CN112220817A - 一种具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶提取物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶提取物，它是由下列方法制备得到：将菊茎叶或菊花样品适当粉碎，称重后加入水，加热回流提取，趁热过滤，合并滤液；减压浓缩，即得。本发明根据中医药理论，通过实验筛选出菊花提取物发提取工艺，并通过药理实验筛选出其临床新的功效，实验结果表明，本发明提供的菊花或菊茎叶提取物对碘酸钠诱导的视力损伤具有保护作用，并且对AMD小鼠视网膜具有很好的保护作用，并且可增加Nrf‑2和HO‑1蛋白的表达，清除氧自由基，增强抗氧化能力，从而有效保护光感受器细胞免受碘酸钠诱导的视网膜损伤。对年龄相关性黄斑变性疾病具有很好的治疗作用。

Description

一种具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶 提取物及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花提取物，属于中药技术领域。

背景技术

菊花为菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥头状花序，其含有丰富的酚酸类、黄酮类、核苷类、氨基酸类、糖类、挥发油类、三萜类等多类型资源性化学成分，具有疏风清热、平肝明目、解毒消肿的功效。

菊花是我国传统的大宗中药材，全国干菊花年产量约1.5万吨，其中出口近2000吨。不断扩大的种植面积以及对菊花药材原料需求的逐年增长导致菊资源出现了高消耗、高浪费的现象，长此以往不利于菊花产业的可持续发展。随着我国菊资源产业链的拓展延伸，其采收过程中产生大量的根、茎、叶等废弃物，目前尚未得到充分利用，不仅造成资源的极大浪费，而且也增加了环境承载压力。研究表明，菊茎叶中同样含有种类多样、含量丰富的酚酸类、黄酮类、多糖类、挥发油类、核苷类、氨基酸类等多种资源性化学成分。《神农本草经》记载：“菊花入肝，兼行周身，血脉不利而死肌，得菊花之利血脉皆效，特长于解毒，外科方剂用之治疔毒发背者，沈金鳌曰菊花并茎叶打汁饮，外涂内服皆可”，同时记载“菊叶解毒之功胜于花，以鲜者良，捣汁敷一切肿毒，亦可内服”。《证类本草》《本草纲目》和《重修政和经史证类备用本草》均引用《肘后方》中治疔肿垂死方：“菊叶一握，捣绞汁一升，入口即活，此神验。冬用其根。”以上历代本草的记载表明，菊花和菊茎叶均具有平肝明目、清热解毒的功效。研究表明，菊茎叶多糖可改善DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎，改善结肠炎动物肠道菌群的失衡；菊茎叶水提取物和乙醇提取物可改善LPS 所致肠道功能紊乱，这些研究为菊茎叶的综合利用提供了科学依据。

年龄相关性黄斑变性（AMD）是由玻璃膜疣诱导视网膜黄斑区发生病变，使中心视力逐渐丧失的眼科疾病。目前AMD是导致中重度视力障碍的第四大原因、导致失明的第三大原因，全球约有8400万人因此失明。碘酸钠是一种氧化剂，可选择性地作用于RPE细胞，抑制细胞中离子泵及Ⅱ型碳酸酐酶的活性，增加膜的通透性，使细胞内线粒体、内质网等细胞器水肿，RPE细胞功能发生障碍，最终导致感光细胞功能异常。本发明利用碘酸钠复制AMD小鼠模型，对菊花及菊茎叶平肝明目生物效应进行评价。

发明内容

本发明的目的是在菊花原有功效的基础上，提供一种具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花提取物。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶提取物，它是由下列方法制备得到：

将菊茎叶或菊花样品适当粉碎，称重后加入水，加热回流提取，趁热过滤，合并滤液；减压浓缩，即得。

作为优选方案，以上所述的具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶提取物，它是由下列方法制备得到：

将菊茎叶或菊花样品适当粉碎，称重后加入6~12倍量的水，加热回流提取1~3次，每次0.5~2小时，趁热过滤，合并滤液；减压浓缩，即得。

作为优选方案，以上所述的具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶提取物，它是由下列方法制备得到：

将菊茎叶或菊花样品适当粉碎，称重后加入10倍量的水，加热回流提取3次，每次2小时，趁热过滤，合并滤液；减压浓缩，即得。

本发明所述的具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶提取物在制备治疗年龄相关性黄斑变性疾病的药物中的应用。

一种具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病的药物制剂，它包括具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶提取物。且所述的药物制剂为内服制剂或外用滴眼液。作为优选，取菊花提取物与药学上可接受的载体制备成颗粒剂、片剂或胶囊剂等。

有益效果：本发明和现有技术相比具有以下优点：

本发明根据中医药理论，通过实验筛选出菊花提取物发提取工艺，并通过药理实验筛选出其临床新的功效，实验结果表明，本发明提供的菊花或菊茎叶提取物对碘酸钠诱导的视力损伤具有保护作用，并且对AMD小鼠视网膜具有很好的保护作用，并且可增加Nrf-2和HO-1蛋白的表达，清除氧自由基，增强抗氧化能力，从而有效保护光感受器细胞免受碘酸钠诱导的视网膜损伤。同时可激活Nrf2/HO-1抗氧化信号通路，上调Nrf2和HO-1 mRNA的表达来保护视网膜功能免受氧化应激损伤，对年龄相关性黄斑变性疾病具有很好的治疗作用。

附图说明

图1是菊花和菊茎叶提取物对碘酸钠诱导的AMD小鼠视觉功能的改善作用。

图2是菊花和菊茎叶提取物对碘酸钠诱导的AMD小鼠视网膜组织病理切片的影响。

图3是菊花和菊茎叶提取物对AMD小鼠视网膜Nrf2和HO-1蛋白表达的影响。

图4是菊花和菊茎叶提取物对AMD小鼠视网膜OGG1、Nrf2和HO-1mRNA表达的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 菊花提取物的制备

取菊花样品适量，称重后加入10倍量纯水，加热回流提取3次，每次2 h，趁热过滤，合并滤液。旋转蒸发浓缩至一定浓度（0.91 g生药/mL），即得菊花水提物浸膏，标记为FW，分装后于-80 °C保存。

实施例2 菊茎叶提取物的制备

将菊茎叶样品适当粉碎，称重后加入10倍量纯水，加热回流提取3次，每次2 h，趁热过滤，合并滤液。旋转蒸发浓缩至一定浓度（0.90 g生药/mL），即得菊茎叶水提物浸膏，标记为SW，分装后于-80 °C保存。

实施例3

1、实验动物

SPF级5~6月龄C57BL6/J 雄性小鼠，体重26~30 g。

2、实验方法

2.1供试药物的制备

取菊花样品适量，称重后加入10倍量纯水，加热回流提取3次，每次2 h，趁热过滤，合并滤液。旋转蒸发浓缩至一定浓度（0.91 g生药/mL），即得菊花水提物浸膏，标记为FW，分装后于-80 °C保存。

将菊茎叶样品适当粉碎，称重后加入10倍量纯水，加热回流提取3次，每次2 h，趁热过滤，合并滤液。旋转蒸发浓缩至一定浓度（0.90 g生药/mL），即得菊茎叶水提物浸膏，标记为SW，分装后于-80 °C保存。

阳性药AREDS2的制备：取AREDS2软胶囊适量，加入一定体积的CMC-Na溶液研磨后混匀，即得AREDS2溶液，现用现配。

2.2动物分组与给药方案

C57BL6/J雄性小鼠适应性饲养一周，随后将小鼠随机分为7组，每组10只，分别为空白对照组（Control）、模型组（Model）、阳性药AREDS2组、菊花低剂量组（F-WL）、菊花高剂量组（F-WH）、菊茎叶低剂量组（S-WL）、菊茎叶高剂量组（S-WH）。适应性饲养结束后，对AREDS2组、F-WL组、F-WH组、S-WL组和S-WH组小鼠进行预防灌胃给药2周，期间对照组和模型组小鼠给予同等剂量的生理盐水。随后以50 mg/kg的剂量，对Model组、AREDS2组、F-WL组、F-WH组、S-WL组和S-WH组小鼠腹腔注射碘酸钠一次，复制年龄相关性黄斑变性（AMD）模型，各组小鼠继续灌胃给药1周，对照组和模型组小鼠给予同等剂量的生理盐水。各组给药剂量分别为：AREDS2组（维生素C，100 mg/kg/d；维生素E，80 U/kg/d；氧化锌，16 mg/kg/d；氧化铜，0.4mg/kg/d；叶黄素，2 mg/kg/d；玉米黄质，0.4 mg/kg/d）、F-WL组（26 mg/10g/d）、F-WH组（65mg/10g/d）、S-WL组（26 mg/10g/d）、S-WH组（65 mg/10g/d）。

2.3血清及组织标本的采集

小鼠给药结束后，空腹8 h，用剪刀剪掉小鼠胡须，防止溶血。小鼠摘眼球取血后采取脱颈椎处死。血液在室温静置2 h，3000 r/min 离心10 min，分离血清，分装后于-80 ℃冻存。摘取小鼠左眼球，置于眼球固定液中固定，用于病理切片分析。摘取小鼠右眼球后在显微镜下剥离视网膜，视网膜于-80 ℃冻存，用于Western blot和PCR检测。摘取小鼠肝脏组织，置于4%多聚甲醛固定液中固定，用于病理切片分析。

2.4 HE染色

小鼠眼球和肝脏组织于相应固定液中固定24 h后，石蜡包埋组织切片，供苏木精-伊红（HE）染色用。

2.5 Western blot检测视网膜组织中氧化应激相关蛋白的含量

2.6 Real-time PCR检测视网膜组织中Nrf2、HO-1和OGG1的mRNA表达水平

3结果与讨论

3.1视觉行为学测试结果

本发明设计视觉行为学测试装置黑白箱用来评价菊花和菊茎叶提取物对碘酸钠诱导的年龄相关性黄斑变性（AMD）的调节作用（图1A为视觉行为学测试装置黑白箱示意图）。结果显示（图1B为各组别小鼠在白箱中的时间占在黑白箱中总时间的百分比），碘酸钠造模7天后，与对照组相比，模型组小鼠在白箱中的停留时间更长，说明碘酸钠导致模型组小鼠视力严重受损。与模型组相比，菊花高剂量组和茎叶高剂量组小鼠均缩短了在白箱中的停留时间，能更快的找到黑箱入口，更多时间待在黑箱中，表明菊花和菊茎叶提取物对碘酸钠诱导的视力损伤具有保护作用。

3.2菊花及菊茎叶对AMD小鼠视网膜病理改变的保护作用

碘酸钠造模7天后，各组小鼠视网膜HE染色结果见图2。如图2所示（A）空白对照组、（B）模型组、（C）阳性药组、（D）菊花高剂量组、（E）菊花低剂量组、（F）菊茎叶高剂量组、（G）菊茎叶低剂量组，空白对照组视网膜组织结构正常完整，神经节细胞层（GCL）、内丛状层（IPL）、内核层（INL）、外丛状层（OPL）、外核层（ONL）、感光细胞层（IS/OS）和视网膜色素上皮层（RPE）等各层组织结构清晰，神经节细胞、内核层细胞、外核层细胞排列整齐，未见变性、坏死；视网膜色素上皮层细胞未见减少；间质未见水肿，毛细血管未见扩张、充血。与空白对照组相比，注射碘酸钠7天后模型组小鼠视网膜严重变性，内核层（INL）细胞数量减少、细胞变性、细胞排列疏松。而包括外核层（ONL）和感光细胞层（IS / OS）在内的视网膜外层厚度显著变薄。其中，外核层（ONL）中感光细胞数量减少，失去了该层有序的线性结构，形成内陷。感光细胞层（IS/OS）细胞变性，大部分光感受器及其感光细胞层外节（OS）丢失。同时，视网膜色素上皮层细胞（RPE）丢失严重，视网膜色素上皮层基本缺失已经很难分辨。而给予本发明的菊花和菊茎叶提取物干预后AMD小鼠视网膜组织病理状态得到改善，病变程度得到不同程度减轻，且随着给药剂量的增加，改善效果越明显，尤其是菊花高剂量组和菊茎叶高剂量组对AMD小鼠视网膜的保护作用最为明显。

3.3菊花及菊茎叶对AMD小鼠视网膜氧化应激相关蛋白表达的影响

与模型组小鼠相比，各给药组均可调节核因子E2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶1（HO-1）蛋白的表达，尤其是阳性药组、菊花高剂量组和菊茎叶高剂量组显著增加了Nrf2和HO-1蛋白的表达。因此，菊花和菊茎叶提取物可能是通过激活Nrf2/HO-1抗氧化信号通路，增加Nrf-2和HO-1蛋白的表达，清除氧自由基，增强抗氧化能力，从而有效保护光感受器细胞免受碘酸钠诱导的视网膜损伤。

3.4菊花及菊茎叶对AMD小鼠视网膜OGG1、Nrf2和HO-1mRNA表达的影响

如图4所示，与正常组小鼠相比，碘酸钠诱导的模型组小鼠8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶1（OGG1）mRNA的表达显著增加，表明碘酸钠诱导的AMD小鼠氧化应激通路被激活。与模型组小鼠相比，各给药组小鼠均可调节OGG1 mRNA的表达，尤其是阳性药组、菊花高剂量组和菊茎叶高剂量组小鼠均显著降低了OGG1 mRNA的表达。此外，与模型组小鼠对比，阳性药组、菊花高剂量组和菊茎叶高剂量组小鼠均可显著增加Nrf2和HO-1 mRNA的表达水平。因此，菊花和菊茎叶提取物可能是通过下调OGG1 mRNA的表达，同时激活Nrf2/HO-1抗氧化信号通路，上调Nrf2和HO-1 mRNA的表达来保护视网膜功能免受氧化应激损伤。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶提取物，其特征在于，它是由下列方法制备得到：

将菊茎叶或菊花样品适当粉碎，称重后加入水，加热回流提取，趁热过滤，合并滤液；减压浓缩，即得。

2.根据权利要求1所述的具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶提取物，其特征在于，它是由下列方法制备得到：

将菊茎叶或菊花样品适当粉碎，称重后加入6~12倍量的水，加热回流提取1~3次，每次0.5~2小时，趁热过滤，合并滤液；减压浓缩，即得。

3.根据权利要求2所述的具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶提取物，其特征在于，它是由下列方法制备得到：

将菊茎叶或菊花样品适当粉碎，称重后加入10倍量的水，加热回流提取3次，每次2小时，趁热过滤，合并滤液；减压浓缩，即得。

4.权利要求1-3中任一项所述的具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶提取物在制备治疗年龄相关性黄斑变性疾病的药物中的应用。

5.一种具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病的药物制剂，其特征在于，它包括权利要求1-3中任一项所述的具有治疗年龄相关性黄斑变性疾病作用的菊花和菊茎叶提取物。

6.根据权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂为内服制剂或外用滴眼液。

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