CN112198310A - 一种c反应蛋白和血清淀粉样蛋白a联合检测试纸条、试剂盒及试纸条的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条、试剂盒及试纸条的制备方法。所述试纸条包括底板、样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；结合垫上包被有CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体联合标记的荧光微球、SAA抗体和SAA拓宽鸡抗抗体联合标记的荧光微球；反应垫上形成CRP检测线、SAA检测线，CRP拓宽线和SAA拓宽线。本申请试纸条以及包含试纸条的试剂盒，可以同时定量检测样品中CRP和SAA的含量，灵敏度高、特异性好，检测速度快，而且还具有非常宽的线性范围，CRP线性范围为0.5‑600mg/L，SAA的线性范围为3‑800mg/L，减少了临床上反复稀释样本的操作，提高了临床诊断的效率。

Description

一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条、试剂盒 及试纸条的制备方法
技术领域
本申请涉及免疫分析技术领域，特别涉及一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条、试剂盒及试纸条的制备方法。
背景技术
C反应蛋白（CRP）是机体非特异性免疫机制的一部分，它结合C-多糖，在Ca离子存在时可结合细胞膜上磷酸胆碱，激活补体的经典途经，增强白细胞吞噬作用，清除入侵机体的病原微生物和损伤、坏死、凋亡的组织细胞。
血清淀粉样蛋白A（SAA）是一种急性反应蛋白，在人体健康状态下，其在血浆中含量较低，当机体受到病毒、细菌、支原体等感染后，可在4-6小时内迅速升高约1000倍，但当刺激因子完全消除后会迅速降低直至恢复原来水平。因此，检测人体内的SAA含量可有效的反应出人体机能感染情况及炎症恢复情况。
目前临床上的CRP和SAA联合诊断试纸条中，CRP的线性范围一般在0.5-200mg/L，SAA的线性范围在5-300mg/L。例如，相关技术记载了一种关于CRP和SAA联合检测的试剂盒和检测方法，该试剂盒采用时间分辨免疫层析法，能够同时检测CRP和SAA两个指标，检测快速，定量准确。但是SAA在流感嗜血杆菌、肺炎双球菌或金色葡萄球菌严重感染的细菌性脑膜炎患者中，SAA升高的中位数水平达到800mg/L，是CRP的3.5倍；在急性期细菌性尿路感染的研究中，血清SAA水平在感染的2-3天就可达到800-900mg/L，经过抗生素的有效治疗后，SAA含量迅速下降并恢复至正常水平。而上述试剂盒只有两条检测线和一条质控线，检测的线性范围较窄，对于高值样本无法进行直接检测，需要对样本进行多次倍比稀释再进行上样检测，操作步骤繁琐，大大限制了其应用。所以，目前尚缺少同时具有快速、准确定量、高线性范围等特点的CRP和SAA联合检测试剂盒，用于辅助诊断。
发明内容
针对相关技术中CRP和SAA联合检测试剂盒线性范围较窄的不足，本申请提供一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条、试剂盒及试纸条的制备方法。
第一方面，本申请提供一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条，通过以下技术方案得以实现：
一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条，包括底板以及在底板上依次搭接的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；
所述结合垫上包被有CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体联合标记的荧光微球、SAA抗体和SAA拓宽鸡抗抗体联合标记的荧光微球；
所述反应垫设有两条检测线和两条拓宽线；
两条检测线分别为CRP检测线和SAA检测线，所述CRP检测线包被有CRP检测抗体，所述SAA检测线包被有SAA检测抗体；
两条拓宽线分别为CRP拓宽线和SAA拓宽线，所述CRP拓宽线包被有CRP拓宽羊抗兔抗体，所述SAA拓宽线包被有SAA拓宽羊抗鸡抗体。
通过采用上述技术方案，本申请试纸条能够同时检测样本中的CRP含量和SAA含量，特异性好、灵敏度高、检测速度快，最重要的是本申请试纸条具有非常宽的线性范围，CRP的线性范围为0.5-600mg/L，SAA的线性范围为3-800mg/L，减少了临床上稀释样本的操作步骤，提高了临床诊断效率。
具体的，本申请的结合垫上包被有CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体联合标记的荧光微球以及SAA抗体和SAA拓宽鸡抗抗体联合标记的荧光微球。反应垫设有两条检测线和两条拓宽线，两条检测线靠近结合垫一侧，两条拓宽线靠近吸水垫一侧。两条检测线上分别包被有CRP检测抗体和SAA检测抗体；两条拓宽线上分别包被有CRP拓宽羊抗兔抗体和SAA拓宽羊抗鸡抗体。
本申请所述拓宽线是指含有相应抗体的喷涂在反应垫上的划线，其能够拓宽样本中目标抗原检测范围且起到质控作用。本申请拓宽线的设置不仅能够拓宽试纸条对样本中抗原浓度的检测范围，而且还能够起到质控的作用，无论检测样本是否存在待测抗原，拓宽线中的抗抗体均能与结合垫中的抗体结合，显示出荧光，从而证明本申请检测体系检测结果的有效性。
本申请检测线包被的抗体和结合垫上标记的抗体分别具有不同的抗原结合位点，也就是说，本申请的CRP抗体和CRP检测抗体均能与CRP抗原结合，从而形成抗体-抗原-抗体的复合物，同理，SAA抗体和SAA检测抗体均能与SAA抗原结合形成抗体-抗原-抗体复合物。同时，本申请的CRP拓宽羊抗兔抗体和CRP拓宽兔抗抗体可以特异性结合，SAA拓宽羊抗鸡抗体和SAA拓宽鸡抗抗体可以特异性结合。本申请中的不同抗体之间互补干扰，整个检测体系可以正常有序的运行。
本申请采用CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体联合标记荧光微球，CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体均结合在荧光微球表面。当CRP抗体与样本中的CRP抗原以及CRP检测抗体结合后，大部分荧光微球滞留在检测线处，从而使检测线处的荧光强度增强，当检测线上的CRP检测抗体与CRP抗原以及CRP抗体的结合达到饱和后，少量带有荧光微球的CRP拓宽兔抗抗体才会与CRP拓宽羊抗兔抗体结合，在扩宽线处显示出较弱的荧光强度。本申请以检测线的荧光强度与拓宽线的荧光强度比值为自变量，计算得到样本的CRP浓度，当检测线的荧光强度增强，而拓宽线的荧光强度减弱，自变量数值变大，从而可以检测高浓度的CRP样本。本申请可以检测较高浓度的SAA样本的原理与CRP相同。综上所述，本申请试纸条能够同时检测样本中较高浓度的CRP和SAA，具有非常宽的线性范围。
可选的，所述荧光微球为含有荧光物质的聚苯乙烯微球，所述荧光物质选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、Cy3、Cy5、枣红蛋白、量子点中的一种。优选的，本申请的荧光物质选用量子点。
通过采用上述技术方案，本申请选用的荧光物质均可以在固定波长下发出荧光，从而起到指示实验结果的作用，尤其是量子点，其激发光是340nm，发射光为610nm，斯托克斯位移（Stokes位移）大，吸收和发射光谱之间重叠小，避免了能量转移而导致的荧光效率降低，信号干扰小。
可选的，所述荧光微球的粒径为20nm~600nm，发射波长500nm~700nm。
通过采用上述技术方案，本申请荧光微球的粒径限制在20nm~600nm，具有较大的比表面积，从而可以有效的与抗体结合。本申请荧光微球的发射波长为500nm~700nm，其发出的荧光信号可以更准确的被仪器所监测到，提高了实验结果的准确性。
可选的，样品垫选用玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜制成；所述结合垫选用玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜制成；反应垫选用硝酸纤维素膜制成；吸水垫选用棉麻或聚酯纤维材料制成；所述底板选用PVC材质制成。
通过采用上述技术方案，本申请的样品垫和结合垫均由玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜制成，这两种膜具有较低的吸水率，能够降低滴在其上的待测样品的损失率，而且便于样品层析到反应垫上发生复合反应。本申请的反应垫选用硝酸纤维素膜制成，其具有良好的层析性能和较强的蛋白吸附能力，从而提高了检测结果的准确性。本申请的吸水垫棉麻或聚酯纤维材料制成，能够促使检测样本在毛细作用下从样品垫层析至反应垫发生反应。本申请的底板采用PVC材质制成，其具有较好的附着性，易于将底板与其上的衬垫材料粘附结合。
第二方面，本申请提供了一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试剂盒，采用以下技术方案得以实现：
一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试剂盒，包括上述C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条。
可选的，所述试剂盒还包括装载C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条的卡壳。优选的，卡壳选用塑料材质制成。
通过采用上述技术方案，本申请试剂盒不仅具有可以同时检测CRP和SAA，高灵敏度、高特异性和快速检测的优点，而且还具有非常宽的线性范围，减少了临床上稀释样本检测操作，极大便利了临床使用。另外，在试纸条外设置卡壳，一方面，保证了试纸条不被污染，从而保证了试纸条上抗体的有效性，另一方面，包覆卡壳的试纸条更加便于储存、运输和销售。
第三方面，本申请提供了一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条的制备方法，采用以下技术方案得以实现：
一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
S1.取荧光微球加入到pH4.0~8.0 的10~100mM MES缓冲溶液中，荧光微球的浓度为0.025-3mg/mL，然后加入5~50ug EDC，活化10~30min，离心弃去上清，沉淀用pH 6.0~9.0的10~100mM MES缓冲液重悬，得到活化的荧光微球溶液；
S2.将1~100ug CRP抗体和1~100ugCRP拓宽兔抗抗体加入到0.001~1mg/mL步骤S1制备的荧光微球溶液中，混匀，离心弃去上清，沉淀用含0.1~5%酪蛋白的10~100mM甘氨酸溶液封闭，摇匀，离心，沉淀用含有 0.1~5%BSA的10~100mM Tris缓冲液分散，得到浓度为0.01mg/mL的CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体联合标记的荧光微球溶液；
S3.采用与步骤S2相同的方法获得浓度为0.01mg/mL的SAA抗体和SAA拓宽鸡抗抗体联合标记的荧光微球溶液；
S4.将步骤S2和步骤S3制备得到的含有抗体的荧光微球溶液按1:（0.2~15）的比例混合，将荧光微球混合液按照0.1~4μL/cm喷涂在结合垫上并干燥，得到成品结合垫；
S5. 将CRP检测抗体、SAA检测抗体、CRP拓宽羊抗兔抗体和SAA拓宽羊抗鸡抗体分别稀释到0.1~5mg/mL，以0.1~3.0μL/cm的喷量喷涂在反应垫上，分别形成CRP检测线、SAA检测线、CRP拓宽线和SAA拓宽线，干燥得到成品反应垫；
S6. 将样品垫、步骤S4获得的结合垫、步骤S5获得的反应垫和吸水垫依次搭接并固定在底板上，得到C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条。
通过采用上述技术方案，本申请首先将荧光微球活化，然后向活化的荧光微球中加入CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体。本申请的荧光微球的表面修饰有官能团，官能团选自羧基、氨基或醛基中的一种。CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体通过EDC与荧光微球上的官能团连接，从而获得CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体联合标记的荧光微球溶液。然后本申请将CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体联合标记的荧光微球溶液与采用相同方法制备的SAA抗体和SAA拓宽鸡抗抗体联合标记的荧光微球溶液混合，并采用定量喷膜仪将荧光微球混合液喷涂到结合垫上，获得结合垫成品。另外，本申请将CRP检测抗体、SAA检测抗体、CRP拓宽羊抗兔抗体和SAA拓宽羊抗鸡抗体分别稀释并对应的喷涂到反应垫不同区域，获得具有两条检测线和两条拓宽线的反应垫成品。最后，将样品垫、制备的结合垫、制备的反应垫和吸水垫依次搭接并固定在底板上，保持各片材有1.0~3.0mm的重合，然后裁剪成长度为4.0~10.0cm，宽度为3.0~5.0mm的试纸条。整个试纸条制备过程简单，制备获得的试纸条能够特异性的定量检测样本中的CRP和SAA含量，实验结果准确、稳定、可靠。
可选的，步骤S1、S2中，离心条件为10000~20000rpm离心10~30min。
通过采用上述技术方案，本申请严格控制试纸条制备过程中的离心条件，较高的离心转速可以将所需组分都沉淀到离心管底部，降低了整个制备过程中的原料损失率。
可选的，步骤S2中，CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体以及荧光微球的混匀条件为22-28℃混匀1~5h。
通过采用上述技术方案，本申请将CRP抗体、CRP拓宽兔抗抗体以及荧光微球在一定条件下充分混匀，可以使CRP抗体、CRP拓宽兔抗抗体充分的负载在荧光微球上，保证了制备获得试纸条能够具有较宽的检测范围，达到预期的技术效果。
可选的，步骤S2中，CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体以及荧光微球用含酪蛋白的甘氨酸溶液封闭后，在转速为100~300rpm/min条件下摇匀0.1~2h。
通过采用上述技术方案，本申请将CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体以及荧光微球用含酪蛋白的甘氨酸溶液封闭后缓慢摇匀一段时间，可以有效降低抗体的非特异性结合，从而得到更加清晰的背景。
可选的，步骤S4、S5中，干燥条件为30~60℃干燥1~24h。
通过采用上述技术方案，本申请严格控制反应垫和结合垫的干燥温度和时间，过高的干燥温度，容易使抗体失活，无法达到检测效果；而过低的干燥温度，可能达不到干燥效果，衬垫容易滋生有害微生物，影响实验结果的准确性。
可选的，步骤S4中，在荧光微球混合液喷涂在结合垫之前，结合垫进行预处理操作；所述结合垫预处理的方法为：将结合垫铺平，在结合垫处理液中静置1~10min，然后在30~60℃烘干1~24h；所述处理液包含以下组分：10~100mM Tris, 1%-30% 蔗糖，0.1~2%吐温-20，1%~10% BSA，pH 7.4~9.0。优选的，结合垫处理液的使用量为10-30mL。
通过采用上述技术方案，本申请在荧光微球混合液喷涂在结合垫之前，对结合垫进行预处理将其浸泡在结合垫处理液中，可以使结合垫上的微球更好的释放和显色。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请可以直接同时检测样本中较高浓度的CRP和SAA，不需要多次稀释样品，减少了检测操作步骤，提高了临床诊断效率；
2、本申请可以定量检测样本中CRP和SAA含量，特异性强、灵敏度高，检测结果准确、稳定、可靠。
附图说明
图1是本申请试纸条的结构示意图；
图2是本申请试剂盒的结构示意图；
图3是本申请实施例1试纸条检测CRP浓度与理论浓度的相关性图；
图4是本申请实施例2试纸条检测CRP浓度与理论浓度的相关性图；
图5是本申请实施例1试纸条检测SAA浓度与理论浓度的相关性图；
图6是本申请实施例2试纸条检测SAA浓度与理论浓度的相关性图；
图7是本申请实施例1试纸条检测样本中CRP浓度与西门子系统检测样本中CRP浓度的相关性图；
图8是本申请实施例1试纸条检测样本中SAA浓度与西门子系统检测样本中SAA浓度的相关性图。
附图标记：1.样品垫；2.结合垫；3.反应垫；4.吸水垫；5.底板；6.CRP检测线；7.SAA检测线；8.CRP拓宽线；9.SAA拓宽线；10.加样孔；11.卡壳。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请实施例公开了一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条，如图1所示，所述试纸条包括底板5、样品垫1、结合垫2、反应垫3和吸水垫4；样品垫1搭在结合垫2上，结合垫2搭在反应垫3左侧，吸水垫4搭在反应垫3右侧，搭接处重复2mm，反应垫3贴在底板5上。
所述结合垫2上包被有CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体联合标记的荧光微球、SAA抗体和SAA拓宽鸡抗抗体联合标记的荧光微球；所述荧光微球为量子点聚苯乙烯微球，发射波长610nm，粒径为20nm~600nm。
所述反应垫3从样品垫1一侧到吸水垫4一侧依次设有CRP检测线6，SAA检测线7，CRP拓宽线8和SAA拓宽线9。
所述CRP检测线6包被有CRP检测抗体，所述SAA检测线7包被有SAA检测抗体；所述CRP拓宽线8包被有CRP拓宽羊抗兔抗体，所述SAA拓宽线9包被有SAA拓宽羊抗鸡抗体。
本申请实施例还公开了一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试剂盒，如图2所示，所述试剂盒包括试纸条以及包覆在试纸条外的卡壳11，在卡壳11与试纸条样品垫1对应位置上形成加样孔10，在卡壳11与两条检测线和两条拓宽线对应位置上形成观察窗，便于观察以及荧光信号的采集。另外，本申请试剂盒中还可以包括CRP和SAA的标准曲线，从而便于样本中CRP和SAA浓度的计算。
样品检测时，将液体样本滴加至样品垫1，在毛细作用下，液体向吸水垫4一端层析，在层析过程中，液体标本中的CRP抗原与结合垫2上的CRP抗体结合形成CRP抗原-抗体复合物，同时液体标本中的SAA抗原与结合垫2上的SAA抗体结合形成SAA抗原-抗体复合物，随后混合物继续层析到反应垫3上，反应垫3上的CRP检测抗体可与CRP抗原-抗体复合物结合，形成CRP抗体-抗原-抗体复合物，同时SAA检测抗体与SAA抗原-抗体复合物结合形成SAA抗体-抗原-抗体复合物，从而在两条检测线上显示出较强的荧光。当CRP抗体-抗原-抗体复合物、SAA抗体-抗原-抗体复合物的形成达到饱和后，少量处于游离状态的偶联有CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体的荧光微球以及偶联有SAA抗体和SAA拓宽鸡抗抗体的荧光微球会进一步迁移到反应垫3的扩宽线处，使CRP拓宽兔抗抗体与CRP拓宽羊抗兔抗体结合，SAA拓宽鸡抗抗体与SAA拓宽羊抗鸡抗体，在扩宽线处显示出较弱的荧光。收集检测线和拓宽线处的荧光信号，然后计算CRP检测线与CRP拓宽线荧光强度的比值，并将其带入对应的标准曲线内，最终获得样本中CRP的浓度值；同样的，计算SAA检测线与SAA拓宽线荧光强度的比值，并将其带入对应的标准曲线内，最终获得样本中SAA的浓度值。
本申请的一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条采用以下实施例制备，实施例中所采用的抗体来源如下：
本申请的CRP检测抗体为申基生物科技有限公司生产，克隆号为5D3；
本申请的SAA检测抗体为申基生物科技有限公司生产，克隆号为1A6；
本申请的CRP拓宽羊抗兔抗体为申基生物科技有限公司生产；
本申请的SAA拓宽羊抗鸡抗体为申基生物科技有限公司生产；
本申请的CRP抗体为申基生物科技有限公司生产，克隆号为2A7；
本申请的CRP拓宽兔抗抗体为申基生物科技有限公司生产，克隆号为3D1；
本申请的SAA抗体为申基生物科技有限公司生产，克隆号为4F3；
本申请的SAA拓宽鸡抗抗体为申基生物科技有限公司生产，克隆号为6G3。
制备例1
pH4.0 10mmol/L MES缓冲液的配制：称量1.95g MES于烧杯中，加入纯化水900mL，搅拌混匀后，用NaOH溶液调pH至4.0，然后定容到1L，4℃保存备用。
制备例2
pH8.0 100mmol/L MES缓冲液的配制：称量19.5g MES于烧杯中，加入纯化水900mL，搅拌混匀后，用NaOH溶液调pH至8.0，然后定容到1L，4℃保存备用。
制备例3
含0.1%酪蛋白的10mM甘氨酸溶液的配制：称取0.75g甘氨酸和1g 酪蛋白，加入纯化水900mL，搅拌混匀后，用NaOH溶液调pH至8.0，然后定容到1L，4℃保存备用。
制备例4
含5%酪蛋白的100mM甘氨酸溶液的配制：称取7.5g甘氨酸和50g 酪蛋白，加入纯化水900mL，搅拌混匀后，用NaOH溶液调pH至8.0，然后定容到1L，4℃保存备用。
制备例5
pH 4.0 含0.1%BSA的10mM Tris缓冲液的配制：称量1.21g Tris，1g BSA加入烧杯中，先加入900mL纯水溶解，搅拌混匀后，调pH至4.0，再用1L纯化水定容， 4℃保存备用。
制备例6
pH 8.0 含5%BSA的100mM Tris缓冲液的配制：称量12.1g Tris，50g BSA加入烧杯中，先加入900mL纯水溶解，搅拌混匀后，调pH至8.0，再用1L纯化水定容， 4℃保存备用。
制备例7
结合垫处理液配制：称量1.21g Tris，10g BSA，10g蔗糖和1mL吐温-20加入烧杯中，先加入900mL纯水溶解，搅拌混匀后，调pH至7.4，再用1L纯化水定容， 4℃保存备用。
制备例8
结合垫处理液配制：称量12.1g Tris，100g BSA，300g蔗糖和20mL吐温-20加入烧杯中，先加入900mL纯水溶解，搅拌混匀后，调pH至9.0，再用1L纯化水定容， 4℃保存备用。
制备例9
样本稀释液的配制：称量2.865g的Na2HPO4·12H2O于烧杯中，依次称取0.272gNa2HPO4·12H2O、7.948g NaCl、1mL吐温-20、5g BSA加入上述烧杯中，用1L纯化水定容，搅拌混匀后，调pH至7.4，4℃保存备用。
实施例1
一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
S1.取5μL荧光微球（原浓度10mg/mL）加入到2mL制备例1制备获得的pH4.0 10mmol/LMES缓冲溶液中，然后加入5ug EDC，活化10min，10000rpm离心30min，弃去上清，沉淀用pH6.0 10mmol/L MES缓冲液重悬，得到活化的荧光微球溶液；
S2.将1ug CRP抗体和1ugCRP拓宽兔抗抗体加入到0.1mL1mg/mL步骤S1制备的荧光微球溶液中，22℃混匀1h，10000rpm离心30min，弃去上清，沉淀用制备例3制备获得的含0.1%酪蛋白的10mM甘氨酸溶液封闭，放置于摇床100rpm，摇匀2小时，10000rpm离心30min，沉淀用制备例5制备的pH 4.0 含0.1%BSA的10mM Tris缓冲液分散，得到浓度为0.01mg/mL的CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体联合标记的荧光微球溶液；
S3.采用与步骤S2相同的方法获得浓度为0.01mg/mL的SAA抗体和SAA拓宽鸡抗抗体联合标记的荧光微球溶液；
S4.将步骤S2和步骤S3制备得到的含有抗体的荧光微球溶液按1:0.2的比例混合，将荧光微球混合液按照0.1μL/cm喷涂在预处理后的结合垫上，30℃干燥24h，得到成品结合垫2；
所述结合垫预处理的方法为：将结合垫铺平，在10mL制备例7制备得到的结合垫处理液中静置1min，然后在60℃烘干1h；
S5.将CRP检测抗体、SAA检测抗体、CRP拓宽羊抗兔抗体和SAA拓宽羊抗鸡抗体分别稀释到0.1mg/mL，以0.1μL/cm的喷量喷涂在反应垫上，分别形成CRP检测线、SAA检测线、CRP拓宽线和SAA拓宽线，划好线的反应垫放置在30℃烘箱中干燥24h，得到成品反应垫3；
S6. 将样品垫1、步骤S4获得的结合垫2、步骤S5获得的反应垫3和吸水垫4依次搭接粘贴在底板5上，保持各片材有1.0mm的重合，然后裁剪成长度为4.0cm，宽度为3.0mm的试纸条，得到C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条。
S7. 标准曲线的制备
取10μL对应浓度的定标液（CRP定标液为含有CRP抗原的PBS溶液、SAA定标液为含有SAA抗原的PBS溶液）样本，加入到1mL制备例9制备的样本稀释液中，将80μL稀释后溶液加至本申请实施例1的联合检测试纸条的样品垫上，3min后将试纸条置于荧光免疫分析仪下，检测两条检测线和两条拓宽线的荧光强度，一共有6支定标液，每支定标液检测3次，取平均值，然后根据CRP检测线与CRP拓宽线的荧光强度的比值和定标液的浓度绘制CRP曲线，同时根据SAA检测线与SAA拓宽线的荧光强度的比值和定标液浓度绘制SAA曲线，其中CRP曲线和SAA的曲线均为3次方程，其中信号值为自变量，浓度值为因变量，数据见表1；
CRP标准曲线为：y = 2.01E-03x3 - 7.74E-02x2 + 1.03E+01x - 8.68E-01，R2=1>0.97
SAA标准曲线为：y = 7.19E-02x3+4.49E-01x2+4.57E+01x +1.84E+00，R2=1>0.97
以上两条标准曲线R2>0.97，拟合度非常好，以其作为定标公式，可以提高实验检测结果的准确性。
表1实施例1试纸条标准曲线数据
Figure 191891DEST_PATH_IMAGE001
实施例2
一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
S1.取30μL荧光微球（原浓度10mg/mL）加入到0.1mL制备例2制备获得的pH8.0100mmol/L MES缓冲溶液中，然后加入50ug EDC，活化30min，20000rpm离心10min，弃去上清，沉淀用pH 9.0 100mmol/L MES缓冲液重悬，得到活化的荧光微球溶液；
S2.将100ug CRP抗体和100ugCRP拓宽兔抗抗体加入到2mL 0.001mg/mL步骤S1制备的荧光微球溶液中，28℃混匀5h，20000rpm离心10min，弃去上清，沉淀用制备例4制备获得的含5%酪蛋白的100mM甘氨酸溶液封闭，放置于摇床300rpm，摇匀0.1小时，20000rpm离心10min，沉淀用制备例6制备的pH 8.0 含5%BSA的100mM Tris缓冲液分散，得到浓度为0.01mg/mL的CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体联合标记的荧光微球溶液；
S3.采用与步骤S2相同的方法获得浓度为0.01mg/mL的SAA抗体和SAA拓宽鸡抗抗体联合标记的荧光微球溶液；
S4.将步骤S2和步骤S3制备得到的含有抗体的荧光微球溶液按1:15的比例混合，将荧光微球混合液按照4μL/cm喷涂在预处理后的结合垫上，60℃干燥1h，得到成品结合垫2；
所述结合垫预处理的方法为：将结合垫铺平，在30mL制备例8制备得到的结合垫处理液中静置10min，然后在30℃烘干24h；
S5.将CRP检测抗体、SAA检测抗体、CRP拓宽羊抗兔抗体和SAA拓宽羊抗鸡抗体分别稀释到5mg/mL，以3μL/cm的喷量喷涂在反应垫上，分别形成CRP检测线、SAA检测线、CRP拓宽线和SAA拓宽线，划好线的反应垫放置在60℃烘箱中干燥1h，得到成品反应垫3；
S6. 将样品垫1、步骤S4获得的结合垫2、步骤S5获得的反应垫3和吸水垫4依次搭接粘贴在底板5上，保持各片材有3.0mm的重合，然后裁剪成长度为10.0cm，宽度为5.0mm的试纸条，得到C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条。
S7. 标准曲线的制备
取10μL对应浓度的定标液（CRP定标液为含有CRP抗原的PBS溶液、SAA定标液为含有SAA抗原的PBS溶液）样本，加入到1mL制备例9制备的样本稀释液中，将80μL稀释后溶液加至本申请实施例2的联合检测试纸条的样品垫上，3min后将试纸条置于荧光免疫分析仪下，检测两条检测线和两条拓宽线的荧光强度，一共有6支定标液，每支定标液检测3次，取平均值，然后根据CRP检测线与CRP拓宽线的荧光强度的比值和定标液的浓度绘制CRP曲线，同时根据SAA检测线与SAA拓宽线的荧光强度的比值和定标液浓度绘制SAA曲线，其中CRP曲线和SAA的曲线为3次方程，其中信号值为自变量，浓度值为因变量，数据见表2；
CRP标准曲线为:y=2.29970E-03x3-1.02909E-01x2+9.49003E+00x-1.13560E+00，R2=0.99>0.97
SAA标准曲线为:y=1.78450E-01x3+1.50971E+00x2+3.09654E+01x+5.98888E-01，R2=0.99>0.97
以上两条标准曲线R2>0.97，拟合度非常好，以其作为定标公式，可以提高实验检测结果的准确性。
表2实施例2试纸条标准曲线数据
Figure 954704DEST_PATH_IMAGE002
性能检测实验
1.对CRP和SAA联合检测试纸条的线性评价实验
（1）将接近线性范围上限的高浓度CRP样品（550-650mg/L）和接近线性范围下限的CRP低浓度样品（0.1-1.0mg/L）按一定比例混合得到8种浓度梯度样本，样本浓度分别为610.82、305.41、101.80、33.93、11.31、3.77、1.26、0.42mg/L，分别取10μL上述浓度样本，加入到1mL制备例9制备的样本稀释液中，再取80μL稀释后样品分别加至本申请实施例1和实施例2的试纸条上，3min后将试纸条置于荧光免疫分析仪下，检测CRP检测线和CRP拓宽线的荧光强度，然后将CRP检测线与CRP拓宽线荧光强度的比值带入上述相应的CRP曲线中，得出相应的浓度值，每一浓度样品重复检测3次，计算浓度平均值，将浓度平均值和理论浓度值做线性方程计算相关系数（参见图3、图4）。检测数据参见表3。
表3 CRP线性梯度数据（mg/L）
Figure 203283DEST_PATH_IMAGE003
从表3以及图3和4可以看出，本申请实施例1试纸条的线性相关系数r＞0.99，线性方程y = 0.9858x-2.0151，CRP的线性检测范围为0.5-600mg/L。本申请实施例2试纸条的线性相关系数r＞0.99，线性方程y= 1.0087x -0.7175，CRP的线性检测范围为0.5-600mg/L。实验结果表明，本申请试纸条检测样本中CRP含量时，不用做多次稀释，便可直接对较宽浓度范围的样本进行检测，且检测结果与理论值具有很好的吻合度，实验结果准确、可靠，操作步骤简便。
（2）将接近线性范围上限的高浓度SAA样品（750-850mg/L）和接近线性范围下限的SAA低浓度样品（1.0-5.0mg/L）按一定比例混合得到9种浓度梯度样本，样本浓度分别为808.46、404.23、202.12、101.06、50.53、25.26、12.63、6.32、3.16mg/L，分别取10μL上述浓度样本，加入到1mL制备例9制备的样本稀释液中，再取80μL稀释后样品分别加至本申请实施例1和实施例2的试纸条上，3min后将试纸条置于荧光免疫分析仪下，检测SAA检测线和SAA拓宽线的荧光强度，然后将SAA检测线与SAA拓宽线荧光强度的比值带入上述相应的SAA曲线中，得出相应的浓度值，对每一浓度样品重复检测3次，计算其平均值，将结果平均值和检测浓度做线性方程计算相关系数（参见图5、图6）。检测数据参见表4。
表4 SAA线性梯度数据（mg/L）
Figure 332913DEST_PATH_IMAGE004
从表4以及图5和6可以看出，本申请实施例1试纸条的线性相关系数r＞0.99，线性方程y = 0.9902x-4.8566，CRP的线性检测范围为3-800mg/L。本申请实施例2试纸条的线性相关系数r＞0.99，线性方程y=0.9993x-2.9995，CRP的线性检测范围为3-800mg/L。实验结果表明，本申请试纸条检测样本中SAA含量时，不用做多次稀释，便可直接对较宽浓度范围的样本进行检测，且检测结果与理论值具有很好的吻合度，实验结果准确、可靠，操作步骤简便。
2. 临床样本测试
采用本申请实施例1试纸条与西门子系统及其配套CRP和SAA试剂对血样样本进行测试并比对，其中西门子检测系统大于线性范围的样本通过倍比稀释定值。采用本申请实施例1试纸条，将10μL样本加入到1mL制备例9制备的样本稀释液中，再取80μL稀释后的样本加至样品垫上，3min后将试纸条置于荧光免疫分析仪下，检测CRP检测线和CRP拓宽线的荧光强度，然后将CRP检测线与CRP拓宽线荧光强度的比值带入上述CRP曲线中得出浓度值，SAA浓度值的测定采用相同的方法。实验结果参见表5、图7以及表6、图8。
表5 CRP临床样本比对结果
Figure 740760DEST_PATH_IMAGE005
表6 SAA临床样本比对结果
Figure 32064DEST_PATH_IMAGE006
从表5、图7可以看出，采用本申请试纸条测定样本中CRP浓度的测定结果与采用西门子仪器及配套试剂盒测定结果相比，二者的相关系数R2=0.9951，线性方程为y=1.0089x-0.3374，实验结果表明，本申请试纸条与西门子检测系统相关性良好，可替代西门子检测系统用于临床诊断。
从表6和图8可以看出，采用本申请试纸条测定样本中SAA浓度的测定结果与采用西门子仪器及配套试剂盒测定结果相比，二者的相关系数R2=0.992，线性方程为y=0.9886x-0.3983，实验结果表明，本申请试纸条与西门子检测系统相关性良好，可替代西门子检测系统用于临床诊断。
本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条，其特征在于：包括底板（5）以及在底板（5）上依次搭接的样品垫（1）、结合垫（2）、反应垫（3）和吸水垫（4）；
所述结合垫（2）上包被有CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体联合标记的荧光微球、SAA抗体和SAA拓宽鸡抗抗体联合标记的荧光微球；
所述反应垫（3）设有两条检测线和两条拓宽线；
两条检测线分别为CRP检测线（6）和SAA检测线（7），所述CRP检测线（6）包被有CRP检测抗体，所述SAA检测线（7）包被有SAA检测抗体；
两条拓宽线分别为CRP拓宽线（8）和SAA拓宽线（9），所述CRP拓宽线（8）包被有CRP拓宽羊抗兔抗体，所述SAA拓宽线（9）包被有SAA拓宽羊抗鸡抗体。
2.根据权利要求1所述的一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条，其特征在于：所述荧光微球为含有荧光物质的聚苯乙烯微球，所述荧光物质选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、Cy3、Cy5、枣红蛋白、量子点中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条，其特征在于：所述荧光微球的粒径为20nm~600nm，发射波长500nm~700nm。
4.一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-3任一所述的C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条。
5.一种权利要求1-3任一所述的C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取荧光微球加入到pH4.0~8.0 的10~100mM MES缓冲溶液中，荧光微球的浓度为0.025-3mg/mL，然后加入5~50ug EDC，活化10~30min，离心弃去上清，沉淀用pH 6.0~9.0的10~100mM MES缓冲液重悬，得到活化的荧光微球溶液；
S2.将1~100ug CRP抗体和1~100ugCRP拓宽兔抗抗体加入到0.001~1mg/mL步骤S1制备的荧光微球溶液中，混匀，离心弃去上清，沉淀用含0.1~5%酪蛋白的10~100mM甘氨酸溶液封闭，摇匀，离心，沉淀用含有 0.1~5%BSA的10~100mM Tris缓冲液分散，得到浓度为0.01mg/mL的CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体联合标记的荧光微球溶液；
S3.采用与步骤S2相同的方法获得浓度为0.01mg/mL的SAA抗体和SAA拓宽鸡抗抗体联合标记的荧光微球溶液；
S4.将步骤S2和步骤S3制备得到的含有抗体的荧光微球溶液按1:（0.2~15）的比例混合，将荧光微球混合液按照0.1~4μL/cm喷涂在结合垫上并干燥，得到成品结合垫（2）；
S5. 将CRP检测抗体、SAA检测抗体、CRP拓宽羊抗兔抗体和SAA拓宽羊抗鸡抗体分别稀释到0.1~5mg/mL，以0.1~3.0μL/cm的喷量喷涂在反应垫上，分别形成CRP检测线、SAA检测线、CRP拓宽线和SAA拓宽线，干燥得到成品反应垫（3）；
S6. 将样品垫（1）、步骤S4获得的结合垫（2）、步骤S5获得的反应垫（3）和吸水垫（4）依次搭接并固定在底板（5）上，得到C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条。
6.根据权利要求5所述的一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤S1、S2中，离心条件为10000~20000rpm离心10~30min。
7.根据权利要求5所述的一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤S2中，CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体以及荧光微球的混匀条件为22-28℃混匀1~5h。
8.根据权利要求5所述的一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤S2中，CRP抗体和CRP拓宽兔抗抗体以及荧光微球用含酪蛋白的甘氨酸溶液封闭后，在转速为100~300rpm/min条件下摇匀0.1~2h。
9.根据权利要求5所述的一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤S4、S5中，干燥条件为30~60℃干燥1~24h。
10. 根据权利要求5所述的一种C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A联合检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤S4中，在荧光微球混合液喷涂在结合垫之前，结合垫进行预处理操作；所述结合垫预处理的方法为：将结合垫铺平，在结合垫处理液中静置1~10min，然后在30~60℃烘干1~24h；所述处理液包含以下组分：10~100mM Tris, 1%-30% 蔗糖，0.1~2%吐温-20，1%~10% BSA，pH7.4~9.0。
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