CN112280773A - 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺 - Google Patents

一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种制备2‑氨基‑3‑取代苯基‑3‑羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，以固定化醛缩酶为生物催化剂，取代苯甲醛、甘氨酸为底物，二价金属离子为酶促剂，水为溶剂，PH6～9，温度35～65℃，酶促反应设计成极快速的流式反应，整个反应液以100～800BV/h通过催化固定床进行酶催化。采用含有特定络合树脂的分离固定床对过量原料和产物进行分离，并完全去除二价金属离子酶促剂，甘氨酸稀溶液浓缩后回收套用，2‑氨基‑3‑取代苯基‑3‑羟基丙酸浓缩析晶干燥得到产品，浓缩得到的水回收套用。本发明酶催化转化率在96％以上，产品分离效率在94％以上，形成了一套溶剂物料自我循环，无三废排放的绿色环保生产工艺。

Description

一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式 工艺
技术领域
本发明涉及化合物制备技术领域，具体涉及一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺。
背景技术
2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸是一类重要的药物中间体和化工中间体，特别是2-氨基-3-(4-甲砜基苯基)-3-羟基丙酸和2-氨基-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸，广泛用于人类抗生素，家禽家畜类抗生素制备等，其代表药物如氯霉素，甲砜霉素，氟苯尼考等等。
2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的合成目前主流是化学合成法。化学合成法虽然操作简单，但是反应过程中用到了大量的水，重金属和剧毒的硫化氢，并且生产过程中的能耗高，所需场地多，不符合目前和将来国家提倡和推进的原子经济学和环境保护政策。而酶催化法具有条件温和，用水量少，没有重金属污染，不使用剧毒化学品，低能耗，单位面积产量高等诸多优点。目前2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的工业生物合成方法没有报道，本发明采用生物酶催化技术结合流式反应工艺，设计出一种绿色环保，高效节能的新工艺，填补了本类产品的工业生物合成空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，以解决现有技术的不足。
本发明采用以下技术方案：
一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，包括如下步骤：
(1)、在磷酸缓冲液中将醛缩酶固定至大孔吸附树脂上，得到固定化醛缩酶；其中，醛缩酶为基因改造醛缩酶，利用工程酶Cc-H91A178对新月柄杆菌醛缩酶位点进行突变，其中91位由组氨酸变更为丙氨酸，178位由丙氨酸变更为酪氨酸；新月柄杆菌醛缩酶的序列为SEQ ID NO：1所示，工程酶Cc-H91A178的序列为SEQ ID NO：2所示；
(2)、甘氨酸溶于水中，再加入取代苯甲醛和二价金属离子酶促剂，调节PH，得到溶液；在酶催化固定床中填充步骤(1)制备的固定化醛缩酶，将配制的溶液在一定温度下以一定流速流过酶催化固定化床，收集流出液，得到反应混合物溶液；其中，以水为溶剂，二价金属离子为酶促剂，固定化醛缩酶为催化剂，取代苯甲醛和甘氨酸为原料底物进行反应，合成路线如下：
Figure BDA0002766084970000021
(3)、将步骤(2)得到的反应混合物溶液和水分别通过填充有络合树脂的分离固定床分离成甘氨酸稀溶液和2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸稀溶液，二价金属离子酶促剂被分离固定床的络合树脂吸附除去；
(4)、甘氨酸稀溶液浓缩后回收套用到步骤(2)中，2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸稀溶液浓缩后，降温析晶、真空干燥后得到2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸成品；其中，在浓缩过程中产生的水将重新回套至步骤(3)分离步骤。
进一步地，步骤(1)磷酸缓冲液浓度为0.1M～1M，PH为7～8，配制成含醛缩酶10mg～300mg/L的酶溶液。
进一步地，步骤(1)大孔吸附树脂包括D301、ZGA451或DX110，醛缩酶和大孔吸附树脂的添加比例为1000U/g～5000U/g。
进一步地，步骤(1)固定化温度为4～10℃，固定化时间为12～24h。
进一步地，步骤(2)取代苯甲醛质量为溶剂质量的0.5～3％，取代苯甲醛和甘氨酸的摩尔比为1：1～3.5，固定化醛缩酶体积为溶剂体积的0.2％～5％。
进一步地，步骤(2)二价金属离子酶促剂包括Ni2+、Co2+、Zn2+或Fe2+的盐酸盐或硫酸盐，添加比例为取代苯甲醛的0.01mol％～2mol％。
进一步地，步骤(2)中PH为6～9，温度为35～65℃，流速为100～800BV/h。
进一步地，步骤(3)中分离固定床中填充的络合树脂包括HZ930、XAX7或ZGC107MB。
进一步地，步骤(3)中络合树脂和反应混合物溶液的体积比为1:1～1.5，反应混合物溶液流速为10～30BV/h，络合树脂和水的体积比为1:2～4，水流速为10～30BV/h；前1～2倍络合树脂体积的流出液为甘氨酸稀溶液，其后的流出液为2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸稀溶液。
进一步地，步骤(4)中析晶温度为-5～10℃，析晶时间为10～20h，50～80℃下真空干燥。
本发明的有益效果：
本发明一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，所述工艺中以固定化醛缩酶作为生物催化剂，固定化醛缩酶由基因改造醛缩酶于磷酸缓冲液中固定在特定的大孔吸附树脂上得到，基因改造醛缩酶是利用工程酶Cc-H91A178对新月柄杆菌醛缩酶位点进行突变，其中91位由组氨酸变更为丙氨酸，178位由丙氨酸变更为酪氨酸；新月柄杆菌醛缩酶的序列为SEQ ID NO：1所示，工程酶Cc-H91A178的序列为SEQ ID NO：2所示。固定化醛缩酶填充在酶催化固定化床中制备成高流量的催化固定床。以取代苯甲醛、甘氨酸作为原料底物，二价金属离子作为酶促剂，以水为溶剂，控制PH在6～9，温度在35～65℃，酶促反应设计成极快速的流式反应，整个反应液以每小时100～800倍BV通过催化固定床进行酶催化，获得高转化率的2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸。采用含有特定络合树脂的分离固定床对过量原料和产物进行分离，并完全去除反应中的二价金属离子酶促剂，甘氨酸稀溶液浓缩后可以进行回收套用，2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸进行后续浓缩析晶干燥得到产品，浓缩得到的水也可以进行回收套用。本发明通过填充固定化醛缩酶的固定床，高速流式生物酶催化反应过程，特定络合树脂的分离固定床以及它们之间的有效组合，酶催化转化率在96％以上，产品分离效率94％以上，形成了一套溶剂物料自我循环，无三废排放的绿色环保生产工艺。
本发明采用了生物酶催化和流式反应结合的绿色工艺来合成2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸，避免了传统化学工艺所使用的有毒化学品和溶剂，达到了零排放的环保指标，并且单位面积场地的生产效率是传统化学合成工艺的50倍或更高，降低了生产成本和生产时间；本工艺遵循溶剂、酶催化树脂、原料回收再循环利用的原则，将物料的利用率最大化，减少废料的同时降低了成本；流式反应工艺能够将生物酶催化的转化率提高到96％以上，克服了普通酶催化工艺转化率不足的缺点，是高效率、低能耗、零排放的绿色环保工艺。
附图说明
图1是本发明工艺流程示意图。
图2是2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸的HPLC图(2.776min是2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸出峰时间，9.137min是对甲砜基苯甲醛出峰时间，峰面积比例是98％：2％)。
图3是2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸的1H-NMR图谱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，如图1所示，包括如下步骤：
(1)、在磷酸缓冲液中将醛缩酶固定至大孔吸附树脂上，得到固定化醛缩酶；其中，醛缩酶为基因改造醛缩酶，利用工程酶Cc-H91A178对新月柄杆菌醛缩酶位点进行突变，其中91位由组氨酸变更为丙氨酸，178位由丙氨酸变更为酪氨酸；新月柄杆菌醛缩酶的序列为SEQ ID NO：1所示(MTQTAPRYDFASDNVAGAMPEVMEALIAANAGTASGYGTDHVSRAAADRIRAALDADAQVRFTASGTAANAFALTLLAQPHEAVLAHEHAHICTYTTGAPGFFGQGVGLIGLPGASGKMELAALEAALAQPDVSYRQPAAALSLTTATEYGTVYSEDHLRALIAPVKAKGYGVHLDGARLANAVAGGFDLKSIAKMGVDILVMGGTKAGSTPTEAVVFLNPDHAKRLDARLKHAGQLISKGRFLAAPWLGLLGENGQTAPWAARAAHANAMAQKLAALMPVPIKHPVEANGIFVEMDELALERLRGEGWFVYRFLDGTVRFMCSWATTPEMVEDLGAALKRVA)，工程酶Cc-H91A178的序列为SEQ ID NO：2所示(MTQTAPRYDFASDNVAGAMPEVMEALIAANAGTASGYGTDHVSRAAADRIRAALDADAQVRFTASGTAANAFALTLLAQPHEAVLAHEHAAICTYTTGAPGFFGQGVGLIGLPGASGKMELAALEAALAQPDVSYRQPAAALSLTTATEYGTVYSEDHLRALIAPVKAKGYGVHLDGYRLANAVAGGFDLKSIAKMGVDILVMGGTKAGSTPTEAVVFLNPDHAKRLDARLKHAGQLISKGRFLAAPWLGLLGENGQTAPWAARAAHANAMAQKLAALMPVPIKHPVEANGIFVEMDELALERLRGEGWFVYRFLDGTVRFMCSWATTPEMVEDLGAALKRVA)；磷酸缓冲液浓度为0.1M～1M，PH为7～8，配制成含醛缩酶10mg～300mg/L的酶溶液；大孔吸附树脂包括D301、ZGA451或DX110，醛缩酶和大孔吸附树脂的添加比例为1000U/g～5000U/g；固定化温度为4～10℃，固定化时间为12～24h；
(2)、甘氨酸溶于水中，再加入取代苯甲醛和二价金属离子酶促剂，调节PH，得到溶液；在酶催化固定床中填充步骤(1)制备的固定化醛缩酶，将配制的溶液在一定温度下以一定流速流过酶催化固定化床，收集流出液，得到反应混合物溶液；其中，取代苯甲醛质量为溶剂(水)质量的0.5～3％，取代苯甲醛和甘氨酸的摩尔比为1：1～3.5，固定化醛缩酶体积为溶剂(水)体积的0.2％～5％；二价金属离子酶促剂包括Ni2+、Co2+、Zn2+或Fe2+的盐酸盐或硫酸盐，添加比例为取代苯甲醛的0.01mol％～2mol％；PH为6～9，温度为35～65℃，流速为100～800BV/h；以水为溶剂，二价金属离子为酶促剂，固定化醛缩酶为催化剂，取代苯甲醛和甘氨酸为原料底物进行反应，合成路线如下：
Figure BDA0002766084970000051
(3)、将步骤(2)得到的反应混合物溶液和水分别通过填充有络合树脂的分离固定床分离成甘氨酸稀溶液和2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸稀溶液，二价金属离子酶促剂被分离固定床的络合树脂吸附除去；其中，分离固定床中填充的络合树脂包括HZ930、XAX7或ZGC107MB；络合树脂和反应混合物溶液的体积比为1:1～1.5，反应混合物溶液流速为10～30BV/h，络合树脂和水的体积比为1:2～4，水流速为10～30BV/h；前1～2倍络合树脂体积的流出液为甘氨酸稀溶液，其后的流出液为2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸稀溶液；
(4)、甘氨酸稀溶液浓缩后回收套用到步骤(2)中，2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸稀溶液浓缩后，降温析晶、真空干燥后得到2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸成品；其中，析晶温度为-5～10℃，析晶时间为10～20h，50～80℃下真空干燥；在浓缩过程中产生的水将重新回套至步骤(3)分离步骤。
以下实施例涉及的醛缩酶为基因改造醛缩酶，利用工程酶Cc-H91A178对新月柄杆菌醛缩酶位点进行突变，其中91位由组氨酸变更为丙氨酸，178位由丙氨酸变更为酪氨酸；新月柄杆菌醛缩酶的序列为SEQ ID NO：1所示，工程酶Cc-H91A178的序列为SEQ ID NO：2所示。
实施例1 2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸的合成
向1500L含醛缩酶的酶溶液(磷酸缓冲液浓度为0.5M，PH为7.2，酶含量为38mg/L，比酶活14000U/mg)中加入300L活化的大孔吸附树脂D301(树脂密度约为0.7g/ml)，在5～10℃条件下搅拌13h，然后将大孔吸附树脂过滤并用500L纯化水洗涤，得到固定化醛缩酶树脂。过滤后得到的磷酸缓冲液作为酶溶液的溶剂反复套用来做固定化，洗涤后的纯化水过滤后反复套用于洗涤大孔吸附树脂。
取7.8Kg甘氨酸溶于1000L纯化水中，加热至40℃(提前预热到酶催化的反应温度，节约反应前期的时间)，于搅拌条件下，分别依次加入18.5Kg对甲砜基苯甲醛，13gZnCl2，调节PH至7.5。在酶催化固定化床中填充10L上述制备的固定化醛缩酶树脂，将配制好的溶液在37～40℃条件下以100BV/h的流速流过酶催化固定化床，收集流出液，经HPLC检测，对甲砜基苯甲醛的转化率为98％，实施例1得到的反应混合物溶液HPLC图如图2所示。
实施例2 2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸和甘氨酸的固定床分离
取100L实施例1得到的反应混合物溶液，在分离固定床中填充100L HZ930树脂，反应混合物溶液以10BV/h的流速流经分离固定床，反应混合物溶液全部进入分离固定床后，以10BV/h的流速立即加入400L纯化水，收集前150L流出液，该流出液经检测为甘氨酸稀溶液，80℃真空浓缩后可回收套用至实施例1。收集后350L流出液，该流出液经检测为2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸稀溶液，80℃真空浓缩至20％的质量浓度，2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸的收率为96.7％。其中在浓缩过程中产生的纯化水将重新回套至分离步骤。二价金属离子酶促剂在分离这一步被分离固定床的络合树脂吸附除去。
实施例3 2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸成品的制备
取1Kg的2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸浓缩液(质量浓度20％)至2L圆底烧瓶中，控制温度至-5℃，缓慢搅拌20h，有大量白色晶体析出，过滤，80℃真空干燥，收集产物2-氨基-3-对甲砜基苯基-3-羟基丙酸136.4g，收率68.2％，HPLC纯度98％。实施例3得到的产物1H-NMR图谱如图3所示。剩下产品在过滤液中，可以循环套用，即和后一批浓缩液合并析晶。
实施例4 2-氨基-3-对氯苯基-3-羟基丙酸的合成
向1500L含醛缩酶的酶溶液(磷酸缓冲液浓度为0.5M，PH为7.2，酶含量为38mg/L，比酶活14000U/mg)中加入300L活化的大孔吸附树脂D301(树脂密度约为0.7g/ml)，在5～10℃条件下搅拌13h，然后将大孔吸附树脂过滤并用500L纯化水洗涤，得到固定化醛缩酶树脂。过滤后得到的磷酸缓冲液作为酶溶液的溶剂反复套用来做固定化，洗涤后的纯化水过滤后反复套用于洗涤大孔吸附树脂。
取7.8Kg甘氨酸溶于1000L纯化水中，加热至40℃(提前预热到酶催化的反应温度，节约反应前期的时间)，于搅拌条件下，分别依次加入14.5Kg对氯苯甲醛，13gZnCl2，调节PH至7.2。在酶催化固定化床中填充10L上述制备的固定化醛缩酶树脂，将配制好的溶液在37～40℃条件下以100BV/h的流速流过酶催化固定化床，收集流出液，经HPLC检测，对氯苯甲醛的转化率为96.3％。
实施例5 2-氨基-3-对氯苯基-3-羟基丙酸和甘氨酸的固定床分离
取100L实施例4得到的反应混合物溶液，在分离固定床中填充100L HZ930树脂，反应混合物溶液以10BV/h的流速流经分离固定床，反应混合物溶液全部进入分离固定床后，以10BV/h的流速立即加入400L纯化水，收集前120L流出液，该流出液经检测为甘氨酸稀溶液，80℃真空浓缩后可回收套用至实施例4。收集后380L流出液，该流出液经检测为2-氨基-3-对氯苯基-3-羟基丙酸稀溶液，80℃真空浓缩至18％的质量浓度，2-氨基-3-对氯苯基-3-羟基丙酸的收率为94％。其中在浓缩过程中产生的纯化水将重新回套至分离步骤。二价金属离子酶促剂在分离这一步被分离固定床的络合树脂吸附除去。
实施例6 2-氨基-3-对氯苯基-3-羟基丙酸成品的制备
取1Kg的2-氨基-3-对氯苯基-3-羟基丙酸浓缩液(质量浓度18％)至2L圆底烧瓶中，控制温度至-5℃，缓慢搅拌20h，有大量白色晶体析出，过滤，80℃真空干燥，收集产物2-氨基-3-对氯苯基-3-羟基丙酸135.1g，收率75.1％，HPLC纯度96.5％。剩下产品在过滤液中，可以循环套用，即和后一批浓缩液合并析晶。
序列表
<110> 杭州勇诚睿生物科技有限公司
<120> 一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 343
<212> PRT
<213> 新月柄杆菌醛缩酶(野生菌序列)
<400> 1
Met Thr Gln Thr Ala Pro Arg Tyr Asp Phe Ala Ser Asp Asn Val Ala
1 5 10 15
Gly Ala Met Pro Glu Val Met Glu Ala Leu Ile Ala Ala Asn Ala Gly
20 25 30
Thr Ala Ser Gly Tyr Gly Thr Asp His Val Ser Arg Ala Ala Ala Asp
35 40 45
Arg Ile Arg Ala Ala Leu Asp Ala Asp Ala Gln Val Arg Phe Thr Ala
50 55 60
Ser Gly Thr Ala Ala Asn Ala Phe Ala Leu Thr Leu Leu Ala Gln Pro
65 70 75 80
His Glu Ala Val Leu Ala His Glu His Ala His Ile Cys Thr Tyr Thr
85 90 95
Thr Gly Ala Pro Gly Phe Phe Gly Gln Gly Val Gly Leu Ile Gly Leu
100 105 110
Pro Gly Ala Ser Gly Lys Met Glu Leu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Gln Pro Asp Val Ser Tyr Arg Gln Pro Ala Ala Ala Leu Ser Leu
130 135 140
Thr Thr Ala Thr Glu Tyr Gly Thr Val Tyr Ser Glu Asp His Leu Arg
145 150 155 160
Ala Leu Ile Ala Pro Val Lys Ala Lys Gly Tyr Gly Val His Leu Asp
165 170 175
Gly Ala Arg Leu Ala Asn Ala Val Ala Gly Gly Phe Asp Leu Lys Ser
180 185 190
Ile Ala Lys Met Gly Val Asp Ile Leu Val Met Gly Gly Thr Lys Ala
195 200 205
Gly Ser Thr Pro Thr Glu Ala Val Val Phe Leu Asn Pro Asp His Ala
210 215 220
Lys Arg Leu Asp Ala Arg Leu Lys His Ala Gly Gln Leu Ile Ser Lys
225 230 235 240
Gly Arg Phe Leu Ala Ala Pro Trp Leu Gly Leu Leu Gly Glu Asn Gly
245 250 255
Gln Thr Ala Pro Trp Ala Ala Arg Ala Ala His Ala Asn Ala Met Ala
260 265 270
Gln Lys Leu Ala Ala Leu Met Pro Val Pro Ile Lys His Pro Val Glu
275 280 285
Ala Asn Gly Ile Phe Val Glu Met Asp Glu Leu Ala Leu Glu Arg Leu
290 295 300
Arg Gly Glu Gly Trp Phe Val Tyr Arg Phe Leu Asp Gly Thr Val Arg
305 310 315 320
Phe Met Cys Ser Trp Ala Thr Thr Pro Glu Met Val Glu Asp Leu Gly
325 330 335
Ala Ala Leu Lys Arg Val Ala
340
<210> 2
<211> 343
<212> PRT
<213> 工程酶Cc-H91A178(人工序列)
<400> 2
Met Thr Gln Thr Ala Pro Arg Tyr Asp Phe Ala Ser Asp Asn Val Ala
1 5 10 15
Gly Ala Met Pro Glu Val Met Glu Ala Leu Ile Ala Ala Asn Ala Gly
20 25 30
Thr Ala Ser Gly Tyr Gly Thr Asp His Val Ser Arg Ala Ala Ala Asp
35 40 45
Arg Ile Arg Ala Ala Leu Asp Ala Asp Ala Gln Val Arg Phe Thr Ala
50 55 60
Ser Gly Thr Ala Ala Asn Ala Phe Ala Leu Thr Leu Leu Ala Gln Pro
65 70 75 80
His Glu Ala Val Leu Ala His Glu His Ala Ala Ile Cys Thr Tyr Thr
85 90 95
Thr Gly Ala Pro Gly Phe Phe Gly Gln Gly Val Gly Leu Ile Gly Leu
100 105 110
Pro Gly Ala Ser Gly Lys Met Glu Leu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Gln Pro Asp Val Ser Tyr Arg Gln Pro Ala Ala Ala Leu Ser Leu
130 135 140
Thr Thr Ala Thr Glu Tyr Gly Thr Val Tyr Ser Glu Asp His Leu Arg
145 150 155 160
Ala Leu Ile Ala Pro Val Lys Ala Lys Gly Tyr Gly Val His Leu Asp
165 170 175
Gly Tyr Arg Leu Ala Asn Ala Val Ala Gly Gly Phe Asp Leu Lys Ser
180 185 190
Ile Ala Lys Met Gly Val Asp Ile Leu Val Met Gly Gly Thr Lys Ala
195 200 205
Gly Ser Thr Pro Thr Glu Ala Val Val Phe Leu Asn Pro Asp His Ala
210 215 220
Lys Arg Leu Asp Ala Arg Leu Lys His Ala Gly Gln Leu Ile Ser Lys
225 230 235 240
Gly Arg Phe Leu Ala Ala Pro Trp Leu Gly Leu Leu Gly Glu Asn Gly
245 250 255
Gln Thr Ala Pro Trp Ala Ala Arg Ala Ala His Ala Asn Ala Met Ala
260 265 270
Gln Lys Leu Ala Ala Leu Met Pro Val Pro Ile Lys His Pro Val Glu
275 280 285
Ala Asn Gly Ile Phe Val Glu Met Asp Glu Leu Ala Leu Glu Arg Leu
290 295 300
Arg Gly Glu Gly Trp Phe Val Tyr Arg Phe Leu Asp Gly Thr Val Arg
305 310 315 320
Phe Met Cys Ser Trp Ala Thr Thr Pro Glu Met Val Glu Asp Leu Gly
325 330 335
Ala Ala Leu Lys Arg Val Ala
340

Claims (10)

1.一种制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、在磷酸缓冲液中将醛缩酶固定至大孔吸附树脂上，得到固定化醛缩酶；其中，醛缩酶为基因改造醛缩酶，利用工程酶Cc-H91A178对新月柄杆菌醛缩酶位点进行突变，其中91位由组氨酸变更为丙氨酸，178位由丙氨酸变更为酪氨酸；新月柄杆菌醛缩酶的序列为SEQID NO：1所示，工程酶Cc-H91A178的序列为SEQ ID NO：2所示；
(2)、甘氨酸溶于水中，再加入取代苯甲醛和二价金属离子酶促剂，调节PH，得到溶液；在酶催化固定床中填充步骤(1)制备的固定化醛缩酶，将配制的溶液在一定温度下以一定流速流过酶催化固定化床，收集流出液，得到反应混合物溶液；其中，以水为溶剂，二价金属离子为酶促剂，固定化醛缩酶为催化剂，取代苯甲醛和甘氨酸为原料底物进行反应，合成路线如下：
Figure FDA0002766084960000011
(3)、将步骤(2)得到的反应混合物溶液和水分别通过填充有络合树脂的分离固定床分离成甘氨酸稀溶液和2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸稀溶液，二价金属离子酶促剂被分离固定床的络合树脂吸附除去；
(4)、甘氨酸稀溶液浓缩后回收套用到步骤(2)中，2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸稀溶液浓缩后，降温析晶、真空干燥后得到2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸成品；其中，在浓缩过程中产生的水将重新回套至步骤(3)分离步骤。
2.根据权利要求1所述的制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，其特征在于，步骤(1)磷酸缓冲液浓度为0.1M～1M，PH为7～8，配制成含醛缩酶10mg～300mg/L的酶溶液。
3.根据权利要求1所述的制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，其特征在于，步骤(1)大孔吸附树脂包括D301、ZGA451或DX110，醛缩酶和大孔吸附树脂的添加比例为1000U/g～5000U/g。
4.根据权利要求1所述的制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，其特征在于，步骤(1)固定化温度为4～10℃，固定化时间为12～24h。
5.根据权利要求1所述的制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，其特征在于，步骤(2)取代苯甲醛质量为溶剂质量的0.5～3％，取代苯甲醛和甘氨酸的摩尔比为1：1～3.5，固定化醛缩酶体积为溶剂体积的0.2％～5％。
6.根据权利要求1所述的制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，其特征在于，步骤(2)二价金属离子酶促剂包括Ni2+、Co2+、Zn2+或Fe2+的盐酸盐或硫酸盐，添加比例为取代苯甲醛的0.01mol％～2mol％。
7.根据权利要求1所述的制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，其特征在于，步骤(2)中PH为6～9，温度为35～65℃，流速为100～800BV/h。
8.根据权利要求1所述的制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，其特征在于，步骤(3)中分离固定床中填充的络合树脂包括HZ930、XAX7或ZGC107MB。
9.根据权利要求1所述的制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，其特征在于，步骤(3)中络合树脂和反应混合物溶液的体积比为1:1～1.5，反应混合物溶液流速为10～30BV/h，络合树脂和水的体积比为1:2～4，水流速为10～30BV/h；前1～2倍络合树脂体积的流出液为甘氨酸稀溶液，其后的流出液为2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸稀溶液。
10.根据权利要求1所述的制备2-氨基-3-取代苯基-3-羟基丙酸的生物酶催化流式工艺，其特征在于，步骤(4)中析晶温度为-5～10℃，析晶时间为10～20h，50～80℃下真空干燥。
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