CN112229887A - 一种可精准编辑酶/电极界面及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可精准编辑酶/电极界面以及采用该界面的酶电极,在本发明中通过精准编辑,设计出一款全新的自组装蛋白复合体,改变原来的单点锚定技术为多点锚定技术,可在改善酶/电极电子传递效率的同时有效的解决酶基电化学体系普遍存在的稳定性问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感技术领域,具体涉及一种应用于生物传感器的多点锚定可精准编辑酶/电极界面及其制备方法。
背景技术
电化学生物传感器是以电化学传感器为基础电极与生物活性材料组成的生物传感器,主要包括酶电极、微生物电极、免疫电极、组织电极、细胞器电极和DNA电极。其中,酶电极的发展在生物传感器领域最具代表性的电极。酶电极传感器由固定化酶和基础电极组成,酶电极生物传感器可以应用于血糖、乳酸、尿素等多方面检测,是当前研究最广泛的生物电极材料,应用前景广泛。
如何实现酶与电极之间的电子传递效率依然是酶电化学还原的瓶颈问题之一。尽管有研究表面通过纳米材料的使用实现电极表面与酶活中心的桥联可实现直接电子传递(简称DET),但是这种利用纳米材料尺寸效应去改善电极与蛋白酶活中心接触的方式仍然具有很强的随机性,不可控性。其主要原因是通常只有酶的活性中心(或氧化还原辅助因子)距离电极表面约1.4nm以内时,才会有有效的电子隧穿效应,产生DET。因此大量负载在纳米材料修饰电极上的酶,只有有限数量的可实现DET。使用自由扩散氧化还原电子介体作为另外一种更常用的介导电子传递(简称MET)的方式,虽然可显著消除随机性,提高电子传递效率,但是电子介体的使用既会增加体系构建的成本与复杂性,也不利于催化产物的收集分离,限制了其实际应用。
经过数十年的研究,人们对原核生物核糖体的翻译机制已有较全面的理解,多种核糖体不同功能状态的晶体和电镜结构已得到解析,大多数氨酰tRNA合成酶的结构也已获得。基于这些分子生物学和结构生物学的工作基础,美国Scripps研究所的Peter Schultz等人发展的遗传密码扩展的技术-利用琥珀终止密码子可以编码多种非天然氨基酸并在生物活体内将非天然氨基酸定点插入。到目前为止,这一技术已经将超过100种的非天然氨基酸成功地定点表达在活体细胞的蛋白质当中,并赋予了这些蛋白质各种新颖的物理、化学和生理性质,并为酶的改造、优化及在电极上的位点特异共价连接提供了崭新的手段。发明人在早期的研究当中,利用采用这种基因密码子扩展的非天然氨基酸插入技术,通过定点偶联的方式可以提高酶与电极之间的电子传递效率。
基于酶催化的电化学还原体系的另一瓶颈问题是酶电极的稳定性,影响该系统稳定性的因素主要有两点,其一是酶蛋白自身的稳定性,其二是酶/电极界面的结构稳定性。发明人前期研究发现采用的定点偶联的方法虽然能显著提高蛋白与电极直接的电子传递传递效率,但是所采用的定点偶联手段都是基于单点锚定,这种连接方式通常存在界面稳定性的缺陷,尤其在液相环境下,蛋白与电极界面存在动态变化,如图1所示。单点锚定酶电极体系的界面不稳定性。蛋白与电极在界面的排列角度变化以及受分子链柔性影响的动态变化,都会导致酶活中心与电极间电子传递距离的变化,影响界面电子传递效率。根据Marcus方程,当电子传递距离大于14 埃时,每增加一个原子的距离会导致电子传递效率下降一个数量级,而在酶偶联体系当中,受蛋白本身大小的影响以及连接分子长度的影响,酶活中心与电极距离通常已接近14埃这个临界值,这种单点锚定的不稳定性导致的动态变化将对电子传递效率带来数量级差别的明显影响。
因此,如何实现酶与电极之间的电子传递效率的同时维持酶电极的稳定性是行业研究的难点,是获得高效的电化学酶催化还原系统的关键。
技术方案
发明所要解决的技术问题是提供一种采用多点锚定的技术获得的可精准编辑的蛋白固定酶电极,相对于现有酶电极,其具有电子传递效率高,酶/电极界面稳定的特点。
基于此,本发明提供一种可精准编辑酶/电极界面,酶和电极界面采用多点锚定的方式连接,所述酶为多聚体自组装蛋白复合体。
其中,所述多聚体自组装蛋白复合体为笼形蛋白、连接短肽、还原酶三者融合形成融合蛋白。
其中,所述酶和电极界面之间采用连接分子实现锚定连接。
其中,所述连接分子一端具有能够与电极表面通过共价键或非共价相互作用锚定,分子另一端与目标蛋白中引入的锚定位点分子进行特异性自发反应。
其中,所述目标蛋白为还原酶、氧化酶、脱氢酶、水解酶。
所述多聚体自组装蛋白复合体与电极界面采用连接分子连接,所述连接分子
本发明还提供上述可精准编辑酶/电极界面的制备方法,其包括:
第一步,多点偶联自组装蛋白复合体的制备;
第二步,可精准编辑酶/电极界面的形成。
本发明还提供一种酶电极,其包括上面的酶电极界面层和基础电极。
该酶电极所采用的基础电极为碳基电极,具体优选为玻碳电极、HOPG 电极或石墨烯电极,电极由碳基纳米材料修饰,碳基纳米材料,可以为石墨烯纳米片、石墨纳米片、氧化石墨烯纳米片、氧化石墨纳米片、大面积石墨烯片材、碳纳米管(CNT)及其组合。
本发明还提供一种生物传感器,其包括上述酶电极作为工作电极、参比电极和对电极。
有益的效果
本发明将基于基因密码子扩展的酶/电极定点偶联技术与笼形蛋白辅助酶可控组装的技术相结合,通过笼形蛋白辅助组装的技术可以开创性的解决现存定点偶联方法普遍存在的单点锚定稳定性差的问题,利用辅助组装蛋白可自发形成三聚体的特性,可实现蛋白复合体在电极界面三点支撑连接的稳定体系,最终解决酶电极催化活性稳定性及界面稳定性差两大瓶颈问题。
附图说明
图1单点偶联酶电极体系的界面不稳定性展示;
图2 iLov蛋白单体及与O3-33-iLov三聚体酶电极稳定性对比图,电流取自-0.35V恒电位下FAD氧化电流值;
图3 iLov-486-TF蛋白单点偶联电极与O3-33-iLov-486-TF三点锚定体系的界面操作稳定性对比,对比取自两组各5次平行实验所测算得的电子传递效率KET。
具体实施方式
通过理论计算设计的自组装蛋白复合体结构在生物传感,药物递送,生物催化、生物传感等领域展现出了重要应用前景,这种设计的自组装蛋白复合体结构本身具有优良的稳定性,可精确调控的尺寸形貌,更重要的是这种蛋白框架可以修饰或共组装其他功能蛋白,比如具有催化活性的酶,同时显著改善功能蛋白的稳定性和可固定性。在本发明中通过精准编辑,设计出一款全新的自组装蛋白复合体,改变原来的单点锚定技术为多点锚定技术,可在改善酶/电极电子传递效率的同时有效的解决酶基电化学体系普遍存在的稳定性问题。
具体的,本发明提供一种可精准编辑酶/电极界面,酶和电极界面采用多点锚定的方式连接。在每个还原酶结构单元与电极界面间引入高稳定性的多点锚定方式,优选三点锚定方式,实现将多点偶联体系多点锚定到电极界面层上。
所述电极界面采用碳基纳米材料,可以为石墨烯纳米片、石墨纳米片、氧化石墨烯纳米片、氧化石墨纳米片、大面积石墨烯片材、碳纳米管 (CNT)及其组合。
所述酶为多聚体自组装蛋白复合体,进一步优选为三聚体自组装蛋白复合体。
所述多聚体自组装蛋白复合体为笼形蛋白、连接短肽、还原酶三者融合形成融合蛋白,融合蛋白之间自组装形成的多聚体。
连接短肽用于连接笼型蛋白和目标蛋白,成为融合蛋白。连接短肽优选一段编码5-30个氨基酸残基的肽链,具体氨基酸残基数量由笼形蛋白和目标蛋白大小,结构,在Pymol或Rosetta中生成模拟设计,进一步通过实验验证获得。
所述笼形蛋白优选为03-33蛋白,是对来自于salmonella enterica的串联BMC结构域外壳蛋白进行理性设计突变位点而得到。
目标蛋白可以为还原酶、氧化酶、脱氢酶、水解酶等各类酶蛋白,不受任何限制。
所述多聚体自组装蛋白复合体与电极界面采用连接分子连接,所述连接分子一端具有能够与电极表面通过共价键或非共价相互作用锚定,分子另一端与目标蛋白中引入的锚定位点分子进行特异性自发反应。
本发明还提供上述多点偶联自组装蛋白复合体的制备方法:
第一步,目标蛋白的改造;
第一步,融合蛋白单体的制备;
第二步,融合蛋白的自组装。
所述第一步进一步具体包括:
第a步,所述目标蛋白中引入一个用于与电极界面连接的锚定位点,该位点可以是通过基因密码子扩展技术插入的非天然氨基酸,也可以是基因突变引入的天然氨基酸,如半胱氨酸,赖氨酸等该位点特异性的锚定位点可以位于目标蛋白中,也可以位于笼型框架蛋白中。
该初步设计的锚定位点所在蛋白及位点可以通过后续界面性能测试进行反馈优化。
所述第二步进一步具体为通过将目标蛋白基因通过酶切位点,构建到编码有笼形蛋白的质粒上,并在目标蛋白基因与笼形蛋白基因之间插入一段连接短肽,从而进行蛋白表达,获得融合蛋白单体。
所述第三步进一步具体为将多个融合蛋白单体在缓冲液中自发组装成多聚体,优选由3个融合蛋白单体组装成三聚体。
自主装所采用温度范围10度-50度,溶剂采用磷酸盐缓冲液,pH范围 4-10,优选4-8。
本发明还提供上述可精准编辑酶/电极界面的制备方法:
第一步,多点偶联自组装蛋白复合体的制备;
第二步,可精准编辑酶/电极界面的形成。
所述第二步具体为将第一步制备的多点偶联自组装蛋白复合体、连接分子通过滴涂的方式覆盖在电极的碳材料表面,通过水分自然蒸发实现目标蛋白上的连接分子与碳材料表面。
本发明还提供一种生物传感器,其包括上述酶电极作为工作电极、参比电极和对电极。
以下采用实施例和附图来详细说明本发明的实施方式,借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题,并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1基于非天然氨基酸与连接分子的位点特异性多点锚定
选择在大肠杆菌(BL21(DE3))体系中重组表达的CO2还原酶作为目标蛋白。
选择的非天然氨基酸巯基苯丙氨酸的合成采用201910844262.9实施例中提到的方法,路线如下:
2-乙酰氨基-2-(4-硝基苄基)丙二酸二乙酯(3):
向2-乙酰氨基丙二酸二乙酯(7.815g,36mmol)的EtOH溶液(60mL)中加入叔丁醇钾(4.399g,36mmol),1-(溴甲基)-4-硝基苯(6.448g,30mmol)。将反应混合物回流12小时,随后冷却至室温。过滤黄色悬浮液,用EtOH洗涤。获得化合物(3),为黄色固体(8.451g,24mmol,Y=80%)。
2-乙酰氨基-2-(4-氨基苄基)丙二酸二乙酯(4):
将化合物(3)(7.042g,20mmol),10%钯碳(0.700g),MeOH(100mL)加入到在高压釜中加盖的反应管内。随后吹扫高压釜并在4atm下加入H2。将反应混合物在室温下搅拌16小时。然后小心地释放H2并将反应混合物通过硅藻土过滤。减压蒸发溶剂后,残余物用硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯=1∶1)纯化,得到所需产物46.247g(Y=97%)。
2-乙酰氨基-2-(4-((乙氧基硫代硫代)硫代)苄基)丙二酸二乙酯(6):
将化合物(4)(1g,3.1mmol)在6N HCl(5mL)中搅拌。将反应混合物冷却至0℃,并在10分钟内逐渐加入0.5M NaNO2水溶液(256.7mg, 3.72mmol)。再搅拌10分钟后,通过加入Na2CO3将溶液的pH调节至7.0。然后将反应混合物冷却至0℃,并逐滴加入O-乙基二硫代碳酸钾水溶液 (545.0mg,3.41mmol)。在60℃下搅拌1小时后,将所得混合物用 CH2Cl2(150mL)萃取。将合并的有机相用H2O和盐水洗涤,用Na2SO4干燥。将溶液蒸发并通过硅胶色谱法(己烷/乙酸乙酯=2∶1)纯化,得到产物6 860mg(Y=65%)。
2-氨基-3-(4-巯基苯基)丙酸(7):
将化合物(6)(860mg,2.015mmol)和浓HCl(15mL)的混合物加热回流16 小时。用NaOH中和所得混合物后,形成沉淀物并过滤,得到最终产物 (7)320mg(Y=80%)。
连接分子Bodipy373的合成,采用X.L.Liu,L.Y.Niu,Y.Z.Chen,Y.Yang,Q.Z.Yang,Sens.Actuators.B2017,25 2,470-476报导的方法合成,路线如下:
化合物1:
将对甲基苯甲醛(1mmol)加入到3mL吡咯(43mmol)中,再加入三氟乙酸(0.1mmol),室温下反应15分钟。二氯甲烷萃取,NaOH稀溶液洗涤,浓缩有机相。室温下真空出去多余的吡咯。硅胶色谱柱纯化得到化合物1(49%)。
化合物2:
将化合物1(4.0mmol)溶于无水四氢呋喃(80mL)(锡箔纸包裹反应瓶,避光),通10分钟氮气,降温到-78摄氏度。向冷却了的溶液中通过插管缓慢滴加溶于四氢呋喃(80mL)的N-氯代琥珀酰亚胺(1.06g, 8.0mmol)(溶液避光,操作耗时一小时)。反应混合物在-78摄氏度下搅拌两小时后,放置于-20摄氏度的冰箱中18小时。浓缩反应混合物后,二氯甲烷萃取(100mL)和水洗涤(2X 20mL)。有机相用无水硫酸镁干燥,硅胶色谱柱纯化(正己烷∶二氯甲烷=1∶1),得到化合物2(56%)。
化合物3:
化合物2(2.16mmol)溶解于二氯甲烷,通5分钟氮气。称取DDQ (539mg,2.38mol)溶于二氯甲烷(10mL),五分钟以上缓慢滴加到化合物3的溶液中。室温下搅拌一小时后,加入饱和碳酸氢钠(20mL)。用水 (20mL)洗涤有机相,硫酸钠干燥,除去溶剂得到固体产物。硅胶柱纯化 (正己烷∶二氯甲烷=4∶1)后得到化合物3(70%)。
化合物4:
向化合物3(1.5mmol)的二氯甲烷(60mL)溶液中加入三乙胺 (2.1mL,15.1mmol),室温下搅拌一小时。通过注射器加入BF·OEt2 (3.75mL,30.2mmol),反应体系在黑暗中搅拌反应12小时。加入水 (20mL),有机相用硫酸钠干燥后浓缩。硅胶色谱柱纯化(二氯甲烷∶正己烷=1∶1),得到化合物4(92%)。
化合物5:
化合物4(0.28mmol)在氮气保护下溶于无水乙腈(30mL)。一边搅拌一边滴加25%的氨水(200uL,1.31mmol)。室温下搅拌3小时,饱和盐水淬灭反应,二氯甲烷萃取。有机相用硫酸钠干燥后浓缩,硅胶色谱柱(二氯甲烷∶石油醚=5∶1)纯化,得到化合物5(77%)。
化合物6:
化合物5(0.16mmol)在氮气保护下溶解于无水乙腈(30mL)。搅拌下,分别加入溴乙酰(19.2uL,0.28mmol)和三乙胺。室温下搅拌过夜,饱和盐水淬灭反应,二氯甲烷萃取。有机相用硫酸钠干燥,浓缩,硅胶色谱柱纯化(二氯甲烷∶石油醚=5∶1),得到化合物6(90%)。
目标蛋白的改造
含有非天然氨基酸的目标蛋白的制备与表达纯化:将正交tRNA和筛选出来的x-TyrRS分别构建到pEVOL载体上,然后共转化到包含有 PET22b-iLOV486(n-TAG)质粒的BL21细胞中。挑取单个克隆在37℃培养到OD 600约等于1.0时,向LB培养基中加入1mM上面制备的巯基苯丙氨酸,在30℃继续培养14-16小时之后,收菌,Ni-NTA纯化蛋白,备用。
笼形蛋白O3-33与优选CO2还原酶的融合表达
将编码有非天然氨基酸的iLOV486通过Xhol酶切位点,插入到编码有03-33蛋白的pET29b-O3-33的质粒中。在iLOV486与03-33蛋白之间拟引入一个10-15个氨基酸残基长度的甘氨酸-丝氨酸连接肽链。接着在大肠杆菌(BL21(DE3))体系中表达iLOV486位插入巯基苯丙氨酸 (TF)的iLOV486TF-03-33融合蛋白单体。
CO2还原酶-笼形蛋白O3-33融合蛋白的三聚体组装与近一步纯化
表达所得到的iLOV486-笼形蛋白O3-33融合蛋白单体可在25mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中自发组装成三聚体,通过进一步的尺寸排除色谱法(size-exclusionchromatography)对组装体系进行进一步纯化,获得纯度较高的三聚体。
三点锚定CO2还原酶/碳电极界面
将插入有巯基苯丙氨酸的iLOV486蛋白,与连接分子BODIPY在 4℃,pH8.1TrisBuffer(50mM)溶液环境下,自发交联20-30分钟,然后用脱盐柱离心清洗2-3次,然后滴涂到碳材料电极上,常温干燥1小时,获得三点锚定CO2还原酶/碳电极界面。
比较例 基于非天然氨基酸与连接分子的位点特异性单点锚定
含有非天然氨基酸的目标蛋白的表达纯化:将正交tRNA和筛选出来的x-TyrRS分别构建到pEVOL载体上,然后共转化到包含有PET22b-目标蛋白(n-TAG)质粒的BL21细胞中。挑取单个克隆在37℃培养到OD 600约等于1.0时,向LB培养基中加入1mM巯基苯丙氨酸,在30℃继续培养14-16小时之后,收菌,Ni-NTA纯化蛋白,备用。
与碳电极的连接:将插入有巯基苯丙氨酸的目标蛋白,与连接分子 BODIPY在4℃,pH8.1Tris Buffer(50mM)溶液环境下,自发交联20-30分钟,然后用脱盐柱离心清洗2-3次,然后滴涂到碳材料电极上,常温干燥1 小时。
实施例2 基于点突变天然氨基酸的直接多点锚定
首先构建iLOV486位突变体的质粒iLOV486-Cys(486位密码子突变为半胱氨酸)和iLOV486位突变体和笼形蛋白03-33融合蛋白的质粒 iLOV486-Cys-03-22。接着在大肠杆菌(BL21(DE3))体系中表达iLOV486- Cys-03-33融合蛋白单体。iLOV486-Cys-03-33融合蛋白单体在25mM Tris Buffer(pH=8.0)中进一步自组装为三聚体蛋白复合体。
基于循环伏安法的稳定性测试
以金电极为酶的固定化电极,将三聚组装体蛋白通过每个蛋白上的486 位半胱氨酸残基偶联到金电极表面。基于此体系可通过FAD与电极之间的电子传递效率的变化来评估实施例1和比较例之间的界面稳定性。
在此,以目标蛋白iLOV的催化活性中心核黄素(FAD)的峰电流值随时间的衰减程度保持来评价蛋白的稳定性,从图2可见,三聚体蛋白的催化稳定性明显优于未组装单体的稳定性,在经9小时测试后,三聚体蛋白保持了初始活性80%的稳定性,而未组装的iLOV仅保持了初始活性63%的稳定性。
进一步对基于三聚体在电极定点偶联后形成的三点锚定体系的性能评价如图3所示,以锚定酶电极体系的电子传递效率变化,来评估酶电极的界面稳定性。虽然三点锚定体系略微减低了电子传递效率,但是界面稳定性得到了显著提升,变化率低于10%,而基于iLOV单体单点锚定的体系其变化率高于37%。
所有上述的首要实施这一知识产权,并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息,上述内容修改,以实现类似的执行情况。但是,所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种可精准编辑酶/电极界面,其特征在于:酶和电极界面采用多点锚定的方式连接,所述酶为多聚体自组装蛋白复合体。
2.如权利要求1所述的一种可精准编辑酶/电极界面,其特征在于:所述多聚体自组装蛋白复合体为笼形蛋白、连接短肽、还原酶三者融合形成融合蛋白。
3.如权利要求1或2所述的一种可精准编辑酶/电极界面,其特征在于:所述酶和电极界面之间采用连接分子实现锚定连接。
4.如权利要求1至3所述的一种可精准编辑酶/电极界面,其特征在于:所述连接分子一端具有能够与电极表面通过共价键或非共价相互作用锚定,分子另一端与目标蛋白中引入的锚定位点分子进行特异性自发反应。
5.如权利要求1至4所述的一种可精准编辑酶/电极界面,其特征在于:所述目标蛋白为还原酶、氧化酶、脱氢酶、水解酶。
6.如权利要求1至5所述的一种可精准编辑酶/电极界面,其特征在于:所述多聚体自组装蛋白复合体与电极界面采用连接分子连接。
7.权利要求1至6所述可精准编辑酶/电极界面的制备方法,其特征在于,包括:
第一步,多点偶联自组装蛋白复合体的制备;
第二步,可精准编辑酶/电极界面的形成。
8.一种酶电极,其特征在于:包括权利要求1至6所述可精准编辑酶/ 电极界面和基础电极。
9.如权利要求8所述的酶电极,其特征在于:该酶电极所采用的基础电极为碳基电极。
10.一种生物传感器,其特征在于:包括权利要求8或9所述酶电极作为工作电极、参比电极和对电极。
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-
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