CN112206358B - 一种生物3d打印皮肤修复支架 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物3D打印皮肤修复支架，包括呈水凝胶形式的依次叠加的表皮层、真皮层、皮下组织层；所述水凝胶组成包括海藻酸钠、明胶、胶原蛋白、透明质酸、弹性蛋白、层粘连蛋白、甘油等。皮肤修复支架还包括用于锁水、屏障的致密层。所述皮肤修复支架根据设定好的3D打印皮肤修复支架结构进行生物3D打印，所述设计的皮肤修复支架结构为：2‑6层表皮层，6‑20层真皮层，6‑20层皮下组织层；所述3D打印层的相邻层的纤维方向呈正交打印，间隔层的纤维方向呈错位打印。本发明的皮肤修复支架通过各层不同的水凝胶组成配比，良好地模拟了皮肤结构，有效地促进了皮肤的修复。

Description

一种生物3D打印皮肤修复支架
技术领域
本发明涉及皮肤修复支架领域，具体而言，涉及一种生物3D打印皮肤修复支架。
背景技术
皮肤包在身体表面，直接同外界环境接触，具有保护、排泄、调节体温和感受外界刺激等作用，是人体最大的器官。皮肤与外部环境直接接触，因此极易受到伤害，如烧伤和皮肤溃疡，皮肤严重损伤时，就需要有一种合适的创面修复材料来促进伤口的愈合。
创面修复材料包括医用敷料，例如纱布、纤维类敷料、水胶体类敷料、藻酸盐敷料等，能够抵御外界刺激和感染，防止干燥和体液丢失，促进伤口愈合。另外，皮肤修复支架作为创面修复材料也具有良好的发展前景，并具有如下优点：允许细胞在其表面粘附，促进细胞增殖；具备可降解性和良好的生物相容性；具有的三维结构为细胞提供结构支撑作用，引导组织再生，具有一定的机械强度。如专利CN107519535A公开了一种海藻酸钠/丝素双层皮肤组织工程支架，包括与空气接触由海藻酸钠薄膜组成的上层，以及与机体创面接触由丝素/海藻酸钠共混多孔支架材料组成的下层，所述上层与下层经冷冻干燥处理在两层之间形成牢固的结合点进行复合。该材料采用天然再生的丝素和海藻酸钠作为基材，可生物降解且具有良好的生物相容性，其仿真皮层可诱导细胞长入和增殖，适用于深度皮肤缺损的修复，具有良好的临床应用前景。
由于皮肤具有多层结构，将皮肤修复支架制备成多层结构，更加有利于细胞的增殖、分化，以及皮肤修复后期血管、毛孔的形成。生物打印是一种基于3D打印技术的先进制造工艺，将生物材料、活细胞和生长因子根据计算机辅助设计，通过层-层打印构建组织，具有高灵活性和可重复性，适合用于制备多层结构的皮肤修复支架。如专利CN110302432A公开了一种具有梯度孔结构的全层皮肤组织工程支架的制备方法：采用溶胶-凝胶技术探索制备了有机-无机杂化材料，依照皮肤组织的结构和成分特征，选用CS-Si-Gel组分作为真皮层，CS-Si组分作为表皮层，采用多喷头打印系统成功构建出具有梯度孔结构的全层皮肤组织工程支架。所选材料具备优异的生物相容性、抗菌性等，所制备支架具有结构仿生的优势。此外，采用三维扫描建模技术进行分层打印，逐层堆叠，可实现个性化定制，从而提高了全层皮肤缺损修复的成功率。专利CN109481732A公开了一种基于PEG化壳聚糖
Figure GDA0002772052770000021
明胶体系的3D细胞打印材料，包括质量比为1～80:10～60的PEG化壳聚糖和明胶；采用正负电荷相互作用的交联方法形成水凝胶网络，对细胞无毒性，最大限度地避免了交联过程对细胞活性的损害，具有良好的生物相容性、可降解性、成胶性和可打性，通过3D细胞打印得到的细胞支架性能稳定，可用于皮肤、韧带等软组织的构建及修复等临床工作。
上述现有技术公开的皮肤修复支架包括表皮层、真皮层等，具有多层结构，能够促进皮肤修复。但真实皮肤的表皮层、真皮层和皮下组织层的成分复杂，而上述现有技术中皮肤修复支架各层的组分过于单一，无论是物理性能还是生物活性都相差较大。此外，人工皮肤理想的性能还应该包括及时将伤口渗出液导出、在降解过程中形成通路、降解过程中的稳定性、促进细胞的生长等。
有鉴于此，特提出本发明，提供一种生物3D打印皮肤修复支架，具有优异的综合性能，能够克服上述缺点，促进皮肤修复。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种生物3D打印皮肤修复支架，所述的生物3D打印皮肤修复支架的各层包括不同组分的配合，能够更好地模拟皮肤的复杂结构，技术方案如下：
一种生物3D打印皮肤修复支架，包括呈水凝胶形式的依次叠加的表皮层、真皮层和皮下组织层；
所述表皮层的水凝胶组成包括海藻酸钠10-40mg/ml，明胶10-40mg/ml，胶原蛋白5-20mg/ml，透明质酸1-5mg/ml，弹性蛋白0.1-5mg/ml，层粘连蛋白0.1-5mg/ml，甘油50-100mg/ml；所述真皮层的水凝胶组成包括海藻酸钠15-35mg/ml，明胶10-35mg/ml，胶原蛋白1-10mg/ml，透明质酸1-10mg/ml，甘油50-100mg/ml；所述皮下组织层的水凝胶组成包括海藻酸钠10-30mg/ml，明胶10-30mg/ml，胶原蛋白1-10mg/ml，透明质酸1-5mg/ml；所述mg/ml指的是相应组分与配制溶液的质量体积比。
进一步地，所述表皮层、真皮层和皮下组织层的水凝胶中，所述海藻酸钠的部分或全部为氧化海藻酸钠。
进一步地，所述表皮层、真皮层和皮下组织层均包括抗菌成分，例如PHMB，溶菌酶，溶葡萄球菌酶。
进一步地，所述表皮层、真皮层和皮下组织层均包括生长因子，用于促进细胞在皮肤修复支架中的生长增殖；优选地，表皮层包括角质细胞生长因子(KGF)或上皮细胞生长因子(EGF)1-10ng/ml，真皮层包括成纤维细胞生长因子(FGF)10-20ng/ml，皮下组织层包括血管内皮生长因子(VEGF)0.1-1.0ng/ml；所述ng/mL指的是相应组分与配制溶液的质量体积比。
进一步地，所述的一种生物3D打印皮肤修复支架，还包括覆盖在表皮上面的呈水凝胶形式的致密层，所述致密层的水凝胶组成包括海藻酸钠15-40mg/ml，明胶10-35mg/ml，甘油50-100mg/L，透明质酸1-10mg/ml；所述致密层覆盖在表皮上面，起到锁水、保护的屏障作用，用于无伤口渗出液的皮肤修复。
进一步地，所述表皮层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4-6h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、甘油，在37℃搅拌1-4h溶解混匀，再加入KGF或EGF摇晃混匀。
进一步地，所述真皮层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4-6h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶、胶原蛋白、甘油，37℃中搅拌1-4h溶解混匀，再加入FGF摇晃混匀。
进一步地，所述皮下组织层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4-6h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶、胶原蛋白，37℃搅拌1-4h溶解混匀，再加入VEGF摇晃混匀。
进一步地，所述致密层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4-6h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶和甘油，37℃中搅拌1-4h溶解混匀。
本发明的第二目的在于提供所述的一种生物3D打印皮肤修复支架的3D打印方法，通过不同3D打印结构设计，可以获得性能各异的皮肤修复支架，可用于不同情况下的皮肤修复。
所述的3D打印方法包括如下步骤：(1)将配置好的水凝胶分别装置在不同的打印墨盒中，按照设定好的3D打印皮肤修复支架结构进行逐层打印，依次打印表皮层、真皮层和皮下组织层；
(2)打印过程中实时雾化2％-10％氯化钙溶液进行交联并维持打印结构，打印完成后浸泡在氯化钙溶液中交联10-30min；
(3)用PBS清洗两遍后放入-80℃中冷冻过夜，再将支架放入真空冷冻干燥机中12-48h，冻干完成后使用辐照灭菌的方式灭菌处理。
进一步地，在第一种实施方式中，所述的设定好的3D打印皮肤修复支架结构为：2-6层表皮层，6-20层真皮层，6-20层皮下组织层；所述3D打印的纤维直径为100μm-800μm，3D打印的纤维间距为200-1000μm；所述3D打印层的相邻层的纤维方向呈正交打印。
在第二种实施方式中，所述的设定好的3D打印皮肤修复支架结构为：2-6层表皮层，6-20层真皮层，6-20层皮下组织层；所述3D打印的纤维直径为100μm-800μm，3D打印的纤维间距为200-1000μm；所述3D打印层的相邻层的纤维方向呈正交打印，间隔层的纤维方向呈错位打印。
在第三种实施方式中，所述的设定好的3D打印皮肤修复支架结构为：2-6层表皮层，6-20层真皮层，6-20层皮下组织层；所述3D打印的纤维直径为100μm-800μm，连续打印1-3mm宽，然后间隔200-1000μm再连续打印1-3mm宽；所述3D打印层的相邻层的纤维方向呈正交打印。
进一步地，在第一～三种实施方式中，在打印表皮层之前，还包括先打印1-6层致密层，所述致密层无孔隙。
进一步地，所述致密层可以采用挤压打印或喷墨的方式形成。
本发明的生物3D打印皮肤修复支架可以有如下几种临床应用：支架辐照灭菌后保存待用，临床应用时可浸泡于生理盐水后使用；或者，辐照灭菌后，临床使用前在支架上种植细胞培养后移植到人体使用；或者辐照灭菌后，在支架上种植细胞培养，后进行组织冻存，临床使用时复苏使用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的3D打印皮肤修复支架具有表皮层、真皮层和皮下组织层的多层结构，模拟天然皮肤细胞外基质成分，接近人体真实皮肤结构。
2、本发明的3D打印皮肤修复支架各层采用特定的材料组成和孔隙大小，修复支架各层的降解速率与创面修复时间相一致，有利于创面修复效果。
3、本发明的皮肤修复支架采用3D打印水凝胶组分，能够形成3D打印的宏孔结构，水凝胶组分具有微孔结构，利于营养物质和代谢产物的输送，利于血管长入和细胞粘附生长加快创面愈合。
4、本发明的皮肤修复支架还具有致密层，起到保护作用，具有防水、透气和保护皮肤的功能，同时具有可以符合临床使用的力学性能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。另外，由于各层包括的层数较多，导致附图过于复杂，因而通过简化，附图中仅显示了各层的两层结构，仅作为示意，不代表仅包括附图中的真实层数。
图1为实施例1的3D打印皮肤修复支架结构设计的立体图；
图2为实施例1的3D打印皮肤修复支架结构设计的多层示意图；
图3为实施例2的3D打印皮肤修复支架结构设计的多层示意图；
图4为实施例3的3D打印皮肤修复支架结构设计的多层示意图；
图5为实施例4的3D打印皮肤修复支架结构设计的立体图；
图6为实施例4的3D打印皮肤修复支架结构设计的多层示意图；
图7为实施例1的生物3D打印皮肤修复支架的打印后光镜图；
图8为实施例4的生物3D打印皮肤修复支架的打印后光镜图；
图9为实施例1的生物3D打印皮肤修复支架冷冻干燥实物图；
图10为实施例4的生物3D打印皮肤修复支架冷冻干燥实物图；
图11为实施例1生物3D打印皮肤修复支架表面扫面电镜图；
图12为实施例1生物3D打印皮肤修复支架内部扫面电镜图；
图13为实施例1皮肤修复支架各层结构的降解速率图；
图14为实施例1的生物3D打印皮肤修复支架用于修复裸鼠皮肤创面的实验结果图；
图15为实施例4的生物3D打印皮肤修复支架用于修复裸鼠皮肤创面的实验结果图；
图16为对比例1的生物3D打印皮肤修复支架用于修复裸鼠皮肤创面的实验结果图；
图1-6中的图标：1-皮下组织层，2-真皮层，3-表皮层，4-致密层。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种生物3D打印皮肤修复支架，包括呈水凝胶形式的依次叠加的表皮层、真皮层和皮下组织层；
所述表皮层的水凝胶组成包括海藻酸钠20mg/ml，明胶18mg/ml，胶原蛋白5mg/ml，透明质酸2mg/ml，弹性蛋白1mg/ml，层粘连蛋白1mg/ml，甘油80mg/ml，KGF 5ng/ml；所述真皮层的水凝胶组成包括海藻酸钠15mg/ml，明胶20mg/ml，胶原蛋白10mg/ml，甘油60mg/ml，透明质酸5mg/ml，FGF 10ng/ml；所述皮下组织层的水凝胶组成包括海藻酸钠10mg/ml，明胶20mg/ml，胶原蛋白4mg/ml，透明质酸2mg/ml，VEGF 1.0ng/ml；所述mg/ml指的是相应组分与配制PBS溶液的质量体积比。
所述表皮层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白和甘油，在37℃搅拌4h溶解混匀，再加入KGF摇晃混匀；所述真皮层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶、胶原蛋白和甘油，在37℃中搅拌4h溶解混匀，再加入FGF摇晃混匀；所述皮下组织层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶和胶原蛋白到PBS中，37℃搅拌2h溶解混匀，再加入VEGF摇晃混匀。
所述的一种生物3D打印皮肤修复支架的3D打印方法包括如下步骤：
(1)将配置好的水凝胶分别装置在不同的打印墨盒中，按照设定好的3D打印皮肤修复支架结构进行逐层打印，依次打印表皮层、真皮层和皮下组织层；所述的设定好的3D打印皮肤修复支架结构为2层表皮层，8层真皮层，8层皮下组织层；所述3D打印的纤维直径为500μm，3D打印的纤维间距为600μm；所述3D打印层的相邻层的纤维方向呈正交打印，间隔层的纤维方向竖直对齐打印；
(2)打印过程中实时雾化5％氯化钙溶液进行交联并维持打印结构，打印完成后浸泡在氯化钙溶液中交联20min；
(3)用PBS清洗两遍后放入-80℃中冷冻过夜，再将支架放入真空冷冻干燥机中36h，冻干完成后使用辐照灭菌的方式灭菌处理。
实施例1的3D打印皮肤修复支架结构设计的示意图如附图1-2所示，图中1为表皮层，2为真皮层，3为皮下组织层。
另外，由于各层包括的层数较多，导致附图过于复杂，因而通过简化，附图中仅显示了各层的两层结构，仅作为示意，不代表仅包括附图中的真实层数，以下的实施例也是如此。
实施例2
一种生物3D打印皮肤修复支架，包括呈水凝胶形式的依次叠加的表皮层、真皮层和皮下组织层；
所述表皮层的水凝胶组成包括海藻酸钠25mg/ml，明胶15mg/ml，胶原蛋白10mg/ml，透明质酸1mg/ml，弹性蛋白0.1mg/ml，层粘连蛋白0.1mg/ml，甘油50mg/ml，KGF 1ng/ml；所述真皮层的水凝胶组成包括海藻酸钠20mg/ml，明胶18mg/ml，胶原蛋白1mg/ml，透明质酸5mg/ml,甘油50mg/ml，FGF 10ng/ml；所述皮下组织层的水凝胶组成包括海藻酸钠15mg/ml，明胶25mg/ml，胶原蛋白1mg/ml，透明质酸1mg/ml,VEGF 0.1ng/ml。
所述表皮层的水凝胶、真皮层的水凝胶、皮下组织层的水凝胶配制方法与实施例1相同。
所述的一种生物3D打印皮肤修复支架的3D打印方法包括如下步骤：
(1)将配置好的水凝胶分别装置在不同的打印墨盒中，按照设定好的3D打印皮肤修复支架结构进行逐层打印，依次打印表皮层、真皮层和皮下组织层；所述的设定好的3D打印皮肤修复支架结构为3层表皮层，10层真皮层，10层皮下组织层；所述3D打印的纤维直径为300μm，3D打印的纤维间距为400μm；所述3D打印层的相邻层的纤维方向呈正交打印，间隔层的纤维方向呈错位打印；
(2)打印过程中实时雾化5％氯化钙溶液进行交联并维持打印结构，打印完成后浸泡在氯化钙溶液中交联10min；
(3)用PBS清洗两遍后放入-80℃中冷冻过夜，再将支架放入真空冷冻干燥机中36h，冻干完成后使用辐照灭菌的方式灭菌处理。
实施例2的3D打印皮肤修复支架结构设计的示意图如附图3所示，图标1为表皮层，2为真皮层，3为皮下组织层。
实施例3
一种生物3D打印皮肤修复支架，包括呈水凝胶形式的依次叠加的表皮层、真皮层和皮下组织层；
所述表皮层的水凝胶组成包括海藻酸钠25mg/ml，明胶15mg/ml，胶原蛋白15mg/ml，透明质酸3mg/ml，弹性蛋白5mg/ml，层粘连蛋白5mg/ml，甘油100mg/ml，EGF 10ng/ml；所述真皮层的水凝胶组成包括海藻酸钠20mg/ml，明胶20mg/ml，胶原蛋白10mg/ml，甘油80mg/ml，透明质酸2mg/ml，FGF 20ng/ml；所述皮下组织层的水凝胶组成包括海藻酸钠18mg/ml，明胶15mg/ml，胶原蛋白10mg/ml，透明质酸1mg/ml，VEGF 1.0ng/ml。
所述表皮层的水凝胶、真皮层的水凝胶、皮下组织层的水凝胶配制方法与实施例1相同。
所述的一种生物3D打印皮肤修复支架的3D打印方法包括如下步骤：
(1)将配置好的水凝胶分别装置在不同的打印墨盒中，按照设定好的3D打印皮肤修复支架结构进行逐层打印，依次打印表皮层、真皮层和皮下组织层；所述的设定好的3D打印皮肤修复支架结构为4层表皮层，12层真皮层，12层皮下组织层；所述3D打印的纤维直径为300μm，连续打印2mm宽，然后间隔300μm再连续打印2mm宽；所述3D打印层的相邻层的纤维方向呈正交打印；
(2)打印过程中实时雾化10％氯化钙溶液进行交联并维持打印结构，打印完成后浸泡在氯化钙溶液中交联30min；
(3)用PBS清洗两遍后放入-80℃中冷冻过夜，再将支架放入真空冷冻干燥机中36h，冻干完成后使用辐照灭菌的方式灭菌处理。
实施例2的3D打印皮肤修复支架结构设计的示意图如附图4所示，图标1为表皮层，2为真皮层，3为皮下组织层。
实施例4
实施例4与实施例1不同之处在于，所述的一种生物3D打印皮肤修复支架还包括致密层，所述致密层的水凝胶组成包括海藻酸钠20mg/ml，明胶20mg/ml，甘油80mg/L，透明质酸3mg/ml；所述致密层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶和甘油，37℃中搅拌4h溶解混匀；所述致密层在打印表皮层之前打印，采用挤压打印，层数为2层，无孔隙。
实施例4的3D打印皮肤修复支架结构设计的示意图如附图5-6所示，图标1为表皮层，2为真皮层，3为皮下组织层，4为致密层。
实施例5
实施例5与实施例2不同之处在于，所述的一种生物3D打印皮肤修复支架还包括致密层，所述致密层的水凝胶组成包括海藻酸钠15mg/ml，明胶20mg/ml，甘油50mg/L，透明质酸2mg/ml；所述致密层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶和甘油，37℃中搅拌4h溶解混匀；所述致密层在打印表皮层之前打印，层数为2层，无孔隙。
实施例6
实施例6与实施例3不同之处在于，所述的一种生物3D打印皮肤修复支架还包括致密层，所述致密层的水凝胶组成包括海藻酸钠25mg/ml，明胶15mg/ml，甘油100mg/L，透明质酸1mg/ml；所述致密层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶和甘油，37℃中搅拌4h溶解混匀；所述致密层在打印表皮层之前打印，层数为2层，无孔隙。
对比例1
对比例1与实施例1不同之处在于，所述表皮层、真皮层和皮下组织层的水凝胶组成相同，包括透明质酸10mg/ml，明胶10mg/ml，胶原蛋白100mg/mL。
对比例2
对比例2与实施例1不同之处在于，所述表皮层的水凝胶组成包括胶原蛋白100mg/ml，所述真皮层的水凝胶组成包括胶原蛋白100mg/ml，所述皮下组织层的水凝胶组成包括丝素蛋白100mg/ml。
实验结果：
①生物3D打印皮肤修复支架的微观结构：
图7和图8分别为实施例1、实施例4的生物3D打印皮肤修复支架的打印后光镜图；从图中可以看出，3D打印的宏孔结构能够较好地保持，凝胶组分较为稳定。
图9和图10分别为实施例1、实施例4的生物3D打印皮肤修复支架的冷冻干燥实物图；从图中可以看出，生物3D打印皮肤修复支架的3D打印的纤维形态、间距与结构设计完全一致，结构完整良好；宏孔的孔径大小均匀，符合预期。
图11和图12分别为实施例1生物3D打印皮肤修复支架表面、内部扫面电镜图；从支架表面的扫面电镜图中可以看出，支架表面具有3D打印的宏孔，粒径大小为300μm，3D打印纤维表面也具有微孔。将生物3D打印皮肤修复支架切面，观察内部3D打印纤维的微孔结构，从支架表面的扫面电镜图中可以看出，3D打印纤维具有丰富均匀的微孔结构。
从上述结果可知，本发明的生物3D打印皮肤修复支架具有预期的3D打印纤维、间距和稳定的结构；生物3D打印皮肤修复支架具有均匀的宏孔和微孔结构，利于细胞粘附和生长，利于血管的生成和长入。
②生物3D打印皮肤修复支架的降解实验：
分别制备实施例1中的表皮层、真皮层和皮下组织层的水凝胶膜片做降解测试。将配置好的水凝胶溶液，分别加入24孔板中，每孔加入500μl，每孔中加入1ml的交联剂进行交联30min，用PBS清洗两遍。将制备完成的复合水凝胶进行冷冻干燥，得到冻干水凝胶膜片。将冷冻干燥制备得到的水凝胶膜片进行称重并标记，称量原始重量标记为W0，加入DMEM溶液，放入37℃中，每两天换液一次。在不同时间点分别取出样品，放入-80℃冰箱预冻后进行冷冻干燥，称量重量标记为W1，根据降解质量与原始质量之比计算水凝胶支架的降解率。降解率的计算公式如下：降解率(％)＝(W0-W1)/W0。降解实验的结果如图13所示。
从图13的降解结果中可以看出，皮下组织层、真皮层和表皮层的降解速率依次降低。其中，皮下组织层与创面直接接触，皮肤创面的细胞首先进入皮下组织层，黏附生长；皮下组织层降解速率较快，能够为细胞留出更多的生长空间。表皮层降解速率最慢，处于修复支架的最外层，能够在创面修复过程中起到良好的保护作用。生物3D打印皮肤修复支架三层不同降解速率，与创面修复过程中的皮肤从内到外的生长和修复过程一致。
③生物3D打印皮肤修复支架用于修复裸鼠皮肤创面：
将生物3D打印人工皮肤修复支架经过灭菌处理后备用。选取6-8周龄体重为18-22g的BALB/C裸鼠，10％的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，待裸鼠麻醉好，俯卧位固定，用碘伏溶液和75％酒精溶液依次消毒背部皮肤，用皮肤记号笔标记边长为2厘米的伤口范围，用剪刀制备皮肤全层缺损。实施例1支架直接覆盖在伤口处，实施例4支架浸泡于生理盐水中10min后取出覆盖在伤口处，对比例1支架直接覆盖在伤口处。凡士林纱布和无菌纱布覆盖，弹性绷带包扎固定，3周后，观察对比皮肤修复效果。皮肤修复主要依赖于两个方面，修复支架促进的皮肤修复和皮肤伤口收缩进行的修复，修复支架的修复效果越好，皮肤伤口收缩越小，实验结果如图14-16所示。
图14-16分别是实施例1、实施例4和对比例1的生物3D打印皮肤修复支架用于修复裸鼠皮肤创面的实验结果。从图中14可以看出，伤口部分的皮肤得到了修复，且皮肤伤口边缘有部分收缩，表明实施例1的修复支架具有较好的皮肤修复效果，伤口的收缩修复依赖较少。从图15可以看出，伤口部分的皮肤得到了修复，且皮肤伤口边缘仅有少量收缩，表明皮肤的修复主要是依赖于生物3D打印皮肤修复支架，实施例4的修复支架具有最好的皮肤修复效果。从图16可以看出，皮肤伤口边缘有较大收缩，伤口面积减少了近一半，表明对比例1的修复支架的修复效果一般，还需要依赖皮肤的收缩修复。
实施例1和实施例4的皮肤创面效果优于对比例1，说明采用本发明的多层结构和各层特定配比的水凝胶组分具有更好的皮肤修复效果。其次，实施例4的实验结果优于实施例1，主要原因在于实施例4增加了致密层，起到保护作用，具有防水、透气和保护皮肤的功能，促进了皮肤修复效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种生物3D打印皮肤修复支架，其特征在于，包括呈水凝胶形式的依次叠加的表皮层、真皮层和皮下组织层；
所述表皮层的水凝胶组成包括海藻酸钠10-40mg/ml，明胶10-40mg/ml，胶原蛋白5-20mg/ml，透明质酸1-5mg/ml，弹性蛋白0.1-5mg/ml，层粘连蛋白0.1-5mg/ml，甘油50-100mg/ml；所述真皮层的水凝胶组成包括海藻酸钠15-35mg/ml，明胶10-35mg/ml，胶原蛋白1-10mg/ml，透明质酸1-10mg/ml，甘油50-100mg/ml；所述皮下组织层的水凝胶组成包括海藻酸钠10-30mg/ml，明胶10-30mg/ml，胶原蛋白1-10mg/ml，透明质酸1-5mg/ml；所述mg/ml指的是相应组分与配制溶液的质量体积比。
2.根据权利要求1所述的皮肤修复支架，其特征在于，所述表皮层、真皮层和皮下组织层的水凝胶中，所述海藻酸钠的部分或全部为氧化海藻酸钠。
3.根据权利要求1所述的皮肤修复支架，其特征在于，所述表皮层、真皮层和皮下组织层均包括抗菌成分。
4.根据权利要求1所述的皮肤修复支架，其特征在于，所述表皮层、真皮层和皮下组织层均包括生长因子，用于促进细胞在皮肤修复支架中的生长增殖；表皮层包括角质细胞生长因子(KGF)或上皮细胞生长因子(EGF)1-10ng/ml，真皮层包括成纤维细胞生长因子(FGF)10-20ng/ml，皮下组织层包括血管内皮生长因子(VEGF)0.1-1.0ng/ml；所述ng/mL指的是相应组分与配制溶液的质量体积比。
5.根据权利要求1所述的皮肤修复支架，其特征在于，还包括覆盖在表皮上面的呈水凝胶形式的致密层，所述致密层的水凝胶组成包括海藻酸钠15-40mg/ml，明胶10-35mg/ml，甘油50-100mg/L，透明质酸1-10mg/ml；所述mg/ml指的是相应组分与配制溶液的质量体积比。
6.根据权利要求1所述的皮肤修复支架，其特征在于，所述表皮层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4-6h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、甘油，在37℃搅拌1-4h溶解混匀，再加入KGF或EGF摇晃混匀；
所述真皮层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4-6h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶、胶原蛋白、甘油，37℃中搅拌1-4h溶解混匀，再加入FGF摇晃混匀；
所述皮下组织层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4-6h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶、胶原蛋白，37℃搅拌1-4h溶解混匀，再加入VEGF摇晃混匀。
7.根据权利要求5所述的皮肤修复支架，其特征在于，所述致密层的水凝胶的配制方法为：将透明质酸溶于PBS中，搅拌4-6h溶解混匀，再加入海藻酸钠、明胶和甘油，37℃中搅拌1-4h溶解混匀。
8.一种制备权利要求1-7任一项所述的一种生物3D打印皮肤修复支架的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将配置好的水凝胶分别装置在不同的打印墨盒中，按照设定好的3D打印皮肤修复支架结构进行逐层打印，依次打印表皮层、真皮层和皮下组织层；
(2)打印过程中实时雾化2％-10％氯化钙溶液进行交联并维持打印结构，打印完成后浸泡在氯化钙溶液中交联10-30min；
(3)用PBS清洗两遍后放入-80℃中冷冻过夜，再将支架放入真空冷冻干燥机中12-48h，冻干完成后使用辐照灭菌的方式灭菌处理。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的设定好的3D打印皮肤修复支架结构为以下任意一种：
①2-6层表皮层，6-20层真皮层，6-20层皮下组织层；所述3D打印的纤维直径为100μm-800μm，3D打印的纤维间距为200-1000μm；所述3D打印层的相邻层的纤维方向呈正交打印；
②2-6层表皮层，6-20层真皮层，6-20层皮下组织层；所述3D打印的纤维直径为100μm-800μm，3D打印的纤维间距为200-1000μm；所述3D打印层的相邻层的纤维方向呈正交打印，间隔层的纤维方向呈错位打印；
③2-6层表皮层，6-20层真皮层，6-20层皮下组织层；所述3D打印的纤维直径为100μm-800μm，连续打印1-3mm宽，然后间隔200-1000μm再连续打印1-3mm宽；所述3D打印层的相邻层的纤维方向呈正交打印。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在打印表皮层之前，还包括先打印1-6层致密层，所述致密层的无孔隙；所述致密层采用挤压打印或喷墨的方式形成。
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