保留率为95.56±6.49％，这与在100％FBS中培养且质量保留率为96.99±2.19％的血管相当(图3b)。在最初的6小时内，相对较快且相对相似的初始质量损失可能是由于血管浸入液体介质时脱落的不稳定蛋白质所致。到第14天结束时，在PBS中培养的原弹性蛋白血管的质量保留率没有明显(显著)变化，保持在93.61±1.59％。直到第3天，在100％FBS中培养的原弹性蛋白血管显示出明显的质量损失，导致质量保留率为77.77±7.71％。但是，在第3天之后，没有进一步的质量损失，而保留的质量一直保持不变，直到第14天结束。这显示所述血管已经稳定下来。发明人没有评估原弹性蛋白/PCL血管，因为已知PCL降解相对缓慢。

接下来，本发明人评估了原弹性蛋白的血管壁的葡萄糖扩散。通过测量葡萄糖在原弹性蛋白血管的腔体和外腔空间之间的被动扩散(图3c)，发明人验证了所述原弹性蛋白血管在支持合成组织生存能力(方面)的潜力。测得葡萄糖通过原弹性蛋白血管的扩散速率为0.384±0.088mmol/m2/min，这与全身葡萄糖摄取的0.4–2.1mmol/m2/min的相当(相对于身体组织面积而言)。然而，应该注意的是，由于毛细血管和微脉管系统的量的存在，相同面积的身体组织通常将具有较大的血管组织面积。因此，可以推断出，一旦针对血管组织的相应面积进行标准化，在全身组织中的葡萄糖扩散速率将降低，变得与测得的原弹性蛋白血管的葡萄糖扩散速率更直接地可比。

发明人还评估了原弹性蛋白血管的生物相容性。将原弹性蛋白血管样品接种人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，并培养长达1周，以评估所述原弹性蛋白血管样品支持细胞粘附和增殖的能力。在7天的过程中，细胞DNA含量有明显的倍数变化，表明所述原弹性蛋白血管在这段时间内支持HUVEC增殖(图3d)。共焦显微镜图像进一步验证了细胞粘附和增殖，显示HUVEC在7天的过程中形成了单层，同时保持了正确的鹅卵石外观(图3e)。3Dz-堆图像证实所述细胞形成了特征性单层(图3f)，这也是体内内皮化的预期结果。

也通过原弹性蛋白血管结合到改造的兰根道尔夫氏灌注(Langendorffperfusion)系统中，在模型化的生理环境中刺激原弹性蛋白血管。对原弹性蛋白的扩张和收缩回原始物理形状的引入的脉动血流引起的观察(introduced pulsatile flowelicited observations)，表明所述血管没有塑性变形(图3g)。

将理解的是，在本说明书中公开和定义的本申请扩展到所提到的或从文本或附图中显而易见的两个或更多个单个特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成了本申请的各种替代方面。

Claims (21)

1.一种制造铸件的方法，其特征在于，所述方法包括：

应用基底到牺牲冰模上，所述牺牲冰模包括成形的非平面的接收表面以接收所述基底并提供所述基底的铸件，所述基底的铸件具有与所述接收表面相对应的成形结构；

快速冷冻牺牲冰模和铸件，和

使牺牲冰模和铸件经受冷冻干燥条件，并从所述铸件升华牺牲冰模，以形成包括所述成形的非平面结构的铸件制品；

通过将所述牺牲冰模浸涂到所述基底中或者将所述基底喷涂到所述牺牲冰模的接收表面上，将所述基底应用到所述牺牲冰模上。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牺牲冰模由具有至少为0.1GPa的杨氏模量材料形成。

3.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述基底包括一种或多种选自以下组的材料：聚合物、树脂、单体、蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、无机纤维、有机纤维、植物或动物组织、植物或动物细胞、食物材料、陶瓷材料、以及包括前述至少一种的复合材料、以及所述材料的混合物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将基底应用到所述牺牲冰模的步骤之前，所述方法还包括从下选择的方法形成所述牺牲冰模：从固态牺牲冰模材料雕刻或加工所述牺牲冰模；或浇铸或3D打印液态模具材料并固化所述液态模具材料以形成所述牺牲冰模。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，形成所述牺牲冰模的步骤包括3D打印所述液态模具材料。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述3D打印所述液态模具材料的步骤在比所述液态模具材料的固相线温度至少低5℃的环境中进行。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将基底应用到所述牺牲冰模以在所述牺牲冰模的所述接收表面上形成所述基底的铸件的步骤包括形成有10mm或更少的层厚度的所述基底的层。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在从所述基底升华所述牺牲冰模的步骤之后，所述方法还包括将一个或多个涂层应用到所述铸件制品的至少一个表面上，和形成涂覆的和/或多层的铸件制品。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接收表面是外接收表面，并且将基底应用到所述牺牲冰模的步骤包括用所述基底涂覆所述外接收表面的至少一部分。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，通过将所述牺牲冰模浸涂到所述基底中或者将所述基底喷涂到所述牺牲冰模的外接收表面上，将所述基底应用到所述牺牲冰模的外接收表面上。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述基底应用到所述牺牲冰模的步骤包括围绕所述牺牲冰模的管状接收表面形成所述基底的管状层。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在从所述基底升华所述牺牲冰模的步骤之前，所述方法还包括将一个或多个涂层涂覆到所述铸件的至少一个表面上，和形成涂覆的和/或多层的铸件。

13.一种制造具有内部分级结构的铸件生物材料的方法，其特征在于，所述方法包括：

涂覆生物材料到具有分级结构的牺牲冰模的外表面的至少一部分上，并在牺牲冰模上形成生物材料的铸件，所述铸件具有与牺牲冰模的外表面相对应的内部分级结构；

快速冷冻牺牲冰模和铸件，和

使所述铸件经受温度和压力以冻干来自所述铸件的所述牺牲冰模，以形成具有内部分级结构的所述铸件生物材料。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述分级结构包括一个或多个分支，所述一个或多个分支的横截面积对应于50mm或更小的直径。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述横截面积对应于5mm或更小的直径。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其特征在于，在将生物材料涂覆到所述牺牲冰模的至少一部分外表面的步骤之前，所述方法还包括通过3D打印水形成所述牺牲冰模以形成所述牺牲冰模。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述3D打印水的步骤在比水的固相线温度至少低5℃的环境中进行。

18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，将生物材料涂覆到所述牺牲冰模的至少一部分外表面的步骤形成了壁厚为10mm或更少的所述铸件。

19.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述分级结构包括至少一个父血管和从所述父血管的末端延伸出的多个子血管，并且其中，所述父血管和所述多个子血管的尺寸依大小排列，使得所述分级结构遵守默里定律。

20.一种根据前述权利要求中任一项所述的方法制造的铸件制品。

21.一种根据权利要求1至19中任一项所述的方法形成的分级血管结构。

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