CN112280774A - 一种dna钠盐和抗菌肽联合制备的方法 - Google Patents

一种dna钠盐和抗菌肽联合制备的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，方法是以肝素废水为原料，同时制备DNA钠盐和抗菌肽，包括如下步骤：(1)超滤浓缩；(2)DNA钠盐制备：①CaCl2沉淀；②CaCl2再沉淀；(3)抗菌肽制备：①(NH4)2SO4沉淀；②凝胶层析。本发明的方法能同时制备两种活性物质，反应条件温和，操作简单，可大量回收肝素废液，高效利用，做到废物利用，环保节能。

Description

一种DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，尤其是涉及到一种DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法。
背景技术
抗菌肽多由13-45个氨基酸组成，强碱性，常带正电荷，具两亲结构(即一端具有亲水结构一端具有疏水结构)。抗菌肽具有抗细菌、霉菌、病毒、原虫、癌细胞、螺旋体等多种活性，且不易产生耐药性。
研究表明，抗菌肽的抗菌谱广、杀灭微生物的作用强，在抑制细菌移位、防治感染方面效果特异。过去数十年，随着抗生素的普遍应用，细菌的耐药性逐渐增强，人们对此也越来越关注，在某些情况下这甚至可能导致诸如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素耐药菌(VRE)等“世界末日”微生物的出现。然而这些耐抗生素的细菌基本上都对抗菌肽敏感，由于抗菌肽非特异性的天然生物活性，它可以作为两性分子插入细菌的细胞膜造成膜孔导致渗透裂解。因此，作为天然的杀菌剂，抗菌肽是新的或替代性的抗菌疗法的有力候选者。
DNA钠盐来源于动物内脏基因组DNA，可通过控制解聚制得单链的脱氧核糖核酸(DF)。
研究表明DF主要通过影响血管内皮细胞应答和血小板活性来发挥多种生物学功能。DF 中存在可与腺苷A1及A2受体相互作用的核酸适配体，进而减低内皮细胞对损伤的应答，起到保护血管内皮的作用。
体外实验和动物体内实验已经证实，DF可以刺激前列环素PGI2的释放，PGI2主要是由血管内皮和血小板合成分泌，通过增加cAMP的水平来起到舒张血管和抑制血小板聚集的作用。
动物脏器来源的DNA钠盐和抗菌肽，可以利用提取肝素后的废液来提取，环保节能，有原料的便利性，也可充分利用废液，做到物尽其用，减少排放。对于DNA钠盐和抗菌肽的联合制备并未见报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种以动物脏器提取肝素粗品后的废液为原料，联合制备DNA钠盐和抗菌肽的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，包括如下步骤：
(1)超滤浓缩：生产肝素产生的废水，过滤后用3kDa膜超滤浓缩至原体积的1/5-1/10，得到高浓度废液。
(2)DNA钠盐制备：
①CaCl2沉淀：浓缩后料液加料液体积的2-2.5％(w/v)无水氯化钙搅拌溶解，调节pH3.9-4.1，离心得到DNA钠盐沉淀(a)和含蛋白上清液(b)。
②CaCl2再沉淀：沉淀(a)用水溶解成2-5％(w/v)的浓度，加料液体积2-3％(w/v)无水氯化钙充分搅拌，调pH7.9-8.1，离心后弃去沉淀(此部分沉淀含杂质较多，比旋度较低)，将上清液pH调至2.9-3.1，离心，弃去上清，将沉淀用水溶解，调节pH至9.9-10.1，加料液体积1％(w/v)的Na2CO3充分溶解，离心，上清液过滤澄清，调pH7.9-8.1，加入到足量95％乙醇中沉淀，脱水烘干，得到DNA钠盐粗品。
(3)抗菌肽制备：
①(NH4)2SO4沉淀：将DNA钠盐制备步骤①离心后上清液(b)，调pH至7.9-8.1，加入(NH4)2SO4至饱和，并维持pH7.9-8.1，析出沉淀。
②凝胶层析：沉淀用水溶解，调pH7.0，G-10凝胶柱脱盐，冻干，得抗菌肽。
本发明的优点和积极效果是：
1.本发明的方法用一种废液制备两种活性物质，利用率高，且试剂均为常见试剂，成本低。
2本发明的方法反应条件温和，高效利用生产肝素粗品产生的废液，做到废物利用，环保节能。
附图说明
图1为产品与庆大霉素抑菌圈大小对比(1、空白对照，2、3粗肽产品，4、35μg/ml的庆大霉素)
图2为产品与庆大霉素抑菌活性数据对比
具体实施方式
实施例1，一种DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，包括如下步骤：
(1)超滤浓缩：10kg猪小肠提取肝素后废液50L过滤，过滤后用3kDa膜超滤浓缩至5L。
(2)DNA钠盐制备：
①CaCl2沉淀：浓缩后料液加100g无水氯化钙搅拌，调节pH3.9-4.1，离心得到沉淀(a) 和上清液(b)。
②CaCl2再沉淀：沉淀(a)用水溶解成2％(w/v)浓度，加料液体积3％(w/v)无水氯化钙充分搅拌，调pH7.9-8.1，离心后弃去沉淀，将上清液pH调至2.9-3.1，离心，弃去上清，将沉淀用水溶解，调节pH至9.9-10.1，加料液体积1％(w/v)Na2CO3充分溶解，离心，上清液过滤澄清，调pH7.9-8.1，加入到料液体积8倍(v/v)的95％乙醇中沉淀，脱水烘干，得到DNA钠盐粗品2g。
(3)抗菌肽制备：
①(NH4)2SO4沉淀：将DNA钠盐制备步骤①离心后上清液(b)，调pH至7.9-8.1，加入(NH4)2SO4至饱和，并维持pH7.9-8.1，析出沉淀。
②凝胶层析：沉淀用水溶解，调pH7.0，G-10凝胶柱脱盐，冻干，得抗菌肽7g。
实施例2，一种DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，包括如下步骤：
(1)超滤浓缩：20kg猪肺提取肝素后废液35L过滤，过滤后用3kDa膜超滤浓缩至7L。
(2)DNA钠盐制备
①CaCl2沉淀：浓缩后料液加140g无水氯化钙搅拌，调节pH3.9-4.1，离心得到沉淀(a) 和上清液(b)。
②CaCl2再沉淀：沉淀用水溶解成2％(w/v)浓度，加料液体积2.5％(w/v)的无水氯化钙充分搅拌，调pH7.9-8.1，离心后弃去沉淀，将上清液pH调至2.9-3.1，离心，弃去上清，将沉淀用水溶解，调节pH至9.9-10.1，加料液体积1％(w/v)Na2CO3充分溶解，离心，上清液过滤澄清，调pH7.9-8.1，加入到料液体积8倍(v/v)的95％乙醇中沉淀，脱水烘干，得到DNA钠盐粗品3g。
(3)抗菌肽制备
①(NH4)2SO4沉淀：将DNA钠盐提取步骤①离心后上清液收集，调pH至7.9-8.1，加入(NH4)2SO4至饱和，并维持pH7.9-8.1，析出沉淀。
②凝胶层析：沉淀用水溶解，调pH7.0，G-10凝胶柱脱盐，冻干，得抗菌肽10g。
实施例3，一种DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，包括如下步骤：
(1)超滤浓缩：15kg牛肺提取肝素后废液25L过滤，过滤后用3kDa膜超滤浓缩至4L。
(2)DNA钠盐制备
①CaCl2沉淀：浓缩后料液加90g无水氯化钙搅拌，调节pH3.9-4.1，离心得到沉淀(a) 和上清液(b)。
②CaCl2再沉淀：沉淀(a)用水溶解成2％(w/v)浓度，加料液体积2％(w/v)无水氯化钙充分搅拌，调pH7.9-8.1，离心后弃去沉淀，将上清液pH调至2.9-3.1，离心，弃去上清，将沉淀用水溶解，调节pH至9.9-10.1，加料液体积1％(w/v)Na2CO3充分溶解，离心，上清液过滤澄清，调pH7.9-8.1，加入到8倍体积(v/v)的95％乙醇中沉淀，脱水烘干，得到DNA钠盐粗品2.5g。
(3)抗菌肽制备
①(NH4)2SO4沉淀：将DNA钠盐制备步骤①离心后上清液(b)收集，调pH至7.9-8.1，加入(NH4)2SO4至饱和，并维持pH7.9-8.1，析出沉淀。
②凝胶层析：沉淀用水溶解，调pH7.0，G-10凝胶柱脱盐，冻干，得抗菌肽9g。
实施例4，肽抗菌活性：
1、实验方法：牛津杯双层平板法
将大肠杆菌(购于上海汉尼生物技术有限公司)接种于检测培养基中，37℃恒温箱中培养24小时。将加热溶化的检测培养基20ml注入平皿中作为底层(琼脂浓度2％)，使其在平皿底部均匀摊布。凝固后，另取加热溶化冷却至45℃检测培养基5ml(琼脂浓度1％)，加入3ml细菌悬液(菌液浓度为105-106cfu.ml-1)，用振荡器迅速混匀后，注入平皿琼脂层上使其均匀摊布，作为菌层。待凝固后，对称放置4个灭菌的牛津杯(内径6.0±0.1mm，外径 7.8±0.1mm，高度10±0.1mm)，每个牛津杯之间的距离为2.5cm，在平皿的底部相对于牛津杯的位置作1、2、3、4号样本标记。称取实施例1和实施例2中得到的抗菌肽产品各5mg，用50ml去离子无菌水稀释，第1号牛津杯中加入无菌水0.1ml，第2、3号牛津杯中加入抗菌肽溶液0.1ml，第4号牛津杯中加入35μg/ml的庆大霉素0.1ml，5个皿为一组平行实验，在37℃恒温箱培养24h，测量牛津杯周围的抑菌圈。游标卡尺测定抑菌圈直径，并根据其直径大小判断抑菌活性的强弱。
2、实验结果
结果见图1，图2，从两图看出，此发明所得抗菌肽对大肠杆菌有明显的抑菌作用，活性与35μg/ml的庆大霉素大致相同。
实施例5，DNA钠盐增色反应：DNA分子具在260nm处有吸收峰，其碱基是紫外吸收的结构基础，但双螺旋结构使碱基有序堆积，束缚了紫外吸收作用。双链DNA变性后双螺旋解开，碱基外露，有利于紫外吸收，故而产生增色效应。可逆增色值可表示双链DNA分子所占比例。
1、实验方法：可逆增色值h(15±5)
①氯化钠-磷酸盐缓冲溶液的制备：分别称取氯化钠2.192g，磷酸氢二钠0.3865g，磷酸二氢钠0.0655g，溶于250mL水中。
②样品溶液的制备：取实施例1中制得的DNA钠盐样品，溶成4mg/mL浓度，取375μL，用氯化钠-磷酸盐缓冲溶液稀释定容至100mL(0.015mg/mL)。
③样品处理溶液的制备：取②制得的样品溶液(0.015mg/mL)6ml，置具塞试管中，加饱和氢氧化钠溶液0.1ml，摇匀，加塞，置80℃水浴中保温10min，取出后迅速冷却至室温。
④测定：在260nm处测定样品溶液吸光度A1、样品处理溶液吸光度A2。计算：可逆增色值h＝(A2-A1)/A1*100％
2、实验结果：h＝(0.33-0.286)/0.286＝15.38。

Claims (8)

1.一种DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，其特征是联合制备DNA钠盐和抗菌肽。
2.一种DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，其特征是以生产肝素产生废水为原料，用超滤、CaCl2沉淀、(NH4)2SO4沉淀和凝胶层析的方法制备DNA钠盐和抗菌肽，包括以下步骤：
(1)超滤浓缩：将肝素废水过滤，3kDa膜超滤浓缩；浓缩至原体积1/5-1/10，
(2)DNA钠盐制备
①CaCl2沉淀：向浓缩后料液中加入料液体积1.5-3.0％(w/v)的无水CaCl2，溶解搅拌，调节pH3.8-4.2，离心得到沉淀(a)和上清(b)；
②CaCl2再沉淀：沉淀(a)用适量纯化水溶解，加入料液体积1.5-3.0％(w/v)的无水CaCl2充分搅拌溶解，调节pH至7.8-8.2，离心弃去沉淀，将上清液pH调至至2.9-3.1，离心获得沉淀。沉淀用适量水溶解，调节pH至9.8-10.2，加入料液体积1％(w/v)Na2CO3，充分溶解后离心，离心上清液过滤，调节pH至7.8-8.2，6-9倍乙醇沉淀并烘干，获得DNA钠盐；
(3)抗菌肽制备：
①(NH4)2SO4沉淀将步骤(2)中分步骤①中获得的上清液(b)pH调节至7.8-8.2，加入(NH4)2SO4至饱和，维持pH7.8-8.2，析出沉淀；
②凝胶层析：将沉淀用适量水溶解，调pH至6.9-7.1，G-10凝胶柱脱盐，冻干，获得抗菌肽。
3.根据权利要求2所述的DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，其特征是所用的肝素废水来自于以猪小肠黏膜、猪肺、牛肺和羊肺为原料，经酶解、阴离子树脂交换吸附肝素后的废水。
4.根据权利要求2所述的DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，其特征是步骤(2)①中加入的无水CaCl2的量为料液体积的2-2.5％(w/v)。
5.根据权利要求2所述的DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，其特征是步骤(2)①中调节pH至3.9-4.1时离心分离成沉淀和上清。
6.根据权利要求2所述的DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，其特征是步骤(2)②中加入的无水CaCl2的量为料液体积的2-3％(w/v)。
7.根据权利要求2所述的DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，其特征是步骤(2)②中调节pH7.9-8.1时弃去沉淀，再调节pH2.9-3.1时保留沉淀。
8.根据权利要求2所述的DNA钠盐和抗菌肽联合制备的方法，其特征是步骤(3)①中应不断调节溶液的pH值保持在7.9-8.1。
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