CN112280699A - 生产戊基二羟基苯酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组酿酒酵母,其由将AAE、OLS和OAC蛋白的编码基因导入酿酒酵母而制备。同时,本发明还提供了生产戊基二羟基苯酸的方法,其包括将上述重组酿酒酵母进行发酵。
Description
技术领域
本发明属于合成生物学领域,涉及生产戊基二羟基苯酸的方法,具体地是涉及重组酿酒酵母生产戊基二羟基苯酸的方法。
背景技术
几千年来大麻由于其药用特性而在全球范围内种植和使用。一些大麻素——大麻的标志性成分,及其类似物针对其潜在的医学应用已被广泛研究。在一些国家,某些 大麻素制剂已被批准作为处方药用于治疗各种人类疾病。然而,大麻素的结构复杂性 限制了大麻素的批量化学合成。戊基二羟基苯酸(olivetolic acid,OA)是大麻素生物 合成途径的初始中间体,当前提高大麻素的方法也包括提高OA的产量,但是现有技 术中一般用化学合成法合成OA,化学合成OA成本较高,有机试剂及强酸强碱使用量 大,对研究人员造成较大危害,且容易造成环境污染,不利于环境的可持续发展;同 时大麻的结构复杂性也限制了OA的批量化学合成。所以,如何产生高产量的大麻素 依旧是本领域当前的一大难题。
发明内容
据报道,有两种大麻酶,四酮化合物合酶(OLS(Cannabis sativa TKS,CsTKS)) 和戊基二羟基苯酸环化酶(OAC(Cannabis sativa OAC,CsOAC)),可以催化己酰基 -CoA和丙二酰-CoA产生戊基二羟基苯酸。
所以,经过多年的研究,发明人发现通过将AAE、OLS和OAC蛋白的编码基因 针对宿主(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))进行密码子优化后,导入宿主 可以实现OA(戊基二羟基苯酸,olivetolic acid)的生物合成。
具体地,本发明提供以下方面:
[1].重组酿酒酵母,其由将AAE、OLS和OAC蛋白的编码基因导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)而制备。其中所述AAE全称为endogenous acyl activatingenzyme,是内源性酰基活化酶,OLS为四酮化合物合酶,OAC为戊基二羟基苯酸环化 酶,其中
所述AAE蛋白的编码基因优选来源于烟草(Nicotiana tabacum)、荷花(Nelumbonucifera)、胡萝卜(Daucus carota subsp.sativus)、大麻(Cannabis sativa)、蓖麻(AAE-Ricinus communis)、苜蓿(Medicago truncatula)或苹果(Malus domestica),或是人工合成的, 优选地,其来源于烟草;
所述OLS蛋白的编码基因来源于大麻(Cannabis sativa)、玫瑰木属(Rhodamniaargentea)、蜜柑(Citrus unshiu)、黄瓜(Cucumis sativus)、蛇麻籽(Humulus lupulus)或落 花生(Arachis hypogaea),或是人工合成的,优选地,其来源于玫瑰木属;
所述OAC蛋白的编码基因来源于大麻(Cannabis sativa)、三叶草(Trifoliumpratense)、 羽扇豆(Lupinus albus)、大豆(Glycine max)或木槿(Hibiscus syriacus),或是人工合成的, 优选地,其来源于大麻。
[2].项[1]所述的重组酿酒酵母,其中
来源于烟草的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:2所示;
来源于荷花的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:4所示;
来源于胡萝卜的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,优选地其编 码基因如SEQ ID NO:6所示;
来源于大麻的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:28所示;
来源于蓖麻的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:30所示;
来源于苜蓿的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:32所示;
来源于苹果的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:34所示;
来源于玫瑰木属的所述OLS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,优选地其 编码基因如SEQ ID NO:8所示;
来源于蜜柑的所述OLS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:10所示;
来源于黄瓜的所述OLS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:12所示;
来源于大麻的所述OLS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:36所示;
来源于蛇麻籽的所述OLS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示,优选地其编 码基因如SEQ ID NO:38所示;
来源于落花生的所述OLS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示,优选地其编 码基因如SEQ ID NO:40所示;
来源于大麻的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或 SEQID NO:17所示(分别对应OAC1、OAC2、OAC1蛋白),优选地其编码基因分别 如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18所示;
来源于三叶草的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示,优选地其编 码基因如SEQ ID NO:42所示;
来源于羽扇豆的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示,优选地其编 码基因如SEQ ID NO:44所示;
来源于大豆的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:46所示;
来源于木槿的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:48所示。
[3].项[1]-[2]中任一项所述的重组酿酒酵母,其中所述AAE、OLS和OAC的编码 基因分别独立存在于一个表达盒上,或AAE、OLS和OAC的编码基因中的两个编码 基因存在于一个表达盒上并且第三个编码基因存在于另一个表达盒上,或三个全部存 在于一个表达盒上。
[4].项[3]所述的重组酿酒酵母,其中所述表达盒包含启动子或含启动子的5′-UTR 元件、增强子、3′-UTR元件和/或终止子。
[5].项[1]-[4]中任一项所述的重组酿酒酵母,其中所述酿酒酵母选自酿酒酵母S288C、酿酒酵母W303、酿酒酵母BY4742或酿酒酵母BY4741。
本发明中的酿酒酵母均可商购,例如购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
在一个实施方案中,所述己酰基-CoA也可以通过异源生物合成途径产生。在一个实施方案中,可以在所述重组酿酒酵母基因组中进一步导入富养罗尔斯通氏菌的 RebktB编码基因、贪铜菌吊钩虫的CnpaaH1编码基因、丙酮丁醇梭状芽胞杆菌的Cacrt 编码基因和密闭螺旋体的Tdter编码基因。
[6].项[1]-[5]中任一项所述的重组酿酒酵母,其中所述酿酒酵母的基因组被整合了 分别来自富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、贪铜菌吊钩虫(Cupriavidusnecator)、 丙酮丁醇梭状芽胞杆菌(Clostridium acetobutylicum)和密闭螺旋体(Treponema denticola) 的β-酮硫解酶(beta-ketothiolase,BKTB)、3羟基己二酰基辅酶A脱氢酶 (3-hydroxyadipyl-coA dehydrogenase,PAAH1)、钙网蛋白(calreticulin,CRT)、反烯酰辅 酶A还原酶(trans-enoyl-CoA reductase,TER)、蛋白的编码基因,优选地所述β-酮硫解 酶、3羟基己二酰基辅酶A脱氢酶、钙网蛋白、反烯酰辅酶A还原酶蛋白的编码基因分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26所示。优选 地上述编码基因通过同源重组于酿酒酵母YORCdelta15整合位点,催化乙酰基coA, 经过四步酶的催化产生己酰基coA。优选地所述β-酮硫解酶、3羟基己二酰基辅酶A 脱氢酶、钙网蛋白、反烯酰辅酶A还原酶蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、 SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQID NO:25所示。
[7].生产戊基二羟基苯酸(OA)的方法,其包括将如项[1]-[5]中任意一项所述的重组酿酒酵母菌进行发酵。
在对所述重组酿酒酵母发酵的过程中,可以增加己酰基-CoA的供应量来提高OA的产量,其中增加己酰基-CoA的供应量也可以通过额外添加己酸(作为AAE(来自大 麻的CsAAE1)的底物)来增加己酰基-CoA的供应量。己酸可通过AAE转化为己酰基 -CoA。
[8].项[7]所述的方法,其包括在发酵初始在发酵培养基中添加己酸,其中己酸的终浓度为1mM-10mM,优选5mM。
[9].生产戊基二羟基苯酸(OA)的方法,其包括将如项[6]所述的重组酿酒酵母菌进 行发酵。
在一个实施方案中,发酵过程中所用的培养基为本领域对酿酒酵母发酵常用的培养基,例如由下列物质组成:无氨基氮源、葡萄糖、核苷酸和L型氨基酸。
在一个实施方案中,使用本发明的方法后,酿酒酵母中由本身不产生OA转变为 产生OA,OA产量约为20-999mg/L。
在一个实施方案中,本发明的方法能够稳定地进行OA的生物合成,反应条件温和,不污染环境,特异性好,能够实现结构复杂性大麻素类物质的合成。
在一个实施方案中,本发明的重组酿酒酵母具有生长速度快、OA稳定合成且表 达量高的优点,可以通过相对简单的方法条件发酵培养,易于实现并控制,成本低。 并可通过额外的途径增加己酸作为底物,增加了己酰基CoA的产量,进一步增加了 OA的产量。
在一个实施方案中,本发明提供的重组酿酒酵母还可以促进工业规模OA的生产,用于生物制药以及医药化工领域,一般发酵厂的设备和条件均可实现,生产投资较少, 具有广阔的实际应用价值及前景。
[10].来源于烟草(Nicotiana tabacum)、荷花(Nelumbo nucifera)、胡萝卜(Daucus carota subsp.saHvus)、大麻(Cannabis sativa)、蓖麻(AAE-Ricinuscommunis)、苜蓿 (Medicago truncatula)或苹果(Malus domestica),优选地,来源于烟草的内源性酰基 活化酶,
来源于大麻(Cannabis sativa)、玫瑰木属(Rhodamnia argentea)、蜜柑(Citrusunshiu)、 黄瓜(Cucumis sativus)、蛇麻籽(Humulus lupulus)或落花生(Arachishypogaea),优选地, 其来源于玫瑰木属的四酮化合物合酶,和
来源于大麻(Cannabis sativa)三叶草(Trifolium pratense)、羽扇豆(Lupinusalbus)、 大豆(Glycine max)或木槿(Hibiscus syriacus)的戊基二羟基苯酸环化酶
在制备戊基二羟基苯酸中的用途,优选地在酿酒酵母中制备戊基二羟基苯酸中的用途。
[11].项[10]所述的用途,其中
来源于烟草的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:2所示;
来源于荷花的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:4所示;
来源于胡萝卜的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:6所示;
来源于大麻的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:28所示;
来源于蓖麻的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:30所示;
来源于苜蓿的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:32所示;
来源于苹果的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:34所示;
来源于玫瑰木属的所述四酮化合物合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:8所示;
来源于蜜柑的所述四酮化合物合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:10所示;
来源于黄瓜的所述四酮化合物合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:12所示;
来源于大麻的所述OLS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:36所示;
来源于蛇麻籽的所述OLS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示,优选地其编 码基因如SEQ ID NO:38所示;
来源于落花生的所述OLS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示,优选地其编 码基因如SEQ ID NO:40所示;
来源于大麻的所述戊基二羟基苯酸环化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17所示,优选地其编码基因分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18所示;
来源于三叶草的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示,优选地其编 码基因如SEQ ID NO:42所示;
来源于羽扇豆的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示,优选地其编 码基因如SEQ ID NO:44所示;
来源于大豆的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:46所示;
来源于木槿的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示,优选地其编码 基因如SEQ ID NO:48所示。
[12].如项[10]或[11]所述的用途,其中所述酿酒酵母选自酿酒酵母S288C、酿酒酵母W303、酿酒酵母BY4742或酿酒酵母BY4741。
本发明为生产天然和非天然大麻素提供了一个平台,这将允许对这些化合物进行更严格的研究,并可用于开发各种人类健康问题的治疗方法。
附图说明
图1显示了现有技术中预测的合成戊基二羟基苯酸的生物合成途径。
图2显示实施例1所构建的重组酿酒酵母A的菌株形态照片。
图3显示液相检测图。其中
图3A显示OA对照品溶液的色谱图,对照品为1000mg/L、100mg/L、50mg/L 的OA对照品溶液,出峰时间为2.68min;
图3B显示1000mg/L OA对照品溶液、样品1及样品2的拟合色谱图。
图4显示实施例3所构建的重组酿酒酵母B的菌株形态照片。
图5显示1000mg/L OA对照品溶液、样品3及样品4的拟合色谱图。
图6显示1000mg/L OA对照品溶液、样品5及样品6的拟合色谱图。
图7显示100mg/L OA对照品溶液、样品7及样品8的拟合色谱图。
图8显示不同物种来源的AAE基因活性比较,以大麻物种中OLS和OAC1基因 作为固定因素,比较不同来源AAE基因催化产生OA的产量差异来表征AAE基因催 化活性。
图9显示不同物种来源的OLS基因活性比较,以大麻物种中AAE和OAC1基因 作为固定因素,比较不同OLS基因催化产生OA的产量差异来表征OLS基因催化活 性。
图10显示不同物种来源的OAC基因活性比较,以大麻物种中AAE和OLS基因 作为固定因素,比较不同OAC基因催化产生OA的产量差异来表征OAC基因催化活 性。
图11显示bktb、paaH1、crt、ter基因在酿酒酵母BY4741中的整合位点图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明作进一步的详细说明。
实施例1:构建重组酿酒酵母A
将AAE基因构建于Ycplac22酵母表达载体(购自Biovector中国质粒基因库), OLS和OAC基因构建于Ycplac33载体(购自Biovector中国质粒基因库),形成载体 Y22-AAE-LEU和Y33-OLS(CsTKS)-OAC-URA,将这两个载体共转染至酿酒酵母 S288C(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)中,得到重组酿酒酵母A。
所述重组酿酒酵母A在YPD平板上为椭圆形,菌落形态特征是菌落凸起、光滑、 乳白色、边缘整齐,如图2(包含正面和背面),最适生长温度为30℃,pH为6.5。
所述AAE、OLS和OAC基因的核苷酸序列依次如源自烟草的SEQ ID No:2、源 自玫瑰木属的SEQ ID No:8、源自大麻的SEQ ID No:14所示。
实施例2:OA产量检测
1、菌种活化扩大培养
将实施例1得到的重组酿酒酵母A试管斜面保存,使用前需要将试管内保存的菌种接种到CM-HIS-LEU-URA平板培养基中活化,扩大培养。
2、液体发酵培养
液体发酵培养基配方为:(液体1L)6.7g YNB(Yeast Nitrogen Base WithoutAmino acids),20g葡萄糖,0.84g Dropout powder,0.05g腺嘌呤,0.1g色氨酸,余量为水的体积,pH调至5.6。250ml三角瓶,每瓶装100ml液体培养基,121℃,0.12-0.17MPa。 30min灭菌备用,以重量百分比计。
挑取平板培养基中单菌落,接种到三角瓶液体培养基中,再额外添加己酸,至终浓度5mM,置于摇床,30℃,220rpm培养(此处的培养等同于发酵,在小瓶中称为 培养,在发酵罐中则称为发酵)120h,同时以相同的条件发酵未添加外源基因的酿酒 酵母S288C。
3、OA液相检测,包括如下步骤:
1)对照品溶液的制备:精密称取OA 5mg(购自上海源叶生物科技有限公司),用 加色谱级甲醇溶解并稀释,即得1000mg/L、100mg/L、50mg/L的OA对照品溶液。
2)样品溶液的制备:准确量取10ml OD600约为7-8的液体发酵后的的重组酿酒 酵母A的培养基,加入2ml乙酸乙酯,振荡10min。静置待液体分层后,吸取1ml上 层溶液,在真空旋转蒸发仪中,60℃蒸干。使用100μl甲醇溶解获得的干物质,12000rpm, 离心20min,取上清,即得样品1,针对未添加外源基因的酿酒酵母S288C,以与获得 样品1相同的过程处理,得到样品2。
3)将样品1、2以及OA对照品溶液分别进行色谱层析。色谱条件:使用C18柱, 流动相为A:1‰甲酸、B:甲醇,进样量10μl,流速0.25ml/min,检测波长280nm,柱 温30℃。
4)梯度洗脱样品组方法如表1:(A为1‰甲酸、B为甲醇)
表1OA液相梯度洗脱样品组方法
5)检测结果如图3所示:
由图3A-图3B可知,样品1和对照品出峰时间均为2.68min,一致,说明样品1 确实产出了OA;
由图3B可知,在其他条件均相同时,未添加外源基因的S288C酿酒酵母的样品2 在2.68min处未出峰,说明没有产出OA,添加了外源基因的S288C酿酒酵母的样品1 峰面积为9225,约为850mg/L,说明外源基因的导入是S288C酿酒酵母酵母产OA的 原因。
实施例3:重组酿酒酵母B的构建和OA产量检测
将AAE基因构建于Ycplac22酵母表达载体,OLS基因构建于Ycplac33酵母表达 载体,OAC基因构建于PRS427-lys酵母表达载体(购自BioVector NTCC典型培养物保 藏中心),形成载体Y22-AAE-LEU和Y33-OLS(CsTKS)-URA,PRS427-lys-OAC将这 三个载体共转染至酿酒酵母W303(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)中,得到重 组酿酒酵母B。
所述重组酿酒酵母B在YPD平板上为椭圆形,菌落形态特征是菌落凸起、光滑、 乳白色、边缘整齐,如图4(包含正面和背面),最适生长温度为30℃,pH为6.5。
所述AAE、OLS和OAC基因的核苷酸序列依次如源自胡萝卜的SEQ ID No:6、 源自黄瓜的SEQ ID No:12、源自大麻的SEQ ID No:16所示。
以实施例2相同的方法培养(本实施例中获得的重组酿酒酵母B的培养上清为样品3,未添加外源基因的酿酒酵母W303的培养上清为样品4并测定OA产量,不同之处 仅在于,添加己酸至终浓度1mM。检测结果如图5所示。
由图5可知,样品3和对照品OA出峰时间均为2.68min,一致,说明样品3与样 品4相比,确实产出了OA;
由图5可知,在其他条件均相同时,未添加外源基因的样品4在2.68min处没有 出峰,说明没有产出OA,添加了外源基因的样品3峰面积为217,约为20mg/L,说 明外源基因的导入是酿酒酵母W303产OA的原因。
实施例4:重组酿酒酵母C的构建及其OA产量检测
将AAE基因、OLS基因和OAC基因均构建于Ycplac22酵母表达载体,形成载体Ycplac22-AAE-OLS-OAC将这个载体共转染至酿酒酵母BY4742(购自中国普通微生物 菌种保藏管理中心)中,得到重组酿酒酵母C。
所述AAE、OLS和OAC基因的核苷酸序列依次如源自荷花物种的SEQ ID No:4、 源自蜜柑物种的SEQ ID No:10、源自大麻物种的SEQ ID No:18所示。
所述重组酿酒酵母C在YPD平板上为椭圆形,菌落形态特征是菌落凸起、光滑、 乳白色、边缘整齐,最适生长温度为30℃,pH为6.5。
以实施例2相同的方法培养(本实施例中获得的重组酿酒酵母C的培养上清为样品5,未添加外源基因的酿酒酵母BY4742的培养上清为样品6)并测定OA产量,不同之 处仅在于,添加己酸至终浓度10mM。
检测结果如图6所示,样品5和对照品出峰时间一致,说明样品5确实产出了OA。
在其他条件均相同时,未添加外源基因的样品6在对照品出峰的位置没有出峰,说明没有产出OA,添加了外源基因的样品5峰面积为379,约为35mg/L,说明外源 基因的导入是酿酒酵母W303产OA的原因,同时,不同己酸浓度会对酵母的OA产 量有影响。
实施例5重组酿酒酵母D的构建及其OA产量检测
重组酿酒酵母的构建过程与实施例1相同,不同之处在于,上述重组酿酒酵母为BY4741(购自上海唯地生物技术有限公司),另外在菌株构建时候,在酿酒酵母BY4741 整合位点YORCdelta15,以YORCdelta15为同源臂,用同源重组和醋酸锂转化的方法, 整合分别来自富养罗尔斯通氏菌、贪铜菌吊钩虫、丙酮丁醇梭状芽胞杆菌和密闭螺旋 体的bktb、paaH1、crt、ter基因(如图11),这四个基因的编码序列分别如序列SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26所示。此四个基因可以通过 催化乙酰基coA,产生己酰基coA。得到重组酿酒酵母D。
所述重组酿酒酵母D在YPD平板上为椭圆形,菌落形态特征是菌落凸起、光滑、 乳白色、边缘整齐,最适生长温度为30℃,pH为6.5。
以实施例2相同的方法培养(本实施例中获得的酿酒酵母D的培养上清为样品7,未添加外源基因的酿酒酵母BY4741的培养上清为样品8)并测定OA产量。
检测结果见图7,样品7和对照品出峰时间均为2.68min,一致,说明样品7确实 产出了OA。
在其他条件均相同时,未添加外源基因的样品8在对照品出峰的位置没有出峰,添加了外源基因的样品7峰面积为10842,约为999mg/L,说明外源基因的导入是酿 酒酵母BY4741产OA的原因,并且整合四个基因之后的菌株的OA产量会更高。
实施例6AAE基因不同物种来源的功能比较
生产AAE的主要物种有大麻、烟草、荷花、胡萝卜、蓖麻(AAE-Ricinus communis)、苜蓿(Medicago truncatula)、苹果(Malus domestica),各物种对应的AEE的氨基酸序 列分别为
SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:29、 SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:33,将其编码核酸序列分别针对酿酒酵母进行密码子优 化,得到各自的优化后的编码核酸序列分别为
SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:30、 SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34。
重组酿酒酵母的构建过程与实施例3相同,不同之处在于,以大麻中OLS和OAC1 基因作为固定因子,将上述不同来源的AAE基因插入Ycplac22酵母表达载体,在酵 母BY4741中表达,来比较不同AAE基因催化作用下,产出OA的产量的区别,见图 8。可见催化产生OA的优选的AAE基因来源为烟草。
实施例7OLS基因不同物种来源的功能比较
生产OLS的主要物种有大麻、玫瑰木属、蜜桔、黄瓜、蛇麻籽(Humulus lupulus)、落花生(Arachis hypogaea),的氨基酸序列分别为各物种对应的OLS的氨基酸序列分别 为SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:37、 SEQ ID NO:39,将其编码核酸序列分别针对酿酒酵母进行密码子优化,得到各自的优 化后的编码核酸序列分别为SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:38、SEQID NO:40。
重组酿酒酵母的构建过程与实施例3相同,不同之处在于,以大麻中AAE和OAC1 基因作为固定因子,将上述不同来源的OLS基因插入Ycplac33酵母表达载体,在酿 酒酵母BY4741中表达,来比较不同OLS基因催化作用下,产出OA的产量的区别, 见图9,可见催化产生OA的优选的OLS基因来源为玫瑰木属。
实施例8OAC基因不同物种来源的功能比较
生产OAC的主要物种有大麻(大麻中有三个OAC1,OAC2,OAC3,在图中对 应指示为大麻1、大麻2、大麻3)、三叶草(Trifoliium pratense)、羽扇豆(Lupinus albus)、 大豆(Glycine max)、木槿(Hibiscus syriacus),各物种对应的OLS的氨基酸序列分别为 SEQID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、 SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47,将其编码核酸序列分别针对酿酒酵母进行密码子优 化,得到各自的优化后的编码核酸序列分别为SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:42、SEQID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48。
重组酿酒酵母的构建过程与实施例3相同,不同之处在于,以大麻中OLS和AAE 基因作为固定因子,将上述不同来源的OAC基因插入PRS427-lys酵母表达载体,在 酵母BY4741中表达,来比较不同OAC基因催化作用下,产出OA的产量的区别,见 图10,可见催化产生OA的优选的OAC基因来源为大麻。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明, 凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本 发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.重组酿酒酵母,其由将内源性酰基活化酶、四酮化合物合酶和戊基二羟基苯酸环化酶蛋白的编码基因导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevtsiae)而制备,其中
所述内源性酰基活化酶蛋白的编码基因优选来源于烟草(wicotiana tabacum)、荷花(Nelumbo nucifera)、胡萝卜(Daucus carota subsp.sativus)、大麻(Cannabis sativa)、蓖麻(AAE-Ricinus communis)、苜蓿(Medicago truncatula)或苹果(Malus domestica),或是人工合成的,优选地,其来源于烟草;
所述四酮化合物合酶蛋白的编码基因来源于大麻(Cannabis sativa)、玫瑰木属(Rhodamnia argentea)、蜜柑(Citrus unshiu)、黄瓜(Cucumis sativus)、蛇麻籽(Humuluslupulus)或落花生(Arachis hypogaea),或是人工合成的,优选地,其来源于玫瑰木属;
所述戊基二羟基苯酸环化酶蛋白的编码基因来源于大麻(Cannabis sativa)、三叶草(Trifolium pratense)、羽扇豆(Lupmus albus)、大豆(Glycine max)或木槿(Hibiscussyriacus),或是人工合成的,优选地,其来源于大麻。
2.权利要求1或2所述的重组酿酒酵母,其中
来源于烟草的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:2所示;
来源于荷花的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:4所示;
来源于胡萝卜的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:6所示;
来源于大麻的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:28所示;
来源于蓖麻的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:30所示;
来源于苜蓿的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:32所示;
来源于苹果的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:34所示;
来源于玫瑰木属的所述四酮化合物合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:8所示;
来源于蜜柑的所述四酮化合物合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:10所示;
来源于黄瓜的所述四酮化合物合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:12所示;
来源于大麻的所述四酮化合物合酶、蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:36所示;
来源于蛇麻籽的所述四酮化合物合酶、蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:38所示;
来源于落花生的所述四酮化合物合酶、蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:40所示;
来源于大麻的所述戊基二羟基苯酸环化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:17所示,优选地其编码基因分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQID NO:18所示;
来源于三叶草的所述戊基二羟基苯酸环化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:42所示;
来源于羽扇豆的所述戊基二羟基苯酸环化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:44所示;
来源于大豆的所述戊基二羟基苯酸环化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:46所示;
来源于木槿的所述戊基二羟基苯酸环化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:48所示。
3.权利要求1-2中任一项所述的重组酿酒酵母,其中所述内源性酰基活化酶、四酮化合物合酶和戊基二羟基苯酸环化酶的编码基因分别独立存在于一个表达盒上,或内源性酰基活化酶、四酮化合物合酶和戊基二羟基苯酸环化酶的编码基因中的两个编码基因存在于一个表达盒上并且第三个编码基因存在于另一个表达盒上,或三个全部存在于一个表达盒上。
4.如权利要求3所述的重组酿酒酵母,其中所述表达盒包含启动子或含启动子的5′-UTR元件、增强子、3′-UTR元件和/或终止子。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组酿酒酵母,其中所述酿酒酵母选自酿酒酵母S288C、酿酒酵母W303、酿酒酵母BY4742或酿酒酵母BY4741。
6.如权利要求1-5中任一项所述的重组酿酒酵母,其中所述酿酒酵母的基因组被整合了分别来自富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、贪铜菌吊钩虫(Cupriavidusnecator)、丙酮丁醇梭状芽胞杆菌(Clostridium acetobutylicum)和密闭螺旋体(Treponema denticola)的β-酮硫解酶、3羟基己二酰基辅酶A脱氢酶、钙网蛋白、反烯酰辅酶A还原酶蛋白的编码基因,优选地所述β-酮硫解酶、3羟基己二酰基辅酶A脱氢酶、钙网蛋白、反烯酰辅酶A还原酶蛋白的氨基酸分别如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25所示;优选地所述β-酮硫解酶、3羟基己二酰基辅酶A脱氢酶、钙网蛋白、反烯酰辅酶A还原酶蛋白的编码基因分别如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQID NO:26所示;优选地所述编码基因通过同源重组整合于酿酒酵母YORCdelta15整合位点。
7.生产戊基二羟基苯酸的方法,其包括将如权利要求1-5中任意一项所述的重组酿酒酵母菌进行发酵。
8.权利要求7所述的方法,其包括在发酵初始在发酵培养基中添加己酸,其中己酸的终浓度为1mM-10mM,优选5mM。
9.生产戊基二羟基苯酸的方法,其包括将如权利要求6所述的酿酒酵母菌进行发酵。
10.来源于烟草(Nicotiana tabacum)、荷花(Nelumbo nucifera)、胡萝卜(Daucuscarota subsp.sativus)、大麻(Cannabis sativa)、蓖麻(AAE-Ricinus communis)、苜蓿(Medicago truncatula)或苹果(Malus domestica),优选地,来源于烟草的内源性酰基活化酶,
来源于大麻(Cannabis sativa)、玫瑰木属(Rhodamnia argentea)、蜜柑(Citrusunshiu)、黄瓜(Cucumis sativus)、蛇麻籽(Humulus lupulus)或落花生(Arachishypogaea),优选地,其来源于玫瑰木属的四酮化合物合酶,和
来源于大麻(Cannabis sativa)三叶草(Trifolium pratense)、羽扇豆(Lupinusalbus)、大豆(Glycine max)或木槿(Hibiscus syriacus)的戊基二羟基苯酸环化酶
在制备戊基二羟基苯酸中的用途,优选地在酿酒酵母中制备戊基二羟基苯酸中的用途。
11.权利要求10所述的用途,其中
来源于烟草的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:2所示;
来源于荷花的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:4所示;
来源于胡萝卜的所述内源性酰基活化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:6所示;
来源于大麻的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:28所示;
来源于蓖麻的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:30所示;
来源于苜蓿的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:32所示;
来源于苹果的所述AAE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:34所示;
来源于玫瑰木属的所述四酮化合物合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:8所示;
来源于蜜柑的所述四酮化合物合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:10所示;
来源于黄瓜的所述四酮化合物合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:12所示;
来源于大麻的所述OLS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:36所示;
来源于蛇麻籽的所述OLS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:38所示;
来源于落花生的所述OLS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:40所示;
来源于大麻的所述戊基二羟基苯酸环化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:17所示,优选地其编码基因分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQID NO:18所示;
来源于三叶草的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:42所示;
来源于羽扇豆的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:44所示;
来源于大豆的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:46所示;
来源于木槿的所述OAC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示,优选地其编码基因如SEQ ID NO:48所示。
12.如权利要求10或11所述的用途,其中所述酿酒酵母选自酿酒酵母S288C、酿酒酵母W303、酿酒酵母BY4742或酿酒酵母BY4741。
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