CN112272519A - 用于生物杀虫剂的经由皮克林乳液的单个单元体封装 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种系统及方法，所述系统及方法通过环保的水包油(o/w)皮克林乳液进行单个单元体的微粒封装。

Description

用于生物杀虫剂的经由皮克林乳液的单个单元体封装
相关申请交叉引用
本申请涉及且要求于2018年5月12日提交美国临时专利申请案第62/676,984号的美国临时专利申请的优先权，所述美国临时专利申请案标题为：“用于生物杀虫剂的经由皮克林乳液的单个单元体封装”，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及一种皮克林乳液及单个单元体的封装的领域。
背景技术
单个单元体的封装在包括医药、食品产业及农业的广泛领域中具有许多主要的应用。封装可抵抗恶劣的外部条件，以确保减低暴露于外来生物体的污染，并提供经改善的隔离性。单元体的封装已成为基因治疗、控制药物递送、发酵产业、图像分析工具及微生物基因组分析的重要工具。已开发数种用于单个单元体的封装的技术，包括溶剂蒸发、界面聚合及逐层沉积。然而，此等方法可能包含有毒的化学物质及化合物，例如构成有机生物风险的有机溶剂或腐蚀性界面活性剂。
由于皮克林乳液的高胶状稳定性及可控的液滴尺寸，皮克林乳液已被使用于单个单元体的封装。皮克林乳液通过纳米颗粒(NPs)而稳定，所述纳米颗粒在油/水界面处自行组装并作为一物理屏障。皮克林乳液为水包油型(o/w)乳液或反相的(油包水型)乳液。通过皮克林乳液所进行的单元体的封装已被使用于各种应用中，例如封装微生物的单元体以防止pH值变化、开发基于苏云金芽孢杆菌(Bt)的生物杀虫剂制剂、酶促反应的平台、液体弹珠基的单元体囊剂，以及用于组织工程的在水包水乳液中的贴壁式单元体的封装。
发明内容
本发明提供一种系统及方法，所述系统及方法通过环保的水包油(o/w)皮克林乳液进行单个单元体的微粒封装。
本发明的实施例指向一种用于单个单元体的封装的方法。所述方法包括：提供包括纳米颗粒的一水基溶液；通过将一油溶液加入所述水基溶液中，以乳化所述水基溶液；提供单元体至所述溶液中以及产生所述单元体的至少一单个单元体的封装。
可选地，所述方法为：所述纳米颗粒是二氧化硅纳米颗粒。
可选地，所述方法为：所述纳米颗粒是二氧化钛纳米颗粒。
可选地，所述方法为：所述纳米颗粒是有机纳米颗粒或无机纳米颗粒。
可选地，所述方法为：所述纳米颗粒引入官能团。
可选地，所述方法为：所述官能团是下列其中之一者：胺基、丙烯酰氧基甲基三甲氧基硅烷、(3-丙烯酰氧基丙基)三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、正(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、乙基三甲氧基硅烷、正丙基三乙氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷、己基三甲氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、1-巯基十三烷基三甲氧基硅烷、S-(辛酰基)巯基丙基三乙氧基硅烷、1H,1H,2H,2H,2H-全氟辛基三甲氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、正辛基甲基二乙氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、十一烷基三氯硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷、二十二烷基三乙氧基硅烷、二甲基二甲氧基硅烷、二甲基二氯硅烷、正丁基三乙氧基硅烷、(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己基异氰基乙基)乙基三甲氧基硅烷、3-异氰丙基三乙氧基硅烷、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物。
可选地，所述方法为：所述乳化是通过超声波震荡产生的。
可选地，所述方法为：所述油基溶液是一石蜡油。
可选地，所述方法为：所述油基溶液是下列其中之一者：硅油、葵花籽油、矿物油及其他的生物相容性及环保油。
可选地，所述方法为：所述单元体是棕色绿僵菌(Metarhizium brunneum)Mb7分生孢子。
可选地，所述方法为：所述单元体是下列其中之一者：细菌、病毒、酵母细胞、分生孢子、一真菌的孢子、一栖息于土壤的昆虫致病真菌(EPF)、对昆虫致病的细菌及一杀虫剂释放组合物。
可选地，所述方法为：所述真菌的孢子是下列其中之一者：金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、棕色绿僵菌(Metarhizium brunneum)、罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)、耐寒绿僵菌(Metarhizium frigidum)、莱氏绿僵菌(Metarhizium riley)、蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)、布氏白僵菌(Beauveriabrongniartii)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、蜡蚧轮枝菌(Veticillium lecanii)、玫烟色棒孢霉菌(Isaria fumosoroseous)。
可选地，所述方法为：所述至少一单个单元体的封装是通过涡漩流产生的。
可选地，所述方法为：所述纳米颗粒的含量是介于0.1重量％与10重量％之间。
可选地，所述方法为：所述油/水的比例是下列其中之一者：分别为1：99、5：95、10：90、20：80、30：70、40：60及50:50。
可选地，所述方法为：所述油滴尺寸的变化范围为0.1至300微米。
本发明的实施例指向一种单个单元体的封装的方法。所述方法包括：提供包括纳米颗粒的一水基溶液；通过将一油溶液加入所述水基溶液中，以乳化所述水基溶液；提供单元体至所述溶液中；产生所述单元体的至少一单个单元体的封装以及将所述至少一单个单元体的封装至少施用于叶片上以防治害虫。
可选地，所述方法为：所述纳米颗粒是二氧化硅纳米颗粒。
可选地，所述方法为：所述纳米颗粒引入官能团。
可选地，所述方法为：所述官能团是下列其中之一者：胺基、丙烯酰氧基甲基三甲氧基硅烷、(3-丙烯酰氧基丙基)三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、正(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、乙基三甲氧基硅烷、正丙基三乙氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷、己基三甲氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、1-巯基十三烷基三甲氧基硅烷、S-(辛酰基)巯基丙基三乙氧基硅烷、1H,1H,2H,2H,2H-全氟辛基三甲氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、正辛基甲基二乙氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、十一烷基三氯硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷、二十二烷基三乙氧基硅烷、二甲基二甲氧基硅烷、二甲基二氯硅烷、正丁基三乙氧基硅烷、(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己基异氰基乙基)乙基三甲氧基硅烷、3-异氰丙基三乙氧基硅烷、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物。
可选地，所述方法为：所述乳化是通过超声波震荡产生的。
可选地，所述方法为：所述油基溶液是石蜡油。
可选地，所述方法为：所述单元体是棕色绿僵菌Mb7分生孢子。
可选地，所述方法为：所述单元体是下列其中之一者：细菌、病毒、酵母细胞、分生孢子、一真菌的孢子、一栖息于土壤的昆虫致病真菌(EPF)、对昆虫致病的细菌及一杀虫剂释放组合物。
可选地，所述方法为：所述真菌的孢子是下列其中之一者：金龟子绿僵菌、棕色绿僵菌、罗伯茨绿僵菌、耐寒绿僵菌、莱氏绿僵菌、蝗绿僵菌、布氏白僵菌、球孢白僵菌、蜡蚧轮枝菌、玫烟色棒孢霉菌。
可选地，所述方法为：所述至少一单个单元体的封装是通过涡漩流产生的。
可选地，所述方法为：所述纳米颗粒的含量是介于0.1重量％与10重量％之间。
可选地，所述方法为：所述至少于叶片上的叶片是蓖麻(R.communis)的叶片。
可选地，所述方法为：所述害虫是下列其中之一者：鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)、双翅目(Diptera)、直翅目(Orthoptera)、蜱螨类(Acari)、腹足类(Gastropoda)。
可选地，所述方法为：所述害虫是节肢动物。
可选地，所述方法为：所述至少一单个单元体的封装在所述至少于叶片上产生一硅基蜂窝状构造。
可选地，所述方法为：所述油滴尺寸的变化范围为0.1至300微米。
本发明的实施例指向一种用于单个单元体的封装的系统。所述系统包括：一油滴、围绕所述油滴外围的多个纳米颗粒，以及在所述油滴内的一单个单元体的颗粒。
可选地，所述系统为：所述油滴是一石蜡油滴。
可选地，所述系统为：所述多个纳米颗粒是二氧化硅纳米颗粒。
可选地，所述系统为：所述多个纳米颗粒引入官能团。
可选地，所述系统为：所述官能团是下列其中之一者：胺基、丙烯酰氧基甲基三甲氧基硅烷、(3-丙烯酰氧基丙基)三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、正(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、乙基三甲氧基硅烷、正丙基三乙氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷、己基三甲氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、1-巯基十三烷基三甲氧基硅烷、S-(辛酰基)巯基丙基三乙氧基硅烷、1H,1H,2H,2H,2H-全氟辛基三甲氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、正辛基甲基二乙氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、十一烷基三氯硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷、二十二烷基三乙氧基硅烷、二甲基二甲氧基硅烷、二甲基二氯硅烷、正丁基三乙氧基硅烷、(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己基异氰基乙基)乙基三甲氧基硅烷、3-异氰丙基三乙氧基硅烷、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物。
可选地，所述系统为：所述单个单元体的颗粒是棕色绿僵菌Mb7分生孢子。
除非本文另有定义，否则本文中所使用的所有技术的术语及/或科学的术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文中所描述的彼等类似或等同的方法及材料可用于本发明的实施例的实施或测试中，不过以下面描述示例性的方法及/或材料。在有冲突的情况下，以专利说明书及其定义为准。此外，材料、方法及实施例仅是说明性的，并不意图必然是限制性的。
附图说明
本文仅通过示例的方式，并参考附图描述本发明的一些实施例。具体详细地参考附图，要强调的是，所示出的细节是通过实例显示且是出于对本发明的实施例的说明性讨论的目的。就这此方面，结合附图所进行的描述对于本领域技术人员而言显而易见的是能够如何实施本发明的实施例。
现在注意附图，其中相同的参考标号或符号表明相应或相同的组件。在图式中：
图1是根据本发明的实施例的系统及方法的示意图。
图2A是共聚焦显微镜的图像(a至d)，显示在不同的油/水的比例下具有1％二氧化硅-NH2的皮克林乳液。(a)5:95、(b)10:90、(c)20:80、(d)30:70。比例尺为50μm。
图2B是液滴直径随着二氧化硅-NH2的含量(重量％)及在乳液中的油含量百分比(vol％)变化的柱状图。
图3A是共聚焦显微镜的图像，所述图像是在具有不同的NP含量(a)2重量％、(b)3重量％及(c)5重量％的二氧化硅-NH2皮克林乳液(o/w的比例为20：80)中的棕色绿僵菌Mb7-GFP分生孢子的单个单元体的封装。比例尺为10μm。
图3B是经干燥的二氧化硅-NH2皮克林乳液的SEM显微照片，(d)不具分生孢子及(e)具有分生孢子(白色箭头)。
图4是共聚焦显微镜的图像(a-f)及图表(g)，所述图像及图表是在蓖麻的叶片上的棕色绿僵菌Mb7分生孢子-GFP的分布。
图5是共聚焦显微镜的图像，所述图像是在经由二氧化钛纳米颗粒所稳定的水包油乳液中的分生孢子的单个单元体的封装。
图6A是斜纹夜蛾(S.littoralis)三龄幼虫的存活曲线图表，其是在喷涂dH2O、含有分生孢子的0.01％Triton X-100、含有棕色绿僵菌制剂的二氧化硅-NH2皮克林乳液及不含棕色绿僵菌制剂的二氧化硅-NH2皮克林乳液之后所观察的。
图6B是斜纹夜蛾幼虫的经校正的死亡率％的图表，其是在接种含有棕色绿僵菌分生孢子的一水基制剂(Triton X-100)及二氧化硅-NH2皮克林乳液后7天的斜纹夜蛾幼虫的死亡率％。
图7A及图7B是(A)接种棕色绿僵菌乳液制剂10天后的斜纹夜蛾三龄幼虫的图像，以及(B)未经处理的幼虫的图像。
具体实施方式
本发明的应用不限于以下叙述中所描述的结构细节及组件的配置。本发明能够具有其他的实施例，或者能够以各种方式被实施或实现。同样，应当理解，本文中所采用的用语及术语是出于描述的目的，而不应被认为是限制性的。
图1是本发明的系统及方法100的示例性实施例的示意图。最初，将包括官能团的纳米颗粒，例如通过盐化作用被诸如(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)官能化，以引入胺类官能化的二氧化硅纳米颗粒，加至容器102内的水溶液中。例如，容器102是标准反应容器。通过例如超声波震荡处理以将经添加的纳米颗粒分散于水溶液中。例如，超声波震荡是由一超声波液体处理器所提供，例如所述超声波液体处理器是Sonics Vibra-cell超声波液体处理器，型号-VCX750。纳米粒子可为有机纳米粒子或无机纳米粒子。
引入纳米颗粒上的官能团也可为，例如，丙烯酰氧基甲基三甲氧基硅烷、(3-丙烯酰氧基丙基)三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、正(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、乙基三甲氧基硅烷、正丙基三乙氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷、己基三甲氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、1-巯基十三烷基三甲氧基硅烷、S-(辛酰基)巯基丙基三乙氧基硅烷、1H,1H,2H,2H,2H-全氟辛基三甲氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、正辛基甲基二乙氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、十一烷基三氯硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷、二十二烷基三乙氧基硅烷、二甲基二甲氧基硅烷、二甲基二氯硅烷、正丁基三乙氧基硅烷、(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己基异氰基乙基)乙基三甲氧基硅烷、3-异氰丙基三乙氧基硅烷、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物等。
在第二阶段，将一油溶液，例如，石蜡油溶液添加至容器102中，以形成二氧化硅-NH2的皮克林乳液。油溶液亦可为：硅油、葵花籽油，矿物油及其他的生物相容性及环保油等。在添加油溶液之后进行超声波处理以产生乳化作用。在此阶段期间，如容器104所示，将纳米颗粒组装在皮克林乳液的表面上。将液体样品暴露于超声波进行搅拌，使得透过剪切力进行乳化作用。此外，超声波会在皮克林乳液的界面处引起短暂的空隙，使颗粒渗透至皮克林乳液中。二氧化硅纳米颗粒的含量可例如是介于0.1重量％与10重量％之间，而油/水的比例可例如为20：80、30：70等。
在第三阶段，将诸如分生孢子的单个单元体颗粒，例如，棕色绿僵菌Mb7分生孢子添加至含有皮克林乳液的混合物中。之后将混合物在涡漩流混合器中高速涡漩约5分钟。通过涡漩的搅动使单元体渗透至石蜡液滴中。如容器106中所示，各经添加的单个单元体皆被石蜡液滴吸收，以产生单个单元体的封装。
单个单元体的封装包括通过多个纳米颗粒的外围所围绕的油滴，以及位于所述油滴内的单个单元体的颗粒。
经添加的单个单元体的颗粒的疏水性外层增强宿主表面上的附着及萌发过程，且亦负责颗粒在油相中的个别的排列。仅在乳液形成后才掺入单个单元体的颗粒，由于在单个单元体的颗粒的存在下进行超声波处理可导致单元体裂解，因此其应该被避免。
单个单元体的颗粒亦可为：病毒、酵母细胞、一真菌的孢子或分生孢子(金龟子绿僵菌、棕色绿僵菌、罗伯茨绿僵菌、耐寒绿僵菌、莱氏绿僵菌、蝗绿僵菌、布氏白僵菌、球孢白僵菌、蜡蚧轮枝菌、玫烟色棒孢霉菌等)、一栖息于土壤的昆虫致病真菌(EPF)、对昆虫致病的细菌、一杀虫剂释放组合物等。
在最后阶段，将包括皮克林乳液的生物杀虫剂制剂喷涂在一叶片或一组叶片上，例如用于防治节肢动物害虫的蓖麻的叶片。乳液干燥之后，形成具有有次序的分层孔隙度的硅基蜂窝状结构。此结构保留了皮克林乳液及单个单元体的封装的基本形态。其导致单个单元体的颗粒在叶片上高度分布，从而提供广泛且持久的保护。害虫是，例如，鳞翅目、鞘翅目、半翅目、双翅目、直翅目、蜱螨类、腹足类等，而经处理的植物亦可为：玉米、小麦、油菜、甜瓜、番茄、苜蓿、蜀黍、洋葱、柑橘、豆类、甘蔗、咖啡等。
尽管上述提供前述的阶段，然而其顺序是示例性的，且此等阶段的其他顺序亦是允许的。此外，上述步骤亦适用于在油基溶液中形成含有亲水性单个单元体的颗粒的水滴的反相(油包水型)乳液。
图2B是液滴直径随着二氧化硅-NH2的含量(重量％)及在乳液中的油含量百分比(vol％)变化的柱状图。此图描绘在四种不同的石蜡/水的比例下，乳液的石蜡液滴直径与二氧化硅-NH2纳米颗粒的含量的关系。如图2B所示，在石蜡油的任何给定的体积级分下，二氧化硅含量越高，液滴直径越小。其是由于o/w界面的总表面积增加。此外，在一给定的二氧化硅-NH2的含量下，石蜡油体积级分的增加导致较大的液滴尺寸。油滴的直径是可调控的，可在大约0.1μm至300μm的相对较广的范围内变化。其表明乳液组合物的调控允许微调所得到的液滴尺寸，其对于单个单元体的封装是重要的。皮克林乳液的相对较高的稳定性源自于由于在界面处所存在的纳米颗粒而导致的液滴的低聚结速率。
实例
以下实施例不意图以任何方式限制权利要求的范围。提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制造及使用所述发明的完整公开及描述，且不意图限制本发明的范围，亦不意图代表以下全部或仅实施的实验。除非另有说明，否则份数是指重量份、分子量是指重均分子量、温度是指摄氏度，且压力是指大气压或接近大气压。
实例1-使用APTES对二氧化硅表面进行盐化
将二氧化硅(1g)(AEROSIL OX 50，估计的初次粒径为40nm，获自德国赢创公司)添加至40mL甲醇中，并搅拌使其完全分散。之后，将APTES(99％Sigma-Aldrich)缓慢地加入溶液中至终浓度为0.5M。反应在环境温度下进行45分钟。硅烷化后，通过离心(9000rpm，10分钟)收集颗粒，并用甲醇冲洗四次。此后，将二氧化硅-NH2纳米颗粒在35℃且真空下干燥约3小时。
实例2-二氧化硅-NH2皮克林乳液的制备
由胺类官能化的二氧化硅在水及石蜡油(Sigma-Aldrich，分析等级)中制备皮克林乳液。首先，通过声波震荡处理5分钟(Sonics Vibra-Cell 750W，25％振幅)以将二氧化硅-NH2纳米颗粒分散于蒸馏水中，同时增加二氧化硅含量：0.1重量％、1重量％、2重量％、3重量％及5重量％。之后，分别以5：95、10：90、20：80及30：70体积％的o/w的比例添加石蜡油。将混合物通过声波震荡处理5分钟以进行乳化。图2A提供共聚焦显微镜的图像(a至d)，显示在不同的油/水的比例下具有1％二氧化硅-NH2的皮克林乳液。图2A的(a)部分表明油/水的比例为5：95。图2A的(b)部分表明油/水的比例为10：90。图2A的(c)部分表明油/水的比例为20：80。图2A的(d)部分表明油/水的比例为30：70。油/水的比例亦可为：1：99、40：60及50:50。
实例3-真菌菌株及培养条件
在28℃下，于SDA(Difco，碧迪医疗，美国马里兰州)上将棕色绿僵菌Mb7分生孢子及棕色绿僵菌Mb7-GFP突变体培养2周，直至形成孢子为止。通过刮取真菌菌落以得到分生孢子，将收集的材料悬浮在含有0.01％Triton X-100的无菌蒸馏水中，之后通过涡漩流以制备分生孢子悬浮液。将悬浮液通过三层纱布进行过滤，并使用血球计数器测定分生孢子的浓度。
实例4-活力分析
通过萌发分析以确定在不同的悬浮液中的分生孢子的活力。将分生孢子悬浮液等分试样施加于SDA板上，并于28℃下培养18小时。使用共聚焦显微镜在不同的时间点检测乳液中的分生孢子的活力。如前述，分生孢子的荧光是活力的指标。倘若萌发及荧光分生孢子的比率皆高于95％，则活力是令人满意的。
实例5-在二氧化硅-NH2皮克林乳液中的分生孢子的封装
针对在皮克林乳液中的单个单元体的封装，对于各二氧化硅-NH2纳米颗粒含量，选择两种不同的油/水的比例：20：80及30：70。将10mg棕色绿僵菌Mb7-GFP分生孢子添加至10mL乳液中。将混合物在涡漩流混合器中高速涡漩5分钟。将单元体样品(10μL)置放于玻片上，并通过共聚焦显微镜进行分析(图3)。共聚焦显微镜的图像代表一焦平面，因此出现在油滴边界内的分生孢子单元体实际上是位于石蜡液滴的内部。在分别为2重量％、3重量％及5重量％的三种不同的二氧化硅含量的情况下，在o/w的比例为20：80的乳化液中在石蜡油滴中成功地获得单个单元体的封装(图3A)。在此等乳液中的油滴浓度较分生孢子单元体的浓度大约高一个数量级，因此即使在非常低的放大倍率下，在一给定的共聚焦显微镜的图像中亦几乎检测到极少量容纳分生孢子单元体的液滴。图3A描绘乳液的石蜡液滴中成功的分生孢子单元体的单个单元体的封装。已显示成功的单个单元体的封装(在二氧化硅含量为2重量％、3重量％及5重量％时)的皮克林乳液的平均液滴直径分别为9.1±6.8μm、4.7±1.7μm及2.7±1.5μm(图2B)，其值接近于分生孢子单元体的尺寸，分生孢子单元体的长度约为4μm。此等结果表明，当液滴及单元体的尺寸处于相同的数量级时，可实现单独的封装。
当封装在二氧化硅-NH2皮克林乳液的油相中时，所获得的GFP分生孢子的荧光信号清楚地表明单元体的活力。乳液中的分生孢子保持存活三周。通过在一SDA生长培养基上培养分生孢子进一步表征封装在二氧化硅-NH2皮克林乳液中的绿僵菌(Metarhizium)分生孢子单元体的活力。经封装的分生孢子的萌发百分比为85±8.3％，表明其活力及萌发能力。对照系统(无乳液)的发芽率为95±5％。
所施加的乳液的SEM表征显示硅基蜂窝状结构具有有次序的分层孔隙度(图3B)。白色箭头显示在干燥的二氧化硅-NH2皮克林乳液中的分生孢子的颗粒。此结构是在乳液干燥过程中通过乳液模板所形成的。此发现证实分生孢子在叶片上单独的排列，其导致针对目标昆虫的生物的高效率的杀虫剂活性。
实例6-在水包油乳液中的分生孢子的封装通过二氧化钛纳米颗粒而稳定
图4证实在水包油乳液中的分生孢子的单个单元体的封装通过二氧化钛纳米颗粒而稳定。由于纳米颗粒的紫外线吸收特性，此针对生物杀虫剂的制剂对于分生孢子单元体显示紫外线保护的功能性。
实例7-在蓖麻(R.communis)的叶片的分生孢子的分布
针对叶片喷涂分析，制备三个棕色绿僵菌Mb7-GFP的分生孢子样品：二氧化硅-NH2皮克林乳液、0.01％Triton X-100及蒸馏水。将分生孢子(10mg)加至10mL的每样品中，混合均匀，之后使用50mL手动喷涂器(每次喷涂约100μL液体)喷涂在蓖麻的叶片上，以完全覆盖。将植物组织在室温下干燥。为了表征分生孢子在植物组织上的分布，通过共聚焦显微镜对各处理的叶圆盘进行分析。通过共聚焦显微镜表征分生孢子单个体在叶片上的分布。图5是共聚焦显微镜的图像，所述图像是在蓖麻的叶片上的棕色绿僵菌分生孢子-GFP的分布。图5的a-c剖面是Z投影，而图5的d-f剖面是在叶片的表面喷涂后的棕色绿僵菌-GFP分生孢子的共聚焦显微镜的图像的剖面图。图5a及图5d表示在二氧化硅-NH2皮克林乳液中的分生孢子、图5b及图5e表示在0.01％Triton X-100(于水中)中的分生孢子，以及图5c及图5f表示在蒸馏水中的分生孢子。图5g表示在叶片上的分生孢子的数量(学生t检验(P＝0.05)。比例尺：(a-c)100μm、(d-f)200μm)。相较于对照组(0.01％Triton X-100，图5b、图5e；及水，图5c、图5f)，二氧化硅-NH2皮克林乳液(图5a、图5d)在叶片上的分生孢子单元体分布显着更高。为了量化在叶片上的分生孢子单元体的数量，进行一Z系列以及实施一Z投影。Z投影的结果显示，在经研究的系统上，分生孢子的数量高于对照组(图5g，单向方差分析：F＝4.5042、df＝2、P＝0.0372)。其显示在喷涂分析的过程中，在皮克林乳液中的单个单元体封装可维持单元体的分散性，从而导致在叶片上具有更多的分生孢子单元体。
实例8-作为生物杀虫剂制剂的微囊的分生孢子的生物学功能
为了测试二氧化硅-NH2皮克林乳液作为生物杀虫剂制剂的功能，进行生物分析以评估不同样品的LT50。将含有及不含分生孢子的皮克林乳液及对照组喷涂于蓖麻的叶片上(参见表2)。使用50mL手动喷涂器(每次喷涂约100μL液体)处理蓖麻的双面叶片。此悬浮液包含10mL的1080个分生孢子。喷涂后，将叶片在通风橱中干燥30分钟。将经干燥的处理的叶片手工切开，并插入衬有滤纸的55mm陪替氏培养皿中，所述滤纸浸渍有500μL蒸馏水以保持高湿度，以及单一斜纹夜蛾(S.littoralis)三龄幼虫。针对各样品，使用20个幼虫。将板密封且在25℃下于12：12L/D光周期下进行培养。在第3、4及7天检验幼虫的死亡率(图6A及图6B)。在检验期间提供食物。自陪替氏培养皿中移除死亡的幼虫，并在潮湿的腔室内培养直至形成孢子为止。实验重复三次。
表2用于生物功能性生物分析的样品清单
Figure BDA0002803938480000141
Figure BDA0002803938480000151
经掺入分生孢子的皮克林乳液处理的幼虫显示75％的死亡率，而单独使用皮克林乳液制剂仅导致25％的死亡率。利用在0.01％Triton X-100中的分生孢子处理则导致40％的死亡率(图6A)。对数据进行死亡率及概率测试的校正。经校正的死亡率的分析是基于雅培(Abbott)的公式，所述公式是对使用于全世界的杀虫剂试验中的昆虫死亡率进行调整。结果分别显示于图6B和表3中。
表3在斜纹夜蛾幼虫分析中以天数为单位的中位致死时间(LT50)
Figure BDA0002803938480000152
表3显示相较于对照组，掺入分生孢子的皮克林乳液具有较高的杀虫活性。接种后7天开始进行孢子形成。将死亡的幼虫分开地置放在潮湿的条件下，以促进孢子形成并确认真菌病。针对孢子形成的情况，每天监控尸体。在14个死亡的幼虫中，有13个被真菌感染。图7A显示经孢子处理的幼虫尸体，而未经处理的幼虫的对照组则显示在图7B中。
实例9-共聚焦激光扫描显微镜及图像分析
通过激光扫描共聚焦显微镜(Olympus，FluoView 500)使用氩激光488nm激发对样品进行分析。在500nm至520nm处记录GFP的荧光发射。针对3D图像，使用配置有488nm光、HCPL APO CS 20×/0.75物镜(莱卡，韦茨拉尔，德国)及莱卡应用机组(Leica ApplicationSuite)X软件(LAS X，莱卡，韦茨拉尔，德国)的固态激光器的莱卡SP8激光扫描显微镜(德国，韦茨拉尔，德国)。使用氩激光对GFP信号进行成像。在500nm至525nm的范围内检测到发光。在650nm至700nm的范围内检测到叶绿体的自发荧光。针对棕色绿僵菌Mb7-GFP分生孢子的计数，首先使用Z投影(最大强度)投影图像堆叠，以找寻所有荧光的分生孢子，之后使用富士软件通过细胞计数器进行计数。基于共聚焦显微镜的图像，通过富士软件的颗粒分析工具以检测各样品的液滴的平均直径。自各图像中采样12滴液滴，并使用Origin软件(OriginLab，北安普顿，麻萨诸塞州)绘制一3D图。
实例10-扫描电子显微镜
使用MIRA3场发射SEM显微镜(泰思肯，布尔诺/捷克共和国)以1.0kV的加速电压及二次电子侦测器进行SEM检测。将皮克林乳液样品滴铸在导电的双粘碳带上，并在环境条件下干燥。在成像之前，将一碳薄层蒸发至其上，以使其具有导电性且避免通过电子束而使表面带电。
尽管已针对有限量的实施例描述本发明，然而应当理解，可实施本发明的许多变化、修改及其他应用。因此，所附权利要求书所请求保护的发明并不限于本文中所述的实施例。

Claims (39)

1.一种单个单元体的封装的方法，其特征在于：所述方法包括：
提供包括纳米颗粒的一水基溶液；
通过将一油溶液加入所述水基溶液中，以乳化所述水基溶液；
提供单元体至所述溶液中；
产生所述单元体的至少一单个单元体的封装。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纳米颗粒是二氧化硅纳米颗粒。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纳米颗粒是二氧化钛纳米颗粒。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纳米颗粒是有机纳米颗粒或无机纳米颗粒。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纳米颗粒引入官能团。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述官能团是下列其中之一者：胺基、丙烯酰氧基甲基三甲氧基硅烷、(3-丙烯酰氧基丙基)三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、正(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、乙基三甲氧基硅烷、正丙基三乙氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷、己基三甲氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、1-巯基十三烷基三甲氧基硅烷、S-(辛酰基)巯基丙基三乙氧基硅烷、1H,1H,2H,2H,2H-全氟辛基三甲氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、正辛基甲基二乙氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、十一烷基三氯硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷、二十二烷基三乙氧基硅烷、二甲基二甲氧基硅烷、二甲基二氯硅烷、正丁基三乙氧基硅烷、(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己基异氰基乙基)乙基三甲氧基硅烷、3-异氰丙基三乙氧基硅烷、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乳化是通过超声波震荡产生的。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述油基溶液是一石蜡油。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述油基溶液是下列其中之一者：硅油、葵花籽油、矿物油及其他的生物相容性及环保油。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述单元体是棕色绿僵菌Mb7分生孢子。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述单元体是下列其中之一者：细菌、病毒、酵母细胞、分生孢子、一真菌的孢子、一栖息于土壤的昆虫致病真菌、对昆虫致病的细菌及一杀虫剂释放组合物。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述真菌的孢子是下列其中之一者：金龟子绿僵菌、棕色绿僵菌、罗伯茨绿僵菌、耐寒绿僵菌、莱氏绿僵菌、蝗绿僵菌、布氏白僵菌、球孢白僵菌、蜡蚧轮枝菌、玫烟色棒孢霉菌。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述至少一单个单元体的封装是通过涡漩流产生的。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述纳米颗粒的含量是介于0.1重量％与10重量％之间。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述油/水的比例是下列其中之一者：分别为1：99、5：95、10：90、20：80、30：70、40：60及50:50。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述油滴尺寸的变化范围为0.1至300微米μm。
17.一种单个单元体的封装的方法，其特征在于：所述方法包括：
提供包括纳米颗粒的一水基溶液；
通过将一油溶液加入所述水基溶液中，以乳化所述水基溶液；
提供单元体至所述溶液中；
产生所述单元体的至少一单个单元体的封装；
将所述至少一单个单元体的封装至少施用于叶片上以防治害虫。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述纳米颗粒是二氧化硅纳米颗粒。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述纳米颗粒引入官能团。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于：所述官能团是下列其中之一者：胺基、丙烯酰氧基甲基三甲氧基硅烷、(3-丙烯酰氧基丙基)三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、正(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、乙基三甲氧基硅烷、正丙基三乙氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷、己基三甲氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、1-巯基十三烷基三甲氧基硅烷、S-(辛酰基)巯基丙基三乙氧基硅烷、1H,1H,2H,2H,2H-全氟辛基三甲氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、正辛基甲基二乙氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、十一烷基三氯硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷、二十二烷基三乙氧基硅烷、二甲基二甲氧基硅烷、二甲基二氯硅烷、正丁基三乙氧基硅烷、(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己基异氰基乙基)乙基三甲氧基硅烷、3-异氰丙基三乙氧基硅烷、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物。
21.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述乳化是通过超声波震荡产生的。
22.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述油基溶液是石蜡油。
23.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述单元体是棕色绿僵菌Mb7分生孢子。
24.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述单元体是下列其中之一者：细菌、病毒、酵母细胞、分生孢子、一真菌的孢子、一栖息于土壤的昆虫致病真菌、对昆虫致病的细菌及一杀虫剂释放组合物。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于：所述真菌的孢子是下列其中之一者：金龟子绿僵菌、棕色绿僵菌、罗伯茨绿僵菌、耐寒绿僵菌、莱氏绿僵菌、蝗绿僵菌、布氏白僵菌、球孢白僵菌、蜡蚧轮枝菌、玫烟色棒孢霉菌。
26.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述至少一单个单元体的封装是通过涡漩流产生的。
27.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述纳米颗粒的含量是介于0.1重量％与10重量％之间。
28.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述油/水的比例是下列其中之一者：分别为5：95、10：90、20：80及30：70。
29.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述至少于叶片上的叶片是蓖麻的叶片。
30.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述害虫是下列其中之一者：海灰翅夜蛾、鳞翅目、鞘翅目、半翅目、双翅目、直翅目、蜱螨类、腹足类。
31.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述害虫是节肢动物。
32.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述至少一单个单元体的封装在所述至少于叶片上产生一硅基蜂窝状构造。
33.如权利要求17所述的方法，其特征在于：所述油滴尺寸的变化范围为0.1至300微米。
34.一种单个单元体的封装，其特征在于：所述单个单元体的封装包括：
一油滴；
围绕所述油滴外围的多个纳米颗粒；以及
在所述油滴内的一单个单元体的颗粒。
35.如权利要求34所述的单个单元体的封装，其特征在于：所述油滴是一石蜡油滴。
36.如权利要求34所述的单个单元体的封装，其特征在于：所述多个纳米颗粒是二氧化硅纳米颗粒。
37.如权利要求34所述的单个单元体的封装，其特征在于：所述多个纳米颗粒引入官能团。
38.如权利要求37所述的单个单元体的封装，其特征在于：所述官能团是下列其中之一者：胺基、丙烯酰氧基甲基三甲氧基硅烷、(3-丙烯酰氧基丙基)三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、正(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、乙基三甲氧基硅烷、正丙基三乙氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷、己基三甲氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、1-巯基十三烷基三甲氧基硅烷、S-(辛酰基)巯基丙基三乙氧基硅烷、1H,1H,2H,2H,2H-全氟辛基三甲氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、正辛基甲基二乙氧基硅烷、(3,3,3-三氟丙基)三甲氧基硅烷、十一烷基三氯硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷、二十二烷基三乙氧基硅烷、二甲基二甲氧基硅烷、二甲基二氯硅烷、正丁基三乙氧基硅烷、(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己基异氰基乙基)乙基三甲氧基硅烷、3-异氰丙基三乙氧基硅烷、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物。
39.如权利要求34所述的单个单元体的封装，其特征在于：所述单个单元体的颗粒是棕色绿僵菌Mb7分生孢子。
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