CN112237188B - 一类井冈类酯化物在制备蝗虫海藻糖酶抑制剂中的应用 - Google Patents

一类井冈类酯化物在制备蝗虫海藻糖酶抑制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了井冈类酯化物在制备蝗虫海藻糖酶抑制剂中的应用，所述井冈类酯化物的结构如下所示。本发明提供的井冈类酯化物具有改善的脂溶性和良好的抑制效果。

Description

一类井冈类酯化物在制备蝗虫海藻糖酶抑制剂中的应用
技术领域
本发明涉及一类井冈类酯化物在制备蝗虫海藻糖酶抑制剂中的应用。
技术背景
蝗虫是蝗科，直翅目昆虫。俗称"蚱蜢"，种类繁多，全世界有超过10,000 种，分布于全世界的热带、温带的草地和沙漠地区。蝗虫具咀嚼式口器，为植食性昆虫。主要危害禾本科植物，是农业害虫，给粮食安全造成巨大威胁，是农业发展道路上的一大挑战。目前国内外治蝗防灾的措施包括化学防治、生态防治和生物防治。当前化学农药防治应用最为广泛，是国际上认可防治蝗害的重要措施，但同时也增强了蝗虫的抗药性。生态防治和生物防治应用较少，由于生物防治法对环境污染小而且高效，具有开发为新型防治蝗灾的潜力，近年来受到越来越多的关注。
井冈霉素(Validamycin)作为一种微生物源抗生素，是最为常用和有效的农药之一，具有长久药效，低毒性，低残留，高安全，环境污染小的优势，一直是我国农业发展过程中推广使用的无公害农药。它是一类由氨基环多醇和葡萄糖组成的弱碱性化合物，包括井冈霉素A、B、C、D、E、F、G、H8个组分，组分之间的主要区别是羟基和葡萄糖基的个数及位置的不同。各组分中，井冈霉素A是最主要的活性成分，也是含量最高的一个。在酸性条件下，1分子井冈霉素A可水解为1分子井冈羟胺A和1分子葡萄糖。井冈羟胺A(Validoxylmine A)是一种多羟基的假二糖化合物,其结构是由两个氨基环多醇组成(如下式)，易溶于水、甲醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等强极性溶剂，微溶于乙醇，不溶于乙酸乙酯、氯仿与丙酮等溶剂，表现出水溶性强、脂溶性较差的特性。
井冈羟胺A与海藻糖结构极为相似，海藻糖是生物体内的储备糖，已知存在于所有种类的昆虫组织和器官中，是昆虫血淋巴中主要的糖类(大约占80％～ 90％)和能量物质，有着“生命之糖”的美誉。海藻糖酶是葡萄糖苷酶的一种，在葡萄糖的转运和能量贮存方面具有重要作用，海藻糖酶可以特异性地将一分子海藻糖水解为两分子葡萄糖而被昆虫利用，在昆虫的能量代谢上扮演着重要角色。鉴于海藻糖酶在生物有机体能量代谢过程中的重要作用，近年来，许多生物化学家致力于研发基于海藻糖酶抑制剂的新型农药，试图通过阻断有机体内海藻糖的水解，来达到杀虫目的。井冈羟胺A的存在，可作为具有高活性的天然海藻糖酶竞争性抑制剂有效抑制海藻糖的分解，阻断生命体能量供应。但是由于井冈羟胺A具有多羟基的结构特点，水溶性较好，很难透过机体有机层到生物体内发挥药效，所以对离体的海藻糖酶抑制效果好，对活体内的海藻糖酶抑制效果不佳。
Figure BDA0002673455980000021
研究表明，井冈霉素A和井冈羟胺A对于蝗虫海藻糖酶的抑制效果较好。本发明试图对井冈羟胺A进行结构修饰以获得对于蝗虫海藻糖酶具有良好抑制效果的井冈羟胺A衍生物。
因此，提供一个工艺简单、分离周期短、对环境污染小、效果显著的一类蝗虫海藻糖酶抑制剂的制备方法，是本发明需要探索的目标。
发明内容
本发明的目的是提供一类井冈类酯化物在制备蝗虫海藻糖酶抑制剂中的应用，该类井冈类酯化物具有改善的脂溶性和良好的抑制效果。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了井冈类酯化物在制备蝗虫海藻糖酶抑制剂中的应用，所述井冈类酯化物的结构如下所示：
Figure BDA0002673455980000031
其中，R8为CnH2n+1CO-，n＝4-14；R1-R7为H。
作为优选，n＝6,7或11。最优选n＝6。
本发明提供了一种所述井冈类酯化物的制备方法，具体如下：井冈羟胺A 在叔丁醇中于90-110℃回流4-6h制得井冈羟胺A饱和溶液，然后加入固定化酶 Novozym 435和酸RCOOH在反应容器中充分反应，得到井冈类酯化物。
本发明中合成井冈羟胺A的酯化物的反应过程采用薄板层析(展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为碘蒸气与茚三酮溶液)进行监控并确定反应终点，如制备一酯(即R8＝CnH2n+1CO-，R1-R7＝H的化合物)时，产生除一酯外的化合物时即停止反应。
本发明中，所述RCOOH与井冈羟胺A的投料摩尔比为2-4:1，最优选3:1。
本发明中，所述Novozym 435酶加量以井冈羟胺A的摩尔数计为 100-150g/mol，优选120g/mol。
本发明中，反应温度为40-60℃，优选为50℃。
本发明中，反应时间为30-50h，优选为40h。
本发明特别优选：所述RCOOH与井冈羟胺A的投料摩尔比为3:1；所述 Novozym 435酶加量以井冈羟胺A的摩尔数计为120g/mol，反应温度为50℃，反应时间为40h。
作为优选，所述反应体系中还加入分子筛，其作用是除去酯化反应过程中生成的水，促使酯化反应向正方向进行，提高转化率。分子筛用之前需活化，置于400℃马弗炉中加热2-4h，冷却置于干燥器中备用。分子筛的加入量为 10～50g/L。
作为优选，为使反应更为彻底，在反应进行24h时补加井冈羟胺A粉末，补加的井冈羟胺A粉末与反应开始时加入的井冈羟胺A等量。
本发明在反应结束后，所得反应液中可能同时存在一酯和二酯，通过分离纯化可得到一酯或二酯纯品。作为优选，所述的分离纯化步骤为：反应结束，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，然后正丁醇萃取，浓缩有机相，最后经硅胶柱分离得到井冈类酯化物，其中洗脱液为正丙醇和乙酸的混合液。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
本发明特别优选所述井冈类酯化物的制备方法按照如下步骤实施：在井冈羟胺A饱和溶液中，加入酸RCOOH、Novozym 435、分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24h投加井冈羟胺A粉末，补加的井冈羟胺A粉末与反应开始时加入的井冈羟胺A等量，反应进行40h；反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离得到井冈类酯化物，洗脱液为正丙醇和乙酸的混合溶液；
其中，所述RCOOH与反应开始时加入的井冈羟胺A的投料摩尔比为3:1；所述Novozym 435酶加量以井冈羟胺A的摩尔数计为120g/mol，分子筛的加入量为10～50g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了一系列新型井冈类酯化物，改善了底物井冈羟胺A的脂溶性，丰富了井冈类化合物库，该类酯化物对于蝗虫海藻糖酶具有良好的抑制效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明实施例使用的井冈羟胺A饱和溶液通过如下方法制备：
90℃油浴锅中，井冈羟胺A(5g)在叔丁醇(300mL)中回流搅拌5h制得井冈羟胺A饱和溶液。
作为对比，90℃油浴锅中，井冈羟胺A(5g)在叔丁醇(300mL)中不回流条件下搅拌30h制得井冈羟胺A饱和溶液。
两种溶液的溶解度如表1所示：
表1
Figure BDA0002673455980000051
实施例1：丁酸井冈羟胺A酯的制备(化合物a，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(132mg) 丁酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24h 投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝4:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ4.73(d,J＝13.9Hz,2H),4.56(s,1H),4.41(dd, J＝9.5,5.8Hz,1H),4.31(s,1H),3.77(t,J＝8.4Hz,1H),3.53(dd,J＝10.4,3.8Hz, 1H),3.49–3.41(m,1H),3.41–3.23(m,6H),3.09(t,J＝8.7Hz,1H),2.13(dt,J＝ 11.2,6.9Hz,1H),1.89(s,5H),1.87–1.80(m,1H),1.53(ddd,J＝14.9,11.7,5.8Hz, 1H).
ESI-MS(406.2067[M+H]+,428.1890[M+Na]+.
实施例2：戊酸井冈羟胺A酯的制备(化合物b，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(153mg) 戊酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24h 投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝5:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.76(s,1H),5.44(s,1H),4.65(s,5H),4.17(dd, J＝10.6,2.8Hz,1H),4.09–3.86(m,3H),3.70(d,J＝4.7Hz,1H),2.28(t,J＝7.3 Hz,2H),2.03–1.93(m,1H),1.77(d,J＝14.1Hz,1H),1.51(dt,J＝15.0,7.4Hz, 2H),1.38–1.03(m,4H),0.86(t,J＝7.3Hz,3H).
ESI-MS(420.2227[M+H]+,442.2040[M+Na]+.
实施例3：己酸井冈羟胺A酯的制备(化合物c，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(174mg) 己酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24h 投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝5:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.81(s,1H),4.68(d,J＝13.1Hz,1H),4.35(d,J ＝13.2Hz,1H),3.96(d,J＝17.8Hz,1H),3.69(dd,J＝11.3,5.7Hz,2H),3.49(d,J＝ 3.8Hz,1H),3.46–3.17(m,6H),2.31(dt,J＝22.2,7.3Hz,1H),2.15(t,J＝7.4Hz, 1H),1.74(dd,J＝14.1,3.2Hz,1H),1.56–1.36(m,2H),1.36–1.03(m,6H),0.89(t, J＝6.9Hz,3H).
ESI-MS(434.2381[M+H]+,456.2189[M+Na]+.
实施例4：庚酸井冈羟胺A酯的制备(化合物d，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(195mg) 庚酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24h 投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝6:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.79(s,1H),4.62(d,J＝13.3Hz,1H),4.33(d,J ＝13.4Hz,1H),3.94(d,J＝17.4Hz,1H),3.71(dd,J＝11.6,5.7Hz,1H),3.45(d,J＝ 3.8Hz,1H),3.43–3.17(m,6H),3.11–3.01(m,1H),2.31(dt,J＝22.2,7.3Hz,1H), 2.18(t,J＝7.4Hz,1H),1.71(dd,J＝14.1,3.2Hz,1H),1.56–1.38(m,2H),1.36– 1.03(m,8H),0.91(t,J＝7.0Hz,3H).
ESI-MS(448.2532[M+H]+,470.2341[M+Na]+.
实施例5：辛酸井冈羟胺A酯的制备(化合物e，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(216mg) 辛酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24h 投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝6:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.81(dd,J＝37.9,3.1Hz,1H),4.65(d,J＝13.2 Hz,1H),4.31(d,J＝13.4Hz,1H),3.94(d,J＝17.5Hz,1H),3.71(dd,J＝11.3,5.9 Hz,1H),3.45(d,J＝3.7Hz,1H),3.40–3.17(m,6H),3.11–3.01(m,1H),2.30(dt, J＝22.3,7.3Hz,1H),2.18(t,J＝7.1Hz,1H),1.74(dd,J＝14.4,3.2Hz,1H),1.56– 1.40(m,2H),1.36–1.01(m,10H),0.91(t,J＝6.8Hz,3H).
ESI-MS(462.2686[M+H]+,484.2492[M+Na]+.
实施例6：壬酸井冈羟胺A酯的制备(化合物f，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(237mg) 壬酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24h 投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝7:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.79(dd,J＝37.3,3.0Hz,1H),4.66(d,J＝13.1 Hz,1H),4.45(d,J＝13.2Hz,1H),3.97(d,J＝17.8Hz,1H),3.71(dd,J＝11.3,5.7 Hz,1H),3.48(d,J＝3.8Hz,1H),3.45–3.18(m,6H),3.13–3.04(m,1H),2.29(dt, J＝22.2,7.3Hz,1H),2.17(t,J＝7.4Hz,1H),1.76(dd,J＝14.1,3.2Hz,1H),1.58– 1.40(m,2H),1.24(s,10H),1.16–1.00(m,2H),0.86(t,J＝6.9Hz,3H).
ESI-MS(476.2856[M+H]+,498.2616[M+Na]+.
实施例7：癸酸井冈羟胺A酯的制备(化合物g，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(258mg) 癸酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24h 投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝7:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.86(dd,J＝37.6,3.5Hz,1H),4.62(d,J＝13.0 Hz,1H),4.48(d,J＝13.2Hz,1H),3.92(d,J＝18.1Hz,1H),3.65(dd,J＝11.0,5.7Hz, 1H),3.43(d,J＝3.6Hz,1H),3.40–3.13(m,6H),3.11–3.04(m,1H),2.29(dt,J＝ 22.2,7.1Hz,1H),2.17(t,J＝7.7Hz,1H),1.81(dd,J＝14.5,3.6Hz,1H),1.58– 1.42(m,2H),1.24(s,12H),1.16–0.98(m,2H),0.86(t,J＝6.5Hz,3H).
ESI-MS(490.3008[M+H]+,498.2616[M+Na]+.
实施例8：十一酸井冈羟胺A酯的制备(化合物h，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(279mg) 十一酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应， 24h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝8:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.92(dd,J＝37.8,3.7Hz,1H),4.71(d,J＝13.5 Hz,1H),4.48(d,J＝13.7Hz,1H),3.98(d,J＝17.2Hz,1H),3.71(dd,J＝11.8,5.4Hz, 1H),3.46(d,J＝3.4Hz,1H),3.42–3.18(m,6H),3.13–3.06(m,1H),2.30(dt,J＝22.2,7.2Hz,1H),2.21(t,J＝7.4Hz,1H),1.85(dd,J＝14.0,3.2Hz,1H),1.56–1.42 (m,2H),1.20(s,14H),1.16–0.98(m,2H),0.86(t,J＝6.3Hz,3H).
ESI-MS(504.3161[M+H]+,498.2616[M+Na]+.
实施例9：十二酸井冈羟胺A酯的制备(化合物i，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(300mg) 十二酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应， 24h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝9:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.95(dd,J＝36.5,4.1Hz,1H),4.77(d,J＝12.8 Hz,1H),4.50(d,J＝12.8Hz,1H),3.41(d,J＝17.8Hz,1H),3.768(dd,J＝11.3,5.7 Hz,1H),3.43(d,J＝3.8Hz,1H),3.40–3.18(m,6H),3.13–3.06(m,1H),2.32(dt,J ＝22.2,7.3Hz,1H),2.25(t,J＝7.4Hz,1H),1.86(dd,J＝14.1,3.2Hz,1H),1.56– 1.42(m,2H),1.23(s,12H),1.16–0.92(m,4H),0.81(t,J＝6.8Hz,3H).
ESI-MS(518.3310[M+H]+,498.2616[M+Na]+.
实施例10：十三酸井冈羟胺A酯的制备(化合物j，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(321.3mg) 十三酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应， 24h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝10:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ5.75(d,J＝2.6Hz,1H),4.65(d,J＝13.3Hz, 1H),4.46(d,J＝13.3Hz,1H),4.14(dd,J＝10.7,3.2Hz,1H),3.98(dd,J＝15.0,7.0 Hz,3H),3.73(d,J＝5.6Hz,2H),3.44(s,1H),3.41(d,J＝4.0Hz,1H),3.39(s,1H), 3.37(s,1H),3.31(dd,J＝9.3,4.2Hz,2H),3.19(s,1H),3.12(q,J＝3.5Hz,1H), 3.06–2.97(m,2H),2.25(t,J＝7.4Hz,2H),1.90(s,3H),1.78(d,J＝14.3Hz,1H), 1.49(d,J＝7.0Hz,3H),1.22(s,18H),0.83(d,J＝7.1Hz,3H).
ESI-MS(532.3484[M+H]+,554.3303[M+Na]+.
实施例11：十四酸井冈羟胺A酯的制备(化合物k，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(343mg) 十四酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应， 24h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝10:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.93(dd,J＝37.3,3.0Hz,1H),4.70(d,J＝13.1 Hz,1H),4.50(d,J＝13.2Hz,1H),3.94(d,J＝17.4Hz,1H),3.72(dd,J＝11.3,5.7Hz, 1H),3.48(d,J＝4.2Hz,1H),3.44–3.17(m,6H),3.13–3.02(m,1H),2.31(dt,J＝ 22.2,7.3Hz,1H),2.24(t,J＝7.4Hz,1H),1.87(dd,J＝14.1,3.2Hz,1H),1.65–1.40 (m,2H),1.18(s,12H),1.15–0.81(m,6H),0.74(t,J＝6.4Hz,3H).
ESI-MS(546.3624[M+H]+,498.2616[M+Na]+.
实施例12：十五烷酸井冈羟胺A酯的制备(化合物l，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(363.6mg) 十五烷酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝10:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.76(s,1H),4.65(s,1H),4.58(s,1H),4.46(d,J ＝13.3Hz,2H),4.29–3.88(m,5H),3.71(s,1H),3.38(d,J＝50.7Hz,3H),3.27(d, J＝13.5Hz,2H),3.16(s,1H),3.08(d,J＝13.1Hz,2H),2.99(s,1H),2.51(s,1H), 2.27(s,2H),1.78(s,1H),1.51(d,J＝6.7Hz,3H),1.38–1.19(m,23H),0.86(s, 3H).
HRMS(ESI):560.3776[M+H]+.
实施例13：软脂酸井冈羟胺A酯的制备(化合物m，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(384.63mg) 软脂酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24 h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝12:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.76(s,1H),4.65(s,1H),4.44(s,1H),4.16(d,J ＝10.5Hz,2H),3.98(s,1H),3.71(d,J＝6.1Hz,4H),3.52–3.35(m,4H),3.26(d,J ＝9.4Hz,2H),3.05(dd,J＝28.6,24.9Hz,4H),2.51(s,1H),2.27(s,2H),1.99(s, 1H),1.60(d,J＝86.5Hz,3H),1.32–1.19(m,25H),0.86(s,3H).
HRMS(ESI):574.3933[M+H]+.
实施例14：十七酸井冈羟胺A酯的制备(化合物n，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(405.45mg) 十七酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24 h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝12:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ5.76(d,J＝2.5Hz,1H),4.66(d,J＝13.1Hz, 1H),4.46(d,J＝13.2Hz,1H),4.16(dd,J＝10.6,3.1Hz,1H),4.01(d,J＝4.2Hz, 1H),3.99(d,J＝4.0Hz,2H),3.97(d,J＝6.3Hz,1H),3.93(s,1H),3.73(s,1H),3.72 (s,1H),3.71(s,1H),3.42(s,1H),3.41–3.37(m,2H),3.35(s,1H),3.34(t,J＝4.4 Hz,1H),3.28(d,J＝4.1Hz,1H),3.26(d,J＝4.3Hz,1H),3.09(d,J＝5.3Hz,1H), 2.99(s,1H),2.27(d,J＝7.4Hz,3H),2.00–1.95(m,1H),1.75(s,1H),1.51(s,2H), 1.24(s,26H),0.86(d,J＝6.5Hz,3H).
HRMS(ESI):588.4077[M+H]+,610.3891[M+Na]+.
实施例15：硬脂酸井冈羟胺A酯的制备(化合物o，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(426.72mg) 硬脂酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24 h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝15:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.76(s,1H),4.65(s,1H),4.47(s,1H),4.16(d,J ＝10.1Hz,2H),3.98(s,1H),3.71(d,J＝5.7Hz,4H),3.62–3.22(m,6H),3.17(s, 1H),3.11–2.92(m,3H),2.51(s,1H),2.27(s,2H),1.99(s,1H),1.61(d,J＝93.3Hz, 3H),1.28(d,J＝46.4Hz,29H),0.86(s,3H).
HRMS(ESI):602.4242[M+H]+,624.4066[M+Na]+.
实施例16：十九酸井冈羟胺A酯的制备(化合物p，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(447.75mg) 十九酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24 h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝15:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ10.50(s,1H),9.10(dd,J＝201.8,50.8Hz,5H), 8.73(d,J＝15.3Hz,4H),8.66(s,1H),8.46(s,2H),8.41(s,1H),8.10(d,J＝16.7Hz, 2H),7.99(s,1H),7.85(d,J＝37.9Hz,2H),7.71(s,1H),7.25(s,1H),7.00(s,2H), 6.72(s,1H),6.34(d,J＝90.9Hz,3H),6.03(d,J＝53.2Hz,31H),5.59(s,3H).
HRMS(ESI):616.4438[M+H]+.
实施例17：二十酸井冈羟胺A酯的制备(化合物q，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(468.45mg) 二十酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24 h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝15:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(500MHz,Methanol)δ5.95(s,1H),4.81(d,J＝13.3Hz,1H),4.66(d, J＝13.2Hz,1H),4.25(s,2H),4.22(s,3H),4.01(s,1H),3.83(s,1H),3.71(s,1H), 3.67(s,1H),3.53(s,4H),3.50(s,3H),3.37(s,1H),3.33(s,1H),2.36(t,J＝7.2Hz, 3H),2.10(s,1H),1.58(s,1H),1.55(s,2H),1.30(s,32H),0.92(s,3H).
HRMS(ESI):630.4559[M+H]+,652.4376[M+Na]+.
实施例18：二十二酸井冈羟胺A酯的制备(化合物r，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(510.87mg) 二十二酸、60mg Novozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应， 24h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝16:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ5.75(s,1H),4.64(s,1H),4.43(s,1H),4.32– 3.86(m,3H),3.66(d,J＝51.8Hz,4H),3.48(d,J＝10.0Hz,3H),3.42–3.31(m, 3H),3.24(s,1H),3.16–2.55(m,3H),2.50(s,1H),2.26(s,2H),1.98(s,1H),1.77(s, 2H),1.51(s,1H),1.49–0.91(m,37H),0.83(s,3H).
HRMS(ESI):658.4898[M+H]+,680.4724[M+Na]+.
实施例19：油酸井冈羟胺A酯的制备(化合物s，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(423.705mg) 油酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24h 投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝15:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ13.21(s,1H),10.50(s,1H),10.07(s,1H),9.40 (d,J＝13.0Hz,2H),9.21(s,2H),8.89(s,1H),8.70(d,J＝24.6Hz,4H),8.31(d,J＝ 151.5Hz,3H),8.02(s,1H),7.90(s,1H),7.82(d,J＝12.1Hz,2H),7.74(t,J＝12.3 Hz,3H),7.48(s,1H),7.25(s,2H),7.01(s,4H),6.72(d,J＝5.4Hz,1H),6.57–6.39 (m,4H),6.25(s,6H),5.99(s,14H),5.60(s,3H).
HRMS(ESI):600.4121[M+H]+.
实施例20：亚油酸井冈羟胺A酯的制备(化合物t，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(420.66mg) 亚油酸、60mgNovozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应，24 h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝18:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ10.50(s,1H),10.06(s,1H),9.39(s,1H),9.24– 8.83(m,4H),8.73(d,J＝28.2Hz,3H),8.47(s,1H),8.22(s,3H),8.08(t,J＝6.5Hz, 4H),8.01(d,J＝10.3Hz,2H),7.89(s,1H),7.81(s,1H),7.74(d,J＝8.9Hz,2H), 7.47(s,2H),7.25(s,1H),7.01(s,2H),6.73(s,4H),6.15(s,1H),6.02(d,J＝21.3Hz, 3H),5.59(dd,J＝11.2,6.9Hz,15H),5.45(s,3H).
HRMS(ESI):598.3945[M+H]+,620.3764[M+Na]+.
实施例21：亚麻酸井冈羟胺A酯的制备(化合物u，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(417.645mg) α-亚麻酸、60mg Novozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应， 24h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝18:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ10.51(s,1H),10.06(s,1H),9.39(s,1H),9.27– 8.50(m,8H),8.47(s,1H),8.23(d,J＝9.8Hz,4H),8.10(d,J＝21.5Hz,3H),8.02(s, 1H),7.94(d,J＝51.9Hz,3H),7.86–7.68(m,2H),7.62(s,1H),7.51(s,4H),7.25(s, 1H),7.01(s,2H),6.76(s,2H),6.48(s,3H),6.21(d,J＝44.2Hz,3H),6.08–5.76(m, 9H),5.67(s,3H).
HRMS(ESI):596.3790[M+H]+,618.3608[M+Na]+.
实施例22：蓖麻油酸井冈羟胺A酯的制备(化合物v，一酯)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(447.45mg) 蓖麻油酸、60mg Novozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应， 24h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝15:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ10.53(d,J＝29.7Hz,1H),10.13(s,2H),9.41 (d,J＝13.0Hz,1H),9.20(s,1H),9.14(d,J＝7.3Hz,1H),8.99(s,1H),8.74(s,1H), 8.56(s,1H),8.42(s,2H),8.34(s,1H),8.31(s,1H),8.26(s,1H),8.22(s,1H),8.16 (d,J＝13.7Hz,5H),8.08(s,3H),7.81(s,1H),7.74(s,1H),7.25(s,4H),7.12(s,1H), 7.01(s,1H),6.86(s,1H),6.82(s,1H),6.72(s,2H),6.48(s,1H),6.25(s,1H),5.99(s, 17H),5.60(s,3H).
HRMS(ESI):616.4045[M+H]+,638.3868[M+Na]+.
实施例23：10-十一烯酸井冈羟胺A酯的制备(化合物w)：
在21mL(0.5mmol井冈羟胺A)饱和溶液中，加入1.5mmol(276.15mg) 10-十一烯酸、60mg Novozym 435、0.6g4A°分子筛，在50℃恒温振荡器中反应， 24h投加0.5mmol井冈羟胺A粉末，反应进行40h。反应结束后，将反应液离心除去固定化酶及分子筛，蒸发浓缩，正丁醇萃取，浓缩有机相，硅胶柱分离，洗脱液为正丙醇：乙酸＝10:1。TLC检测洗脱液，展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为茚三酮溶液与碘蒸气。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ5.80(d,J＝10.2Hz,1H),5.74(s,1H),4.99(dd, J＝17.2,2.2Hz,1H),4.95–4.90(m,1H),4.66(d,J＝13.1Hz,1H),4.45(d,J＝13.2 Hz,1H),4.15(dd,J＝10.6,3.1Hz,1H),4.01–3.91(m,3H),3.70(d,J＝6.1Hz,2H), 3.50–3.49(m,1H),3.47(s,2H),3.37(s,4H),3.32(s,1H),3.27(s,2H),3.06(d,J＝ 3.6Hz,1H),2.98(s,1H),2.28(dt,J＝19.0,7.4Hz,2H),2.00(q,J＝7.1Hz,2H), 1.76(d,J＝14.2Hz,1H),1.67(s,2H),1.51(t,J＝7.1Hz,2H),1.33(t,J＝7.1Hz, 2H),1.24(s,8H).
HRMS(ESI):502.3005[M+H]+.
实施例24：蝗虫海藻糖酶的提取
(1)蝗虫预处理：选取东亚飞蝗，于-20℃的冰箱中冷冻“麻醉”，去除蝗虫的头部、尾部及翅膀，留下蝗虫的胸部；
(2)粗酶液的提取：称取冰冻的20g蝗虫，经液氮多次研磨直至成粉末。按照4倍体积加入200mL冰的Na2HPO4-NaH2PO4(0.2M，pH6.0)缓冲液，搅拌均匀，而后9000rpm，4℃冷冻离心30min，去除沉淀。所得上清即为蝗虫海藻糖酶粗酶液，置于-20℃保存备用；
(3)硫酸铵分级沉淀：在粗酶液中缓慢加入一定量的硫酸铵达到30％的饱和度，冰浴条件下搅拌30min，置于4℃冰箱静置1h，8000rpm离心20min后去除沉淀，收集上清液。
(4)在步骤(3)得到的上清液中加入硫酸铵达到60％的饱和度，步骤同(3)，最终收集沉淀。将沉淀溶于少量Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.2M，pH6.0)，用相同的缓冲液作为透析液在4℃下透析，透析完全后置于-20℃冰箱保存备用。
实施例25：蝗虫海藻糖酶酶活测定方法
(1)葡萄糖测定：因为海藻糖酶可以特异性地将一分子海藻糖水解为两分子葡萄糖，所以通过测定葡萄糖的生成量来判断海藻糖酶水解海藻糖的程度，计算海藻糖酶的酶活力，葡萄糖含量经HPLC法检测；
(2)HPLC检测条件：检测器选择蒸发光散射检测器(ELSD)，选用了
Figure BDA0002673455980000191
Sugar-Ca色谱柱(300mm×7.8mm，5μm，Welch)，流动相为超纯水，流速设定为0.5mL/min，柱温箱设置为70℃，漂移管温度设置为80℃，氮气流速设置为1.6mL/min；
(3)蝗虫海藻糖酶活力测定：反应体系总体积为0.8mL，其中包含0.5mL 酶液，海藻糖终浓度为12g/L，0.3mLNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.2M，pH6.0)，在金属振荡器中60℃恒温条件下反应10min，同时以不加底物海藻糖作为空白对照，取出后立即在沸水浴中煮沸10min终止反应，反应产物于10000rpm离心 5min，取上清液经HPLC检测葡萄糖含量。
海藻糖酶活力定义为在60℃，pH6.0的条件下，每10min水解海藻糖生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位。
实施例26：井冈类酯化物对蝗虫海藻糖酶抑制作用研究
(1)反应体系总体积为0.8mL，其中包含0.5mL酶液，海藻糖终浓度为 12g/L，0.28mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.2M，pH6.0)，0.02mL无水甲醇溶解的不同浓度的井冈羟胺A酯化物，按上述实施例25的方法测定抑制酶活力。井冈羟胺A酯化物的浓度选择以井冈霉素A和井冈羟胺A对蝗虫海藻糖酶的抑制浓度为参考；
(2)计算海藻糖酶残余的酶活力。抑制百分比＝(酶活力一剩余酶活力)/ 酶活力。
实施例27：井冈类酯化物对蝗虫海藻糖酶的半抑制浓度
井冈类酯化物对蝗虫海藻糖酶的半抑制浓度药物IC50值的计算：将酶活抑制率看成(y)，将井冈类酯物浓度值换算为浓度对数值(x)，按最小二乘法求出药物对蝗虫海藻糖酶抑制的回归方程决定系数R，根据回归方程分别计算井冈类酯化物对蝗虫海藻糖酶的半抑制浓度药物IC50值。
表1不同药物对蝗虫海藻糖酶的IC50值
Figure BDA0002673455980000201
Figure BDA0002673455980000211
结果显示：d的IC50为0.1278μM，接近于VAA的IC50值，说明d对蝗虫海藻糖酶的抑制效果较明显。VMA对蝗虫海藻糖酶抑制的IC50值为0.1991μM， e的IC50值为0.1817μM，i的IC50值为0.1732μM，d、e、i这三种化合物的IC50值均低于VMA，VMA的IC50分别为d、e、i的1.56、1.10和1.15倍。
实施例28蝗虫触杀研究
触杀作用采用微量点滴法进行。将VMA、VAA、化合物d、e、i分别配置成10，100，250，500，1000mg/L5个浓度梯度，用1μL微量点滴器点滴药液于东亚飞蝗3龄幼虫的前胸背板，每个浓度处理30头，以丙酮作为空白对照。用正常商陆叶饲养48h后检查死亡数，统计死亡率。
表2
Figure BDA0002673455980000212
结果表明，该类化合物具有一定的蝗虫杀灭效果，经进一步开发，有望成为绿色、新型杀蝗虫药物。

Claims (2)

1.井冈类酯化物在制备蝗虫海藻糖酶抑制剂中的应用，所述井冈类酯化物的结构如下所示：
Figure FDA0003342440660000011
其中，R8为CnH2n+1CO-，n＝6,7或11；R1-R7为H。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：n＝6。
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