CN112240900B - 一种乳酸生物传感器的制备方法 - Google Patents

一种乳酸生物传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乳酸生物传感器的制备方法,属于乳酸或乳酸盐检测技术领域。具体步骤包括铜纳米线修饰电极的制备,铜纳米线修饰电极电沉积原位生长铜铁普鲁士蓝,乳酸氧化酶的固定。本发明基于电化学沉积的方法,在一定量的铜纳米线上电沉积原位生长Cu/Fe‑PBA,通过调整电沉积的方法以及电沉积的条件来调控纳米材料的生长,从而调控材料的催化活性和导电性。本发明利用电沉积技术制备出具备高催化活性和高导电性的生物传感电极,再结合乳酸氧化酶制备出高性能的乳酸生物传感器。本发明方法制作简单,重复性高,且制备的乳酸生物传感器对乳酸和乳酸盐具有较高的灵敏度和较宽的线性范围。

Description

一种乳酸生物传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种乳酸生物传感器的制备方法,属于乳酸或乳酸盐检测技术领域。
背景技术
乳酸及其乳酸盐广泛存在于发酵工业中的底物与产物中,并且它的浓度影响着发酵产品的质量,因此在发酵产业中需要对乳酸浓度进行实时监测。乳酸对人体来说是一种十分重要的生理指标,血乳酸含量的高低可以表明人体是否处于健康的状态,比如新冠肺炎感染者的血乳酸含量会明显升高。关于乳酸检测技术,很多企业仍然使用的是传统的色谱、光谱的方法,这类方法检测耗时、设备昂贵,需要对员工进行专业的操作培训,并且检测具有一定的滞后性。生物传感器采用电化学和酶的方法,能够对待测物进行快速、精准的检测,操作简便,满足市场需求,但目前生物传感器制备工艺还不够成熟。生物传感器的基本原理是:底物乳酸在乳酸氧化酶的催化氧化下生成丙酮酸和过氧化氢。
普鲁士蓝及其类似物是一种天然的过氧化氢酶,又能够催化氧化过氧化氢产生电子,是比较理想的材料。普鲁士蓝及其类似物修饰电极已经广泛应用于电化学传感,然而普鲁士蓝导电性不好,极大限制了电化学传感领域中电子的传递。虽然已有很多将PB和其他纳米材料结合起来增加其导电性的案例,但大多都是采用化学合成的方法,两种材料之间结合力不强,稳定性不高,电子传输困难。综上,需要一种合适的方法来使PB和导电金属材料紧密结合,制备一种高性能的生物传感器。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乳酸生物传感器的制备方法,本发明制备的CuNWs@Cu/Fe-PBA纳米复合材料既满足了对过氧化氢高催化氧化的性能也满足了对了电子传输高导电性的需求,可以很好的应用于电化学传感领域。
本发明的技术方案为:一种乳酸生物传感器的制备方法,其具体步骤如下:
(1)铜纳米线修饰电极的制备:制备铜纳米线分散在溶剂中,超声振荡,得到铜纳米线液;金电极打磨至表面光滑无划痕,超声处理后冲洗;将铜纳米线液滴涂在处理过的金电极上,干燥后冲洗电极表面,得到铜纳米线修饰电极;
(2)铜纳米线修饰电极电沉积原位生长铜铁普鲁士蓝:配制电沉积溶液,将铜纳米线修饰电极与银/氯化银参比电极、铂对电极组成三电极体系,浸泡在含有电沉积溶液的电解池中;电沉积氧化铜纳米线,实现原位生长铜铁普鲁士蓝,沉积后冲洗电极表面,得到修饰电极a;
(3)乳酸氧化酶的固定:在磷酸缓冲液中加入Nafion®,混合均匀后加入BSA和乳酸氧化酶溶液得到酶溶液;取酶溶液滴涂到修饰电极a上,得到乳酸生物传感器。
其中,步骤(1)所述铜纳米线的直径为5~50nm,长度为1~50μm。
作为优选,步骤(1)中所述分散溶剂为水、乙醇、正己烷或异丙醇中的一种,加入量为10mL,铜纳米线的质量浓度约为2mg/L。
其中,步骤(1)中所述滴涂在电极上的铜纳米线溶液为2~10μL。作为优选,所述滴涂在电极上的铜纳米线溶液为4~6μL。
其中,步骤(2)中离子溶液浓度范围为1~100mM。作为优选,其浓度范围为10~50mM。酸溶液的浓度为0.1M。计时电流法电沉积的电位为0~1.2V,沉积时间为100-1000秒,循环次数为10~100次。最优选,计时电流法电沉积的电位为0.1~0.6V,沉积时间为400~600秒,循环次数为20~40次。
其中,步骤(3)中所述Nafion®所占磷酸缓冲液体积百分比为5~20%,所述BSA占磷酸缓冲液体积百分比为2~10%,所述酶溶液最终乳酸氧化酶浓度为50~500U/mL,滴涂到电极表面的酶为5μL。
作为优选, Nafion®体积占比8~16%,BSA体积占比4~8%,酶溶液最终浓度150~350U/mL。
与现有技术相比,本发明的优点和积极效果在于:
本发明是基于电化学沉积的方法,在一定量的铜纳米线上电沉积原位生长Cu/Fe-PBA,通过调整电沉积的方法以及电沉积的条件来调控纳米材料的生长,从而调控材料的催化活性和导电性。本发明利用电沉积技术制备出具备高催化活性和高导电性的生物传感电极,再结合乳酸氧化酶制备出高性能的乳酸生物传感器。本发明方法制作简单,重复性高,且制备的乳酸生物传感器对乳酸和乳酸盐(主要为乳酸钠)具有较高的灵敏度和较宽的线性范围。
附图说明
图1为合成的铜纳米线电镜图。
图2为实施铜纳米线电沉积原位生长铜铁普鲁士蓝的电镜图。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行详细的说明。
首先在金相抛光绒布上用抛光粉打磨金电极至表面光滑无划痕,在去离子水水和乙醇中超声处理30分钟,再用去离子水冲洗3次;将铜纳米线分散在溶剂中,超声振荡,将分散液滴涂在打磨处理过的金电极上,在室温下干燥后用去离子水冲洗电极表面;接着配制电沉积溶液,将修饰电极与银/氯化银参比电极、铂对电极组成三电极体系(银/氯化银参比电极、铂对电极均购自上海辰华,各电极之间通过电极线连接电化学工作站,其中工作电极连接绿色电极线,参比电极连接白色电极线,对电极连接红色电极线),浸在含有电沉积溶液的电解池中,在电化学工作站(上海辰华)上采用计时电流法(it)或循环伏安法(CV)进行电沉积,氧化铜纳米线实现原位生长Cu/Fe-PBA,沉积后的电极用去离子水冲洗,室温下干燥;配制含有Nafion®和BSA的乳酸氧化酶溶液并负载到修饰电极表面。
各实施例中所用到的铜纳米线采用如下步骤制得:
制备直径为5~50nm,长度为1~50μm的铜纳米线:称取0.17g CuCl2·2H2O溶解到80mL去离子水中,再称取1.44g十六胺(HAD)溶于溶液中,得到蓝色乳浊液,最后加入0.391g葡萄糖(C6H12O6)转移至水热釜进行反应,在120℃反应12小时得到红棕色铜纳米线,分别用30mL的水、乙醇、正己烷、异丙醇依次离心清洗得到纯净的铜纳米线,最后将铜纳米线保存在10mL正己烷和异丙醇(体积比3:1)的混合溶剂中。
实施例1
在金相抛光绒布上用抛光粉打磨金电极至表面光滑无划痕,分别在去离子水和乙醇中超声处理,最后用去离子水冲洗。取6μL铜纳米线溶液滴涂在打磨处理过的金电极上,在室温下干燥后用去离子水冲洗电极表面。配制含有50mM的KCl 、10mM的K3Fe(CN)6、0.1M盐酸的电沉积溶液,将修饰电极与银/氯化银参比电极、铂对电极组成三电极浸到电沉积溶液中进行电沉积,在电化学工作站上进行计时电流法电沉积,选择0.1V的电位电沉积1000秒,电沉积后的修饰电极取出用去离子水冲洗。配制含有5% Nafion®和2%BSA(体积百分比)的乳酸氧化酶溶液,最终酶浓度为50U/mL,取5μL酶溶液滴到修饰电极表面,使酶溶液在电极表面均匀铺展,放置冰箱4℃下干燥得到乳酸生物传感器。
将制备的乳酸生物传感器连接在电化学工作站上进行电化学检测,在0.2V的电位下进行计时电流测试:此例所制备的乳酸生物传感器对乳酸检测的灵敏度为9.27μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.15mM;对其盐类(主要为乳酸钠)检测的灵敏度为48.02μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.13M。实验后,将修饰电极置于4℃的pH=7的PBS缓冲液中一周,其响应信号基本不变;一个月后,其响应信号为初始信号的85%;三个月后,其响应信号仍为初始信号的75%,表明该传感器稳定性较好。
实施例2
本实施例与实施例1中铜纳米线和金电极的处理相同,不同之处在于取8μL铜纳米线溶液滴涂在打磨处理过的金电极上,在室温下干燥后用去离子水冲洗电极表面。配制含有50mM KCl 、50mM K4Fe(CN)6、0.1M硫酸的电沉积溶液,在电化学工作站上进行计时电流法电沉积,选择0.2V的电位电沉积800秒,电沉积后的修饰电极取出用去离子水冲洗。配制含有8% Nafion®和4%BSA的乳酸氧化酶溶液,最终酶浓度为150U/mL,取5μL酶溶液滴到修饰电极表面,使酶溶液在电极表面均匀铺展,放置冰箱4℃下干燥得到乳酸生物传感器。
将制备的乳酸生物传感器连接在电化学工作站上进行电化学检测,在0.2V的电位下进行计时电流测试:此例所制备的乳酸生物传感器对乳酸检测的灵敏度为10.11μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.15mM;对其盐类(主要为乳酸钠)检测的灵敏度为50.38μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.13M。实验后,将修饰电极置于4℃的pH=7的PBS缓冲液中一周,其响应信号基本不变;一个月后,其响应信号为初始信号的93%;三个月后,其响应信号仍为初始信号的81%,表明该传感器稳定性较好。
实施例3
本实施例与实施例1中铜纳米线和金电极的处理相同,不同之处在于取10μL铜纳米线溶液滴涂在打磨处理过的金电极上,在室温下干燥后用去离子水冲洗电极表面。配制含有50mM KCl 、100mM K3Fe(CN)6、0.1M硝酸的电沉积溶液,在电化学工作站上进行计时电流法电沉积,选择0.3V的电位电沉积500秒,电沉积后的修饰电极取出用去离子水冲洗。配制含有10% Nafion®和6%BSA的乳酸氧化酶溶液,最终酶浓度为250U/mL,取5μL酶溶液滴到修饰电极表面,使酶溶液在电极表面均匀铺展,放置冰箱4℃下干燥得到乳酸生物传感器。
将制备的乳酸生物传感器连接在电化学工作站上进行电化学检测,在0.2V的电位下进行计时电流测试:此例所制备的乳酸生物传感器对乳酸检测的灵敏度为11.24μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.15mM;对其盐类(主要为乳酸钠)检测的灵敏度为53.47μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.13M。实验后,将修饰电极置于4℃的pH=7的PBS缓冲液中一周,其响应信号基本不变;一个月后,其响应信号为初始信号的95%;三个月后,其响应信号仍为初始信号的83%,表明该传感器稳定性较好。
实施例4
本实施例与实施例1中铜纳米线和金电极的处理相同,不同之处在于取4μL铜纳米线溶液滴涂在打磨处理过的金电极上,在室温下干燥后用去离子水冲洗电极表面。配制含有50mM KCl 、25mM K4Fe(CN)6、0.1M盐酸的电沉积溶液,在电化学工作站上进行循环伏安法电沉积,选择0~1.2V的电位电沉积20次,电沉积后的修饰电极取出用去离子水冲洗。配制含有13% Nafion®和8%BSA的乳酸氧化酶溶液,最终酶浓度为350U/mL,取5μL酶溶液滴到修饰电极表面,使酶溶液在电极表面均匀铺展,放置冰箱4℃下干燥得到乳酸生物传感器。
将制备的乳酸生物传感器连接在电化学工作站上进行电化学检测,在0.2V的电位下进行计时电流测试:此例所制备的乳酸生物传感器对乳酸检测的灵敏度为9.88μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.15mM;对其盐类(主要为乳酸钠)检测的灵敏度为47.13μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.13M。实验后,将修饰电极置于4℃的pH=7的PBS缓冲液中一周,其响应信号基本不变;一个月后,其响应信号为初始信号的95%;三个月后,其响应信号仍为初始信号的82%,表明该传感器稳定性较好。
实施例5
本实施例与实施例1中铜纳米线和金电极的处理相同,不同之处在于取2μL铜纳米线溶液滴涂在打磨处理过的金电极上,在室温下干燥后用去离子水冲洗电极表面。配制含有50mM KCl 、60mM K3Fe(CN)6、0.1M硫酸的电沉积溶液,将修饰电极与银/氯化银参比电极、铂对电极组成三电极浸到电沉积溶液中进行电沉积,在电化学工作站上进行循环伏安法电沉积,选择0~1.0V的电位电沉积40次,电沉积后的修饰电极取出用去离子水冲洗。配制含有16% Nafion®和10%BSA的乳酸氧化酶溶液,最终酶浓度为450U/mL,取5μL酶溶液滴到修饰电极表面,使酶溶液在电极表面均匀铺展,放置冰箱4℃下干燥得到乳酸生物传感器。
将制备的乳酸生物传感器连接在电化学工作站上进行电化学检测,在0.2V的电位下进行计时电流测试:此例所制备的乳酸生物传感器对乳酸检测的灵敏度为10.09μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.15mM;对其盐类(主要为乳酸钠)检测的灵敏度为56.77μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.13M。实验后,将修饰电极置于4℃的pH=7的PBS缓冲液中一周,其响应信号基本不变;一个月后,其响应信号为初始信号的91%;三个月后,其响应信号仍为初始信号的80%,表明该传感器稳定性较好。
实施例6
本实施例铜纳米线的制备方法相同,不同之处在于:最后将铜纳米线保存在10mL去离子水中;
在金相抛光绒布上用抛光粉打磨金电极至表面光滑无划痕,分别在去离子水和乙醇中超声处理,最后用去离子水冲洗。取2μL本实施例中的铜纳米线溶液滴涂在打磨处理过的金电极上,在室温下干燥后用去离子水冲洗电极表面。配制含有50mM KCl 、70mM K4Fe(CN)6、0.1M硝酸的电沉积溶液,在电化学工作站上进行计时电流法电沉积,选择0.8V的电位电沉积200秒,电沉积后的修饰电极取出用去离子水冲洗。配制含有10% Nafion®和8%BSA的乳酸氧化酶溶液,最终酶浓度为250U/mL,取5μL酶溶液滴到修饰电极表面,使酶溶液在电极表面均匀铺展,放置冰箱4℃下干燥得到乳酸生物传感器。
将制备的乳酸生物传感器连接在电化学工作站上进行电化学检测,在0.2V的电位下进行计时电流测试:此例所制备的乳酸生物传感器对乳酸检测的灵敏度为10.51μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.15mM;对其盐类(主要为乳酸钠)检测的灵敏度为50.22μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.13M。实验后,将修饰电极置于4℃的pH=7的PBS缓冲液中一周,其响应信号基本不变;一个月后,其响应信号为初始信号的96%;三个月后,其响应信号仍为初始信号的84%,表明该传感器稳定性较好。
实施例7
本实施例铜纳米线的制备方法相同,不同之处在于:最后将铜纳米线保存在10mL乙醇中;
在金相抛光绒布上用抛光粉打磨金电极至表面光滑无划痕,分别在去离子水和乙醇中超声处理,最后用去离子水冲洗。取2μL本实施例中的铜纳米线溶液滴涂在打磨处理过的金电极上,在室温下干燥后用去离子水冲洗电极表面。配制含有50mM KCl 、80mM K3Fe(CN)6、0.1M盐酸的电沉积溶液,在电化学工作站上进行循环伏安法电沉积,选择0~0.4V的电位电沉积80次,电沉积后的修饰电极取出用去离子水冲洗。配制含有15% Nafion®和8%BSA的乳酸氧化酶溶液,最终酶浓度为50U/mL,取5μL酶溶液滴到修饰电极表面,使酶溶液在电极表面均匀铺展,放置冰箱4℃下干燥得到乳酸生物传感器。
将制备的乳酸生物传感器连接在电化学工作站上进行电化学检测,在0.2V的电位下进行计时电流测试:此例所制备的乳酸生物传感器对乳酸检测的灵敏度为9.15μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.15mM;对其盐类(主要为乳酸钠)检测的灵敏度为47.56μA·mM-1·cm-2,检测线性范围为0~0.13M。实验后,将修饰电极置于4℃的pH=7的PBS缓冲液中一周,其响应信号基本不变;一个月后,其响应信号为初始信号的91%;三个月后,其响应信号仍为初始信号的79%,表明该传感器稳定性较好。
实施例8
本实施例为重复性验证例。本实施例采用与实施例1~7相同的步骤,平行制备出乳酸生物传感器,并在相同的条件下进行计时电流测试,均表现出较高的灵敏度,且与实施例1~7比较,灵敏度误差在5%以内,证明此方法制备的乳酸生物传感器重复性好。结果如下:
Figure 833676DEST_PATH_IMAGE001
传统电沉积普鲁士蓝需要阳离子供体和阴离子供体两种溶液,两种溶液先反应生成普鲁士蓝再电沉积到电极上。本发明中仅需要阴离子供体(K3Fe(CN)6或K4Fe(CN)6),将修饰电极浸入到电沉积溶液中,施加电位将铜纳米线氧化成二价铜离子,在将表面的铜氧化时,同时会将溶液中的铁氰根离子或亚铁氰根离子电沉积到电极上,与铜纳米线表面的铜离子反应,实现在铜纳米线上原位生长铜铁普鲁士蓝,电子传输更快。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域,但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种乳酸生物传感器的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)铜纳米线修饰电极的制备:制备铜纳米线分散在溶剂中,超声振荡,得到铜纳米线液;金电极打磨至表面光滑无划痕,超声处理后冲洗;将铜纳米线液滴涂在处理过的金电极上,干燥后冲洗电极表面,得到铜纳米线修饰电极;
(2)铜纳米线修饰电极电沉积原位生长铜铁普鲁士蓝:配制电沉积溶液,将铜纳米线修饰电极与银/氯化银参比电极、铂对电极组成三电极体系,浸泡在含有电沉积溶液的电解池中;电沉积氧化铜纳米线,实现原位生长铜铁普鲁士蓝,沉积后冲洗电极表面,得到修饰电极a;
(3)乳酸氧化酶的固定:在磷酸缓冲液中加入Nafion®,混合均匀后加入BSA和乳酸氧化酶溶液得到酶溶液;取酶溶液滴涂到修饰电极a上,得到乳酸生物传感器。
2.根据权利要求1所述乳酸生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述铜纳米线的直径为5~50nm,长度为1~50μm。
3.根据权利要求1所述乳酸生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述分散溶剂为水、乙醇、正己烷或异丙醇中的至少一种。
4.根据权利要求1所述乳酸生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述滴涂在电极上的铜纳米线溶液为2~10μL。
5.根据权利要求1所述乳酸生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述,电沉积溶液为一种离子溶液与酸溶液的混合溶液,离子溶液浓度范围为1~100mM,酸溶液的浓度为0.1M;所述离子溶液供体为KCl 与K3Fe(CN)6或K4Fe(CN)6的混合溶液;所述酸溶液为盐酸、硫酸、硝酸中的任意一种。
6.根据权利要求1所述乳酸生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述电沉积的方法为计时电流法或循环伏安法。
7.根据权利要求1所述乳酸生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述电沉积的电位为0~1.2V,电沉积时间为100-1000s,电沉积次数为10~100次。
8.根据权利要求1所述乳酸生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述Nafion®所占磷酸缓冲液体积百分比为5~20%, BSA占磷酸缓冲液体积百分比为2~10%,所述酶溶液中乳酸氧化酶浓度为50~500U/mL,滴涂到电极表面的酶为5μL。
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