CN112159793A - 人脱落乳牙牙髓干细胞的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多能干细胞领域，尤其涉及间充质干细胞(MSC)的细胞培养及其在治疗自闭症中的制药用途；所述间充质干细胞可以为人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。本发明率先使用SHED治疗BTBR自闭症小鼠模型，结果表明SHED对改善ASD小鼠的社交行为及异常的焦虑模式有显著疗效，可以作为ASD治疗的有效新方法。
Description
技术领域
本发明涉及多能干细胞领域，尤其涉及间充质干细胞(MSC)的细胞治疗。
背景技术
自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder，ASD)，也称作自闭谱系障碍，病征包括异常的语言能力、异常的交往能力、狭窄的兴趣以及固执的行为模式，主要表现为社交障碍和刻板行为，是我国儿童精神类疾病中的第一大疾病，也是最为严重的一种。目前中国ASD患者已超过1000万，患病率仍在不断上升。ASD的确切致病原因及发病机制尚不明确，难度大，无针对性的有效药物，行为学训练仍是目前最常用的干预手段，但只能对部分特定年龄的患者起到改善作用且训练效果难以预测。
相较于骨髓来源的间充质干细胞MSC(BMMSC)，口腔颌面组织来源的间充质干细胞MSC包括人脱落乳牙牙髓干细胞，发育于早期外胚叶间充质头部的神经嵴细胞。这类细胞不仅具有MSC的一般特征，还具其独有的特点，包括比BMMSC(骨髓间充质干细胞)具有更高的增殖率，更好的成神经分化和免疫调节能力，这为神经系统疾病的治疗带来了新的可能。而且，口腔颌面组织来源的MSC易于获取，数量可观，符合伦理，成为近些年干细胞研究领域的热点。体内研究表明，人脱落乳牙牙髓干细胞(Stem cells from human exfoliateddeciduous teeth，SHED)具有较强的成神经细胞分化能力，在神经系统的定植存活和少突胶质细胞定向分化潜能方面优势显著，体外研究显示，SHED比牙髓干细胞表达更多的神经元标志物，具有更强的神经样细胞分化能力；同时，SHED能分泌神经营养因子，如神经生长因子(Neuro growth factor,NGF)，脑源性神经营养因子(Brain derivedneuotrophicfactor，BDNF)，神经营养因子-3(neuotrophin-3，NT-3)等，这些营养因子可能更有利于脑内微环境的重塑及促进神经细胞的修复再生；此外，在免疫调节方面，适当条件下，SHED培养物可以使小胶质细胞巨噬细胞由促炎性M1型转变为抗炎性M2型，并且抑制CD4+T细胞的增殖及细胞促炎因子的释放。提示SHED可能具有更强的神经系统疾病治疗的潜力。
近年来，本申请的发明人团队在口腔颌面干细胞领域的研究成果卓越，率先分离并鉴定了SHED，同时证明了，与骨髓来源的间充质干细胞相比，SHED具有更高的增殖率，更好的成神经分化能力和免疫调节功能，并且表达口腔颌面干细胞特异性膜标记物程序性死亡受体(Programmed cell death protein 1，PD1)；并且进一步将前期研究成果应用于临床试验，首次利用牙髓干细胞在临床上功能性的再生牙髓；首创利用SHED治疗系统性红斑狼疮患者，并取得显著疗效。这些研究成果均为SHED在神经系统疾病治疗中的有效性，安全性评价及其机制的探索研究打下了坚实的基础。
发明内容
本发明利用SHANK3+/-比格犬基因编辑模型及BTBR小鼠模型开展人脱落乳牙牙髓干细胞治疗自闭症谱系障碍的有效性评价研究，结果证实，多次SHED静脉注射治疗后，比格犬及小鼠的自闭症特征均不同程度减轻，显示了SHED在ASD治疗中的巨大潜力。
第一方面，本发明提供了人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)的培养方法，所述方法包括：
(1)将分离的人乳牙牙髓用胶原酶和/或中性蛋白酶进行消化，加入培养液终止反应，离心后加入培养液重悬，接种于细胞培养皿；以及
(2)于37℃、5％CO2培养24小时后吸除未贴壁细胞，清洗后加入培养液继续培养10天，获得密集的P0集落，
所述培养液包含85％的α-MEM和15％FBS。
采用本发明的无血清培养液，人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)可以聚集形成球样的干细胞团。
将P0集落进行1-5代的传代，分别命名为P1，P2，P3，P4和P5代，收集汇合率达90％以上的细胞。
第二方面，本发明提供了间充质干细胞在制备用于治疗对象的自闭症或自闭症相关症状的药物中的应用。
优选地，所述间充质干细胞为骨髓来源的间充质干细胞，脐带间充质干细胞，脂肪间充质干细胞或牙髓来源的间充质干细胞。优选地，所述牙髓来源的间充质干细胞为人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。
优选地，本发明提供了人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)在制备用于改善与同类和异类之间的社交行为的药物中的应用。
优选地，本发明提供了人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)在制备用于缓解焦虑症状的药物中的应用。
优选地，本发明提供了人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)在制备用于改善对外界因素感受性的药物中的应用。
优选地，本发明提供了人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)在制备用于改善社交选择性的药物中的应用。
优选地，本发明提供了人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)在制备用于改善社交压力的药物中的应用。
优选地，本发明提供了人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)在制备用于降低血清中γ-干扰素以及TGF-β1的药物中的应用。
所述间充质干细胞，优选地，所述人脱落乳牙牙髓干细胞可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾的形式。
所述间充质干细胞，优选地，所述人脱落乳牙牙髓干细胞可以制备成适于注射的形式。所述注射可以为静脉注射或皮下注射。
所述对象可以为哺乳动物，例如啮齿类动物，灵长类动物，宠物动物等，例如马，犬，猫，人类，猴子，黑猩猩，大猩猩，人等。
第三方面，本发明提供了用于治疗自闭症或自闭症相关症状的药物，所述药物包括治疗有效量的间充质干细胞。
优选地，所述间充质干细胞为骨髓来源的间充质干细胞，脐带间充质干细胞，脂肪间充质干细胞或牙髓来源的间充质干细胞。优选地，所述牙髓来源的间充质干细胞为人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。
优选地，所述药物还包含用于治疗自闭症或自闭症相关症状的其他药物。
本发明人采用BTBR自闭症小鼠模型，采用人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)生理盐水注射剂，以生理盐水作为对照，进行尾静脉注射，发现人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)生理盐水注射剂可以改善BTBR小鼠的社交行为，由没有对同类的选择偏好到出现对同类的选择偏好，社交行为接近于野生型小鼠；而且BTBR自闭症小鼠有活动过度的焦虑行为，SHED治疗后这种活动过度得到缓解，表现为旷场中总移动距离的变短；野生型小鼠由于恐惧心理，在高架迷宫开放区间的停留时间相对较短，而BTBR自闭症小鼠由于对外界因素感受较差，会更加频繁的进入开放区间，经SHED治疗后开放区间百分比降低，更加接近于野生型小鼠行为。
本发明人采用Shank3+/-自闭症Beagle犬模型，采用人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)生理盐水注射剂，以生理盐水作为对照，进行尾静脉注射，发现人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)生理盐水注射剂可以改善犬犬同类之间的社交行为，自闭症犬与陌生犬有效社交(嗅探、邀玩)时间明显减少，而且，自闭症犬在“老朋友”和“新朋友”之间没有社交选择性，社交新鲜感存在严重缺陷，经过SHEDs治疗后，自闭症犬更愿意与“新朋友”(str2)进行社交，社交新鲜性恢复；可以改善犬与人异类之间的社交行为，Shank3+/-自闭症Beagle犬无法跟随人的走动方向而走动，跟随性极差，对人手的嗅闻、舔舐时间显著降低，并且存在尾巴下垂、僵直等社交压力的表现，在与人社交能力方面存在缺陷，经过SHEDs治疗后，与治疗之前数据相比，治疗后自闭症犬尾巴下垂、僵直的时间明显减少，经过SHED细胞治疗后在与人社交时压力得到极大缓解。
本发明的发明人率先使用SHED治疗BTBR自闭症小鼠模型，结果表明SHED对改善ASD小鼠的社交行为及异常的焦虑模式有显著疗效，可以作为ASD治疗的有效新方法。
附图说明
图1显示了无血清培养基中培养的SHED球样干细胞团。
图2显示了BTBR小鼠三箱社交实验结果。
图3显示了BTBR小鼠旷场实验结果。
图4显示了BTBR小鼠高架迷宫实验实验结果。
图5显示了SHANK3+/-自闭症比格犬SHED细胞治疗前后三箱实验及结果。
图6显示了SHANK3+/-自闭症比格犬SHED细胞治疗前饲养笼人犬社交实验及结果。
图7显示了SHANK3+/-自闭症比格犬SHED细胞治疗后饲养笼人犬社交实验及结果。
图8显示了SHANK3+/-自闭症比格犬在SHED细胞治疗前后γ-干扰素水平的变化。
图9显示了SHANK3+/-自闭症比格犬在SHED细胞治疗前后血清抗炎因子IL-10表达水平和TGF-β1表达水平的变化。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书对本发明的技术方案做进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。
缩略语和关键术语定义：
多能干细胞(Pluripotent Stem Cells，PSC)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种多能细胞，多能干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)属于成体多能干细胞的一种，起源于中胚层，最初从骨髓中分离出，但后来发现存在于多种组织中例如骨骼肌，脂肪组织、骨髓、脐带、脐血、乳牙组织、羊膜、胎盘等。MSC是具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，具有分化成骨骼肌，软骨组织，骨髓和脂肪等由中胚层分化而来的组织器官组织的能力，但同时也发现间充质干细胞也可能分化肝细胞，神经细胞以及上皮细胞等非中胚层分化的组织。
BTBR T～(+)tf/J小鼠(本申请中简称BTBR小鼠)是孤独症谱系障碍理想的动物模型，参见国际神经精神科学杂志，2014，3，13-19，引入本文作为参考。
SHANKk3+/-自闭症Beagle犬模型的制备参见中国专利申请号CN201811577970.2，全文并入本文作为参考。
干细胞技术，又称为再生医疗技术，是指通过对干细胞进行分离、体外培养、定向诱导、甚至基因修饰等过程，在体外繁育出全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官，并最终通过细胞组织或器官的移植实现对临床疾病的治疗。
牙髓MSC作为机体的重要MSC成员，其存在于牙髓、牙周膜、脱落乳牙、根尖乳头和牙囊组织中。与骨髓MSC相比，牙髓MSC增殖率更高，异质性低、具有更好的成神经分化能力和免疫调节功能增殖迅速、并无成瘤现象。目前牙髓MSC尚未被用于治疗自闭症或自闭症相关症状。
本发明的发明人发现并证实牙髓MSC可用于治疗自闭症或自闭症相关症状，因此，本发明涉及利用牙髓MSC制备用于治疗自闭症或自闭症相关症状的药物。
实施例1：SHEDs的分离培养及注射液制备
乳牙离体后PBS冰盒保存，于24小时内，无菌分离乳牙牙髓，PBS冲洗，灭菌器械剪碎，37℃条件下，胶原酶和中性蛋白酶混合消化液孵育1小时。加入3mLα-MEM终止反应，1000rpm离心5分钟，加入6mL培养基重悬，接种于6cm直径细胞培养皿，37℃、5％CO2培养。24h后，吸除上清液未贴壁细胞，PBS清洗后，加入培养液继续培养。约10天后可见密集的P0集落，即可传代P1。培养基成分为85％的α-MEM和15％FBS，收获P3-P4代细胞进行后续实验，收集汇合率达到90％以上的细胞，经过洗涤后，进行计数，生理盐水重悬，细胞注射液在使用前保存在冰上，并在6h内使用。
参见图1，可以看出在无血清培养基中，SHED细胞可以聚集形成球样的干细胞团。
实施例2：BTBR小鼠行为学评价
使用BTBR自闭症小鼠模型，将自闭症模型小鼠随机分为模型组和治疗组，另外将野生型小鼠设为对照组；治疗组连续4次(约1次/周)使用SHEDs(3～4×106个细胞/只)进行尾静脉注射，对照组与模型组同时给予等剂量生理盐水。
(1)BTBR小鼠三箱社交实验：治疗组BTBR小鼠连续3次尾静脉注射SHED细胞(1周/次)。治疗后2周开始进行三箱社交行为学评价，具体实验步骤如下：
(a)实验开始前，将小鼠放在行为测试室适应30min；
(b)用透明的玻璃树脂板隔开三个箱子，并将测试小鼠放入中间箱子适应5min；
(c)将一只陌生的同种小鼠Stranger1放入一侧的箱子金属笼里，另一侧空着；去掉隔开箱子的树脂板，使测试小鼠可以自由活动10min；
(d)开始拍摄并记录相关参数：Subject mice与stranger1或空金属笼
之间的接触持续时间(金属笼周围3-5cm定义为接触范围)。
结果表明，WT组野生型小鼠会表现出社交行为，与陌生小鼠交流时间明显多于空金属笼。而BTBR自闭症小鼠由于社交障碍，并没有选择偏好，经尾静脉注射SHED细胞治疗后，BTBR小鼠的社交行为改善，出现对同类的选择偏好，社交行为接近于野生型小鼠(参见图2)。
(2)BTBR自闭症小鼠旷场实验：治疗组BTBR小鼠连续3次尾静脉注射SHED细胞(1周/次)。治疗后2周开始进行旷场实验，具体实验步骤如下：
(a)实验开始前，将小鼠放在行为测试室适应30min；
(b)从饲养笼中轻轻取出小鼠，注意背向实验者；
(c)将小鼠迅速放于试验箱的中心区域，并立即离开；
(d)记录15min的时间内小鼠在箱内的活动。
BTBR小鼠有活动过度的焦虑行为，SHED治疗后这种活动过度得到缓解，表现为旷场中总移动距离的变短(参见图3)。
(3)BTBR自闭症小鼠高架迷宫实验：治疗组BTBR小鼠连续3次尾静脉注射SHED细胞(1周/次)。治疗后2周开始进行高架迷宫实验，具体实验步骤如下：
(a)实验开始前，将小鼠放在行为测试室适应30min；
(b)将小鼠从饲养笼中取出，小鼠背向实验员，将其放在仪器宫体的中央位置，面向开臂，实验员迅速离开；
(c)记录小鼠运动轨迹，通常实验时常为5min。
野生型小鼠由于恐惧心理，在高架迷宫开放区间的停留时间相对较短，而BTBR自闭症小鼠由于对外界因素感受较差，会更加频繁的进入开放区间，SHED治疗后开放区间百分比降低，更加接近于野生型小鼠行为(参见图4)。
实施例3：SHANK3+/-自闭症比格犬行为学评价
使用Shank3+/-自闭症Beagle犬模型，将自闭症模型犬随机分为模型组和治疗组，另外将野生Beagle犬设为对照组；治疗组静脉滴注SHEDs细胞(2～4×106个细胞/kg)，连续6次(约1次/7-10天)，对照组与模型组同时给予等剂量生理盐水。
SHANK3+/-自闭症比格犬治疗组比格犬连续6次尾静脉注射SHED细胞(1周/次)。治疗后1个月开始进行社交行为学评价：
(1)狗狗同类社交行为：
三箱实验(参见图5A)：结果显示在SHED细胞治疗之前，自闭症犬与陌生犬有效社交(嗅探、邀玩)时间明显减少(参见图5B)，实验第二阶段，自闭症犬在“老朋友”(str1)和“新朋友”(str2)之间没有社交选择性，社交新鲜感存在严重缺陷(参见图5C)。经过SHEDs治疗后，自闭症犬更愿意与“新朋友”(str2)进行社交，社交新鲜性恢复。
(2)狗与人异类社交：
饲养笼人犬社交(参见图6E)：自闭症犬无法跟随人的走动方向而走动，跟随性极差，对人手的嗅闻、舔舐时间显著降低，并且存在尾巴下垂、僵直(Stress tail)等社交压力的表现，突变体在与人社交能力方面存在缺陷(参见图6A-6D)。
与治疗之前相比，治疗后自闭症犬尾巴下垂、僵直(Stress tail)的时间明显减少，经过SHED细胞治疗后的突变体在与人社交时压力得到极大缓解(参见图7)。
实施例4：血清炎症相关因子检测
用Elisa检测试剂盒，对WT组，SHANK3+/-自闭症比格犬组(Mut组)及SHANK3+/-自闭症比格犬SHED细胞治疗组(Mut+SHEDs组)血清进行炎症因子检测，结果如下：
(1)γ-干扰素：有研究表明γ-干扰素水平与动物的社交行为密切相关，本实施例显示，SHANK3+/-自闭症比格犬的血清中γ-干扰素的水平明显高于WT组(参见图8A)。SHED细胞治疗后γ-干扰素的水平下降到正常水平(参见图8B)。
(2)其他细胞因子
SHANK3+/-自闭症比格犬的血清中IL-10的水平低于WT组，SHED治疗后血清抗炎因子IL-10表达水平增加(参见图9A)；SHANK3+/-自闭症比格犬的血清中TGF-β1的水平有高于WT组的趋势，治疗后血清TGF-β1表达水平降低(参见图9B)。
Claims (10)
1.人脱落乳牙牙髓干细胞的培养方法，所述方法包括：
(1)将分离的人乳牙牙髓用胶原酶和/或中性蛋白酶进行消化，加入培养液终止反应，离心后加入培养液重悬，接种于细胞培养皿；以及
(2)于37℃、5％CO2培养24小时后吸除未贴壁细胞，清洗后加入培养液继续培养10天，获得密集的P0集落，
所述培养液包含85％的α-MEM和15％FBS，
优选地，所述培养液为无血清培养液。
2.间充质干细胞在制备用于治疗对象的自闭症或自闭症相关症状的药物中的应用。
3.根据权利要求2的应用，所述间充质干细胞为骨髓来源的间充质干细胞，脐带间充质干细胞，脂肪间充质干细胞或牙髓来源的间充质干细胞，优选地，所述牙髓来源的间充质干细胞为人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。
4.根据权利要求2或3的应用，所述应用为选自如下的一种或者多种应用：
(1)人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)在制备用于改善与同类和异类之间的社交行为的药物中的应用；
(2)人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)在制备用于缓解焦虑症状的药物中的应用；
(3)人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)在制备用于改善对外界因素感受性的药物中的应用；
(4)人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)在制备用于改善社交选择性的药物中的应用；
(5)人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)在制备用于改善社交压力的药物中的应用。
5.根据权利要求2或3的应用，所述应用为人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)在制备用于降低血清中γ-干扰素以及TGF-β1的药物中的应用。
6.根据权利要求2或3的应用，所述间充质干细胞，优选地，所述人脱落乳牙牙髓干细胞为固体、液体、凝胶、半流质或气雾的形式。
7.根据权利要求2或3的应用，所述间充质干细胞，优选地，所述人脱落乳牙牙髓干细胞制备成适于注射的形式，优选地，所述注射为静脉注射或皮下注射。
8.根据权利要求2或3的应用，所述对象为哺乳动物，包括但不限于啮齿类动物，灵长类动物，宠物动物，优选地，为马，犬，猫，人类，猴子，黑猩猩，大猩猩或人。
9.用于治疗自闭症或自闭症相关症状的药物，所述药物包括治疗有效量的间充质干细胞，
优选地，所述间充质干细胞为骨髓来源的间充质干细胞，脐带间充质干细胞，脂肪间充质干细胞或牙髓来源的间充质干细胞，
优选地，所述牙髓来源的间充质干细胞为人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。
10.用于治疗自闭症或自闭症相关症状的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的间充质干细胞，和用于治疗自闭症或自闭症相关症状的其他药物，
优选地，所述间充质干细胞为骨髓来源的间充质干细胞，脐带间充质干细胞，脂肪间充质干细胞或牙髓来源的间充质干细胞，
优选地，所述牙髓来源的间充质干细胞为人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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