CN112237583A - 一叶萩碱链连二聚化合物sn3-l6或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用 - Google Patents

一叶萩碱链连二聚化合物sn3-l6或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一叶萩碱链连二聚化合物SN3‑L6或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用。本发明中发现了SN3‑L6具有较好的体外抗白血病效果，可以明显抑制急性髓性白血病细胞细胞增殖，诱导细胞转分化为巨核细胞，再诱导巨核细胞产生血小板，在急性髓性白血病转分化治疗，体外制造血小板方面具有良好的药用前景；且本发明中的SN3‑L6还可以诱导慢性红白血病细胞转分化为巨核细胞，再诱导此巨核细胞进入凋亡，其在慢性红系白血病治疗方面同样具有良好的药用前景。

Description

一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐在制备抗白血病 药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，特别涉及一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用。
背景技术
白血病是一种造血干细胞恶性克隆性疾病，具有增殖失控，分化障碍，凋亡受阻的特性。急性髓性白血病是白血病中发病最快的一种，而急性早幼粒细胞白血病又是急性髓性白血病中最险恶的一种。急性早幼粒细胞白血病目前主要靠全反式维甲酸诱导分化治疗，但是全反式维甲酸长期治疗也会出现明显的副反应和耐药的发生，如凝血障碍风险增加，全反式维甲酸综合征，脓毒性关节炎的发生等(Castaigne et al.Blood 1990,76:1704-1709.Breccia,M.et al.Haematologica 2008,93:1918-1920.Akoz,A.G.et al.ActaOncol 2007,46:1193-1194)。目前还没有新的白血病分化诱导剂运用于临床，因此开发新型机制的促白血病分化诱导剂抗白血病是必须的。
血小板输注是临床治疗创伤性大出血，外科手术出血，放疗和化疗导致血小板减少，败血症和其他的血小板相关适应症的重要治疗手段。目前临床输注的血小板全部是依靠志愿者捐献获得，在美国每年需要输注1×106单位血小板，有限的血小板捐赠来源，血小板保存方法不当和有效期的限制，导致临床血小板明显供不应求(Stroncek DF,RebullaP.Platelet transfusions.Lancet.2007,370:427-438)。目前还没有化学体外诱导制造血小板的方法报道，因此开发高效的体外化学诱导制造血小板方法以解决临床血小板荒是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用，所述的一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6为左旋一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6，其结构式如式I所示：
Figure BDA0002131543150000021
所述的抗白血病包括急性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病，粒细胞白血病，粒－单核细胞白血病(M4)，单核细胞白血病，慢性嗜中性粒细胞白血病和红白血病(M6)。
所述的粒细胞白血病包括慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病和亚急性粒细胞白血病(M7，亚急粒)。
所述的急性粒细胞白血病包括未分化型(M1，急粒)、部分分化型(M2，急粒)和颗粒增多的早幼粒细胞白血病(M3，早幼粒)。
所述的粒－单核细胞白血病包括慢性粒－单核细胞白血病和急性粒－单核细胞白血病。
所述的单核细胞白血病包括慢性单核细胞白血病和急性单核细胞白血病(M5，急单)。
所述的一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6的有效浓度为0.5～30μM。
一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐在制备抑制白血病细胞增殖的药物，诱导白血病细胞转分化为巨核细胞的药物，诱导巨核细胞产生(释放)血小板的药物，诱导巨核细胞凋亡的药物，诱导白血病细胞多倍体化的药物，和/或增强抑癌蛋白P53的表达的药物中的应用；其中，所述的一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6为左旋一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6，其结构式如式I所示。
所述的一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6的有效浓度为0.5～30μM。
所述的药物还可以含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体；以上述一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐为活性成份，加上药学上可接受的载体制成药物。
所述的载体优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、吸收剂、表面活性剂或润滑剂等。
所述的药物可以进一步制成注射剂、片剂、丸剂、颗粒剂或胶囊等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的SN3-L6具有较好的体外抗白血病效果，可以明显抑制急性髓性白血病细胞HL60细胞增殖，诱导HL60细胞转分化为巨核细胞，再诱导巨核细胞产生血小板，在急性髓性白血病转分化治疗，体外制造血小板方面具有较好的药用前景。
(2)本发明的SN3-L6还可以诱导慢性红白血病细胞K562转分化为巨核细胞，再诱导此巨核细胞进入凋亡，在慢性红系白血病治疗方面具有较好的药用前景。
(3)本发明的SN3-L6对正常细胞尤其是心肌细胞AC16没有毒性。
附图说明
图1为SN3-L6对HL60细胞的生长抑制曲线图。
图2为10μM的SN3-L6作用于HL60细胞3天和6天后(以DMSO为对照)的细胞瑞氏-吉姆萨染色图。
图3为7.5μM的SN3-L6作用于HL60细胞6天后(以DMSO为对照)流式细胞仪检测到的细胞信号图。
图4为0.5μM,1μM,5μM,10μM和15μM的SN3-L6作用于HL60细胞3天，6天，9天和12天后(以DMSO为对照)倒置差相显微镜拍照图。
图5为5μM,10μM,15μM,20μM和30μM的SN3-L6作用于HL60细胞6天，8天，14天，16天和18天后倒置差相显微镜拍照图。
图6为15μM的SN3-L6作用于HL60细胞9天后与FITC-CD41b或PE-CD61抗体共孵育后激光共聚焦显微镜拍照图；其中，a为与FITC-CD41b(FITC)抗体共孵育后的结果；b为与PE-CD61(PE)抗体共孵育的结果。
图7为0μM(即对照DMSO),1.625μM,3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用于HL60细胞3天，6天，8天，和10天后与FITC-CD41b或PE-CD61抗体孵育后流式细胞仪检测所得相对荧光强度统计图；其中，A为与FITC-CD41b抗体共孵育后的结果；B为与PE-CD61抗体共孵育的结果。
图8为7.5μM和15μM的SN3-L6作用于HL60细胞5天，7天，8天，和10天后所释放的小颗粒与FITC-CD41b或PE-CD61抗体孵育后流式细胞仪检测所得相对荧光强度统计图(图中：Blank为空白对照；platelet为血小板)。
图9为用流式细胞仪检测0μM(即对照DMSO),1.625μM,3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用于HL60细胞3天后细胞线粒体膜电位图；其中，a为0μM的SN3-L6；b为1.625μM的SN3-L6；c为3.25μM的SN3-L6；d为7.5μM的SN3-L6；e为15μM的SN3-L6；f为30μM的SN3-L6。
图10为用流式细胞仪检测3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用于HL60细胞6天后所释放的血小板凋亡情况图；其中，a为血小板(platelet)；b为3.25μM的SN3-L6；c为7.5μM的SN3-L6；d为15μM的SN3-L6；e为30μM的SN3-L6。
图11为用流式细胞仪检测3.25μM的SN3-L6作用于HL60细胞0天，2天，4天，6天，8天和10天后细胞周期图；其中，a为SN3-L6作用于细胞0天(当天)的结果；b为SN3-L6作用于细胞2天后的结果；c为SN3-L6作用于细胞4天后的结果；d为SN3-L6作用于细胞6天后的结果；e为SN3-L6作用于细胞8天后的结果；f为SN3-L6作用于细胞10天后的结果。
图12为0μM(即对照DMSO)和1μM全反式维甲酸(ATRA)作用于HL60细胞5天后显微镜拍照图和瑞氏-吉姆萨染色图，以及用流式细胞仪检测0μM和1μM全反式维甲酸(ATRA)作用于HL60细胞5天后与FITC-CD11b孵育后细胞相对荧光强度统计图；其中，A为1μM全反式维甲酸作用于HL60细胞5天后的显微镜拍照结果；B为1μM全反式维甲酸作用于HL60细胞5天后的显微镜拍照结果；C为0μM全反式维甲酸作用于HL60细胞5天后的瑞氏-吉姆萨染色结果；D为0μM全反式维甲酸作用于HL60细胞5天后的瑞氏-吉姆萨染色结果；E为用流式细胞仪检测0μM和1μM全反式维甲酸作用于HL60细胞5天后与FITC-CD11b和PE-CD14孵育后细胞相对荧光强度统计图。
图13为用流式细胞仪检测0μM(即对照DMSO)和1μM全反式维甲酸(ATRA)作用于HL60细胞5天后再加入1.625μM,3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用3天后与FITC-CD41b,PE-CD61抗体孵育后细胞相对荧光强度统计图。
图14为0μM(即对照DMSO),1.625μM,3.25μM,7.5μM和15μM的SN3-L6作用于HL60细胞3天后Western-blot检测P53,Caspase 3,Bcl-2蛋白表达结果图。
图15为用流式细胞仪检测0μM(即对照DMSO),1μM，1.625μM,3.25μM,7.5μM和15μM的SN3-L6作用于K562细胞2天后细胞周期图；其中，a为0μM的SN3-L6；b为1μM的SN3-L6；c为1.625μM的SN3-L6；d为3.25μM的SN3-L6；e为7.5μM的SN3-L6；f为15μM的SN3-L6。
图16为0μM(即对照DMSO),1μM,2μM,4μM,8μM和16μM SN3-L6作用于K562细胞2天，4天和6天后倒置差相显微镜拍照图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明中所用到的左旋一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6(简称SN3-L6)参考中国发明专利(专利号为201510106974.2，名称为一叶萩型生物碱二聚体类化合物或其可药用盐及其制法和应用)中的方法合成得到，通过1H-NMR,13C-NMR,LRMS和HRMS鉴定结构(ASCChemical Neuroscience,2016,7,1442-1451)，纯度利用HPLC测得在98％以上。
Figure BDA0002131543150000051
实施例1 SN3-L6对白血病细胞HL60增殖的抑制作用
(1)实验方法：取对数期生长的HL60细胞(购于中山大学细胞库)，接种于25cm2细胞培养瓶，1.5万/mL，10mL/瓶。分别加入终浓度为7.5μM SN3-L6和等体积的DMSO(二甲基亚砜，其终浓度控制在0.1％(v/v)以下)处理，放入恒温细胞培养箱，每两天换一次液和加一次药，每两天进行一次细胞计数(当细胞密度大于50万时进行稀释培养)，拟出细胞生长曲线，如图1所示。
(2)试验结果：SN3-L6可以明显抑制HL60细胞的增殖。
实施例2 SN3-L6处理后的HL60细胞瑞氏-吉姆萨染色
(1)实验方法：取对数期生长的HL60细胞，接种于6孔板，5万/孔，2mL/孔，依此加入终浓度为10μM的SN3-L6和等体积的DMSO(终浓度控制在0.1％(v/v)以下)分别处理3天和6天，第3天或者第6天收集细胞悬液离心，弃上清，再加入PBS(PBS缓冲液，pH 7.4)重悬离心再次收集细胞沉淀，反复洗三次收集细胞。最后加入200微升PBS将细胞重悬，涂布于多聚甲醛浸泡晾干的载玻片上，晾干，使得细胞在玻片上均匀单层分布。加入吉姆萨-瑞氏染色A液1000微升于玻片上含有细胞区域，同时用洗耳球反复轻轻吹打染液约3分钟后加入300微升染液B，轻轻吹打使得A，B液混匀，2分钟后，再用自来水轻轻冲洗破片，将染液洗去，晾干玻片。倒置差相显微镜下观察并拍照，结果如图2所示。
(2)试验结果：10μM的SN3-L6作用于HL60细胞3天和6天后，细胞和细胞核明显变大，表现出巨核细胞的形态。
实施例3 SN3-L6处理后的HL60细胞流式细胞检测
(1)实验方法：取对数生长期HL60细胞接种于6孔板中，10万个细胞/孔，加入终浓度为7.5μM的SN3-L6和等体积的DMSO(终浓度控制在0.1％(v/v)以下)处理HL60细胞6天后，离心收集细胞，PBS洗三次后上流式细胞仪检测细胞信号，结果如图3所示。
(2)试验结果：7.5μM的SN3-L6作用于HL60细胞后，横坐标FSC值明显右移，表示细胞明显变大，纵坐标SSC值明显上移，表明细胞内部颗粒复杂程度也明显增加。
实施例4 SN3-L6处理后的HL60细胞
(1)实验方法：取对数生长期HL60细胞接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入终浓度为0μM(即不加入药物，相应加入等体积的DMSO；下同)，0.5μM,1μM,5μM,10μM和15μM的SN3-L6作用于HL60细胞3天，6天，9天和12天后，依次用倒置差相显微镜拍照，结果如图4所示。
(2)试验结果：5μM,10μM和15μM的SN3-L6作用于HL60细胞3天，6天，9天和12天后细胞明显依次变大，6天后细胞开始变形运动，少数巨核细胞已经释放血小板，9天后可以看到巨核细胞明显释放血小板，12天后释放更多的血小板。
实施例5 SN3-L6处理后的HL60细胞拍照图。
(1)实验方法：取对数生长期HL60细胞接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入终浓度为5μM,10μM,15μM,20μM和30μM的SN3-L6作用于HL60细胞6天，8天，14天，16天和18天后依次用倒置差相显微镜拍照，结果如图5所示。
(2)试验结果：5μM,10μM,15μM,20μM和30μM的SN3-L6作用于HL60细胞8天后明显看到巨核细胞产生的血小板，14天，16天，18天巨核细胞基本完全释放血小板，剩下散在的裸核。
实施例6 SN3-L6处理后的HL60细胞后激光共聚焦显微镜拍照图
(1)实验方法：取对数生长期HL60细胞接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入终浓度为15μM的SN3-L6作用于HL60细胞9天后，收集细胞，然后分别与FITC-CD41b,PE-CD61抗体(抗体均购于BD Biosciences)孵育30分钟后，用冷的PBS洗3次后用激光共聚焦显微镜拍照，结果如图6所示。
(2)试验结果：15μM的SN3-L6作用于HL60细胞9天后，细胞和FITC-CD41b,PE-CD61抗体孵育后荧光很强，表明细胞高表达巨核细胞表面抗原CD41b和CD61。
实施例7 SN3-L6处理后的HL60细胞表面抗原CD41b和CD61表达检测
(1)实验方法：取对数生长期HL60细胞接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入终浓度为0μM,1.625μM,3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用于HL60细胞3天，6天，8天和10天后离心收集细胞，PBS清洗三次，然后分别加入FITC-CD41b和PE-CD61抗体室温孵育30分钟。再离心收集细胞，PBS清洗三次再次收集细胞，最后加入200μL PBS重悬，设置合适的流式细胞检测参数，上机检测荧光，结果如图7所示。
(2)试验结果：1.625μM,3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用3天，6天，8天和10天后,细胞明显高表达巨核细胞表面抗原CD41b和CD61，且具有浓度依赖性。
实施例8 SN3-L6处理后的HL60细胞所释放小颗粒表面抗原CD41b和CD61表达检测(1)实验方法：取对数生长期HL60细胞接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入终浓度为7.5μM和15μM的SN3-L6作用于HL60细胞5天，7天，8天和10天后，3000rpm、10min离心收集悬液里的小颗粒，PBS清洗三次，分别加入FITC-CD41b和PE-CD61抗体室温孵育30分钟。再离心收集细胞，PBS清洗三次再次收集细胞，最后加入200μL PBS重悬，设置合适的流式细胞检测参数，上机检测荧光，结果如图8所示。
(2)试验结果：7.5μM和15μM的SN3-L6作用于HL60细胞5天，7天，8天和10天后，释放的小颗粒表面明显高表达血小板(platelet)特异性抗原CD41b和CD61，表明此小颗粒是血小板。
实施例9 SN3-L6处理3天后的HL60细胞线粒体膜电位检测
(1)实验方法：取对数生长期HL60细胞接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入终浓度为0μM,1.625μM,3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用3天后离心收集细胞，PBS清洗三次，加入200μL JC-1染液(线粒体膜电位检测试剂盒)重悬，室温避光孵育染色15分钟，设置合适的流式细胞检测仪参数，上机检测，结果如图9所示。
(2)试验结果：1.625μM,3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用于HL60细胞3天后细胞线粒体膜电位没有明显的变化，表明SN3-L6作用于细胞后细胞没有发生线粒体依赖性凋亡。
实施例10 SN3-L6处理6天后的HL60细胞所产生血小板凋亡检测
(1)实验方法：取对数生长期HL60细胞接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入终浓度为3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用6天后，3000rpm、10min离心收集悬液里的血小板，PBS洗三次后再收集血小板。加入50μL Binding buffer，再分别加入2.5μL PI染液和2.5μL FITC-Annexin-V染液重悬，避光染色15分钟后加入150μL Binding buffer，离心收集细胞。再加入200μL Binding buffer，设置合适的流式细胞检测仪参数，上机检测，结果如图10所示。
(2)试验结果：3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用于HL60细胞6天后产生的血小板没有发生明显的凋亡。
实施例11 SN3-L6处理后的HL60细胞周期检测
(1)实验方法：取对数生长期HL60细胞接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入终浓度为3.25μM的SN3-L6作用2天，4天，6天，8天和10天后收集细胞，PBS清洗三次再收集，再加入300μL PBS和700μL无水酒精混匀于4℃固定过夜。将固定过夜的样本离心收集细胞，加入200微升PI染液，染色15分钟，过滤膜，设置合适的流式细胞检测仪参数，上机检测，结果如图11所示。
(2)试验结果：3.25μM SN3-L6作用2天，4天，6天，8天和10天后的HL60细胞出现明显8倍体，16倍体，32倍体等高倍体特征，表明SN3-L6明显诱导HL60细胞多倍体化，且具有时间依赖性。
实施例12 ATRA处理5天后的HL60细胞表面抗原CD11b,CD14检测
(1)实验方法：取对数生长期HL60细胞接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入终浓度为1μM的全反式维甲酸(ATRA)作用5天后收集细胞，PBS清洗三次再收集细胞，分别加入FITC-CD11b和PE-CD14抗体(抗体均购于BD Biosciences)室温孵育30分钟。再离心收集细胞，PBS清洗三次再次收集细胞，最后加入200μL PBS重悬，设置合适的流式细胞检测参数，上机检测荧光，结果如图12所示。
(2)试验结果：1μM ATRA作用于HL60细胞5天后，成熟粒细胞表明抗原CD11b呈现高表达，表明1μM ATRA诱导HL60细胞往成熟粒细胞分化。
实施例13 ATRA处理5天后的HL60细胞再加入SN3-L6作用3天后表面抗原CD41b,CD61检测
(1)实验方法：取对数生长期HL60细胞接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入1μMATRA作用于5天后再加入终浓度为1.625μM,3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用3天后收集细胞，PBS清洗三次再收集细胞，分别加入FITC-CD41b和PE-CD61抗体室温孵育30分钟。再离心收集细胞，PBS清洗三次再次收集细胞，最后加入200μL PBS重悬，设置合适的流式细胞检测参数，上机检测荧光，结果如图13所示。
(2)试验结果：1.625μM,3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用于成熟粒细胞3天后并没有出现巨核细胞，表明特异性抗原CD41b和CD61的高表达，说明SN3-L6不会诱导成熟的粒细胞多倍体化，在低分化的白血病细胞和高分化的血细胞之间表现出选择性。
实施例14 Western Blot检测SN3-L6作用3天后的HL60细胞蛋白表达情况
(1)实验方法：取对数生长期HL60细胞接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入终浓度为0μM,1μM,1.625μM,3.25μM,7.5μM,15μM和30μM的SN3-L6作用于HL60细胞3天后离心收集细胞，预冷PBS洗3次，加入RIPA裂解液100μL混匀，放入冰上裂解，每一分钟拿出用手指轻弹离心管底部，以让细胞和裂解液充分接触，裂解2～5min后于4℃、13000r/m离心15分钟，吸取上清。BCA法测蛋白浓度。将蛋白样品与5×loading buffer混匀，95℃水浴10分钟。80V电泳致分离胶后120V继续电泳至溴芬蓝跑到前沿。200mA恒流电泳60min转膜。用5％脱脂奶粉(TBST配置)封闭2小时，TBST洗3次，每次5分钟。4℃过夜孵育一抗(用一抗稀释液按1:1000比例稀释)，后TBST洗3次，每次15分钟。常温孵育二抗(用2.5％脱脂奶粉按1:5000比例稀释)2h。TBST洗3次，每次15分钟。分别取500μL化学发光液A液、B液(Thermo)混匀后浇湿PVDF膜，约1分钟后用化学发光仪检测化学发光，得到条带，用Carestream软件分析处理条带，结果如图14所示。
(2)试验结果：0μM,1.625μM,3.25μM,7.5μM和15μM的SN3-L6作用于HL60细胞3天后，维持细胞生长必须的蛋白Bcl-2的表达没有下降，凋亡相关蛋白Casepase 3表达没有下降，说明细胞没有凋亡。抑癌蛋白P53表达增强，表明细胞不再恶性增殖，变成受控的细胞。
实施例15 SN3-L6处理后的K562细胞周期检测
(1)实验方法：取对数生长期K562细胞(购于中山大学细胞库)接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入终浓度为0μM,1μM,1.625μM,3.25μM,7.5μM和15μM的SN3-L6作用2天后收集细胞，PBS清洗三次再收集，再加入300μL PBS和700μL无水酒精混匀于4℃固定过夜。将固定过夜的样本离心收集细胞，加入200微升PI染液，染色15分钟，过滤膜，设置合适的流式细胞检测仪参数，上机检测，结果如图15所示。
(2)试验结果：1μM,1.625μM,3.25μM,7.5μM和15μM的SN3-L6作用于K562细胞2天后，细胞出现明显的8倍体，16倍体，32倍体等多倍体，表明SN3-L6明显诱导K562细胞多倍体化，且具有浓度依赖性。
实施例16 SN3-L6处理后的K562细胞拍照图。
(1)实验方法：取对数生长期K562细胞接种于6孔板中(10万个细胞/孔)，加入终浓度为0μM,1μM,2μM,4μM,8μM和16μM的SN3-L6作用于K562细胞2天，4天和6天后，依次用倒置差相显微镜拍照，结果如图16所示。
(2)试验结果：1μM,2μM,4μM,8μM和16μM SN3-L6作用于K562细胞2天后细胞明显变大，4μM,8μM和16μM SN3-L6作用于K562细胞4天后细胞凋亡，2μM,4μM,8μM和16μM SN3-L6作用于K562细胞6天后细胞凋亡更明显。表明SN3-L6诱导K562细胞形成巨核细胞后，再诱导巨核细胞走向凋亡。
实施例17 SN3-L6对正常心肌细胞AC16的生长影响
(1)实验方法：取处于对数生长期AC16细胞(广州吉赛生物科技股份有限公司)接种到96孔板，每个孔接种5000个细胞，每孔100微升，边缘孔用200微升无菌PBS填充，培养过夜。将原培养基换成等量含药(100μM、75μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1μM)的培养基，培养72h。同时设置空白对照孔，空白对照孔加入培养基、MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)和DMSO(体系中MTT和DMSO含量均为0.01％(w/v))。加药孔加入培养基、MTT和化合物SN3-L6。每个浓度设置5个复孔。作用72h后每个孔再加入20微升0.5％的MTT，恒温培养箱孵育4h。将上清液吸干，小心不要触碰到底部细胞，加入120微升DMSO振摇10min，以使甲簪充分溶解。利用酶标仪测定570nm处波长的吸光值。细胞生长抑制率(％)＝(对照组OD值-药敏组OD值)/对照组OD值×100％。按如下公式计算IC50：IC50＝lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]；式中：xm为最大剂量的对数，i为相邻剂量的比值的对数，∑p为各组死亡率总和。
(2)试验结果：100μM、75μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM和1μM SN3-L6对AC16细胞生长没有明显影响，IC50大于100μM。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用，其特征在于：所述的一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6为左旋一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6，其结构式如式I所示：
Figure FDA0002131543140000011
2.根据权利要求1所述的萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用，其特征在于：
所述的抗白血病为急性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病，粒细胞白血病，粒－单核细胞白血病，单核细胞白血病，慢性嗜中性粒细胞白血病或红白血病。
3.根据权利要求2所述的萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用，其特征在于：
所述的粒细胞白血病为慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病或亚急性粒细胞白血病；
所述的粒－单核细胞白血病为慢性粒－单核细胞白血病或急性粒－单核细胞白血病；
所述的单核细胞白血病为慢性单核细胞白血病或急性单核细胞白血病。
4.根据权利要求3所述的萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用，其特征在于：
所述的急性粒细胞白血病为颗粒增多的早幼粒细胞白血病，未分化型或部分分化型急性粒细胞白血病。
5.根据权利要求1～4任一项所述的萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用，其特征在于：
所述的一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6的有效浓度为0.5～30μM。
6.一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐在制备抑制白血病细胞增殖的药物，诱导白血病细胞转分化为巨核细胞的药物，诱导巨核细胞产生血小板的药物，诱导巨核细胞凋亡的药物，诱导白血病细胞多倍体化的药物，和/或增强抑癌蛋白P53的表达的药物中的应用；其特征在于：所述的一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6为左旋一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6，其结构式如权利要求1所示。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的一叶萩碱链连二聚化合物SN3-L6的浓度为0.5～30μM。
8.根据权利要求1～5任一项所述的萩碱链连二聚化合物SN3-L6或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用或权利要求6～7任一项所述的应用，其特征在于：
所述的药物还含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、吸收剂、表面活性剂或润滑剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的药物进一步制成注射剂、片剂、丸剂、颗粒剂或胶囊。
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