CN113069472A - 肝脏前体细胞、其制备方法以及在抑郁症治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肝脏前体细胞、其制备方法以及在抑郁症治疗中的用途。具体地，本发明涉及肝脏前体细胞在制备用于治疗患有抑郁症的患者的药物中的用途，优选地，所述肝脏前体细胞表达表面标志物CD133、EpCAM和CK19。

Description

肝脏前体细胞、其制备方法以及在抑郁症治疗中的用途

技术领域

本发明涉及抑郁症的治疗领域。具体地，本发明涉及肝脏前体细胞的分离、培养方法，以及其在治疗抑郁症中的用途。

背景技术

抑郁症是一种以持续性、显著性心境低落为主要特征的精神疾病，临床症状复杂，有情绪低落，兴趣减退，言语减少等症状。而其中重度抑郁症(major depressivedisorder，MDD)因其高患病率，高复发率和高自杀率的特点，给患者家庭及社会带来了巨大的经济负担。流行病学表示，随着社会节奏的变快、生活压力的加剧，其发病率也在逐年上升。

现阶段研究认为，遗传因素、环境因素和表观遗传因素是MDD最主要的致病因素。MDD具有较高的临床异质性，目前认为的致病假说，如炎症假说、神经发生假说、神经营养因子假说和单胺假说等，均仅能解释部分患者。另外现在虽然有许多治疗MDD的药物，大多是对单胺类神经递质(5-HT、NE)的含量进行调节，这些抗抑郁药物长期以来存在“延迟效应”的问题。另外，在服用抗抑郁药物的MDD患者中有30％的患者治疗效果并不明显，即“难治性抑郁症”。因此，针对 MDD患者需要开发更加有效的治疗方法，目前大多数临床或基础实验都集中在MDD在脑内的机制和神经环路研究上，而对外周器官的潜在贡献只进行了有限的研究。

近些年来，越来越多的研究者开始对脑和身体间的相互作用产生了兴趣，如抑郁或焦虑和身体健康间的关系。最近的证据也表明抑郁症不仅包括脑的功能异常，也是一种影响全身的系统性疾病。肝脏是体内最大的一个器官，行使代谢和免疫的功能，对人的身体具有至关重要的作用，因此对肝与脑间的作用会变得更加普遍。传统中医认为生气会伤肝，传统中医治疗抑郁是通过疏肝进行的。有研究表明精神上的疾病与肝病所引起的死亡之间呈一种剂量相关关系。

临床上有报道指出抑郁、焦虑和述情障碍是影响肝硬化患者健康生活质量的主要决定因素。急性毒性肝损伤的病人更易出现焦虑和抑郁的倾向。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)与情绪障碍的患病率增加有关。有研究使用大量的慢性肝病患者人群做样本，发现在NAFLD患者中抑郁的患病率高于慢性乙型肝炎患者(27.2％vs.3.7％)。一项小规模的配对病例对照研究也报告，与年龄、性别、体重指数匹配的对照组相比，NAFLD患者的终生重度抑郁障碍和/或泛型焦虑障碍的患病率更高(63.8％vs.33.8％)。

肝对于身体的内稳态具有至关重要的作用，从消化道尤其小肠吸收的营养物质首先通过门静脉进入肝脏，肝脏除了代谢的功能外同时行使解毒的功能，大量因素可以影响肝，如病毒、毒物、代谢物、免疫攻击等，从而导致肝炎、纤维化、肝硬化、肝癌甚至最终死亡。对于终末期肝病，唯一有效的方法就是肝移植，但在世界范围内存在一个器官短缺问题，还有免疫排斥问题。直接移植肝细胞也可以治疗肝病，但肝细胞的长期应用效率不高，培养困难，所以干细胞的移植就成为了一种很有前途的手段。可用的干细胞有胚胎干细胞，间充质干细胞，诱导多能干细胞，骨髓干细胞等，而近些年对肝脏前体细胞 (hepatic progenitorcells,HPCs)的研究为肝病治疗提供了新的手段。

HPCs是肝脏中的成体干细胞，成体干细胞是存在于已经分化的组织器官中的未分化细胞，具有自我更新的能力，并在一定条件下可以分化为各种特异的细胞类型，最早对成体干细胞的研究起始于20世纪 60年代对造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的研究，成体干细胞应用研究是再生医学的重要组成部分。早在1958年，Wilson 和Leduc发现了肝脏中的双潜能前体细胞可以分化为肝实质细胞或胆道上皮细胞。HPCs在健康肝脏中的含量是极少的，这一点与小肠上皮的前体细胞或毛囊的前体细胞处于持续分裂增殖有很大不同。但当肝脏受到持续慢性损伤时(如四氯化碳腹腔注射、胆管结扎、蛋氨酸及胆碱缺乏饮食等)，HPCs才会大量激活并增殖。HPCs可以分化为肝实质细胞或胆管上皮细胞，参与肝脏再生；可以修复受慢性毒性损伤的肝脏，体外扩增培养后回体注射，可使得修复效果更加显著；HPCs 或可用于体外构建肝脏类器官，彻底解决器官移植短缺的问题。

发明内容

在本发明的第一方面，本发明提供了肝脏前体细胞在制备用于治疗患有抑郁症的患者的药物中的用途；优选地，所述患者是哺乳动物，优选为人、牛、猪、马、羊、猴、狗、猫、大鼠、小鼠和豚鼠。

本发明中的肝脏前体细胞是肝脏中的成体干细胞，其存在于已经分化的组织器官中的未分化细胞，具有自我更新的能力，并在一定条件下可以分化为各种特异的细胞类型。

在一些实施方案中，本发明的所述肝脏前体细胞表达表面标志物 CD133、EpCAM和CK19。

在一些实施方案中，本发明的所述肝脏前体细胞通过修复和改善肝脏功能来实现治疗抑郁症的效果。

在本发明的第二方面，本发明提供了一组药物组合物在制备用于治疗患有抑郁症的患者的药物中的用途，其中所述药物组合物包含1× 10⁴至1×10¹⁰之间的肝脏前体细胞，以及药学上可接受的载体、赋性剂和/或佐剂。

在优选的实施方案中，本发明的药物组合物中包含约1×10⁴、约1 ×10⁵、约1×10⁶、约1×10⁷、约1×10⁸、约1×10⁹、约1×10¹⁰、或这些点值之间的任何范围的肝脏前体细胞，优选地，所述肝脏前体细胞溶解在生理上可接受的溶剂中，包括但不限于，生理盐水或PBS。

可以通过适合于递送本发明组合物或药物的任何途径进行施用。因此，递送途径可包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下递送。

在一些实施方案中，本发明的肝脏前体细胞是一种成体干细胞，优选地，其可来源于哺乳动物的受损肝脏；优选地，所述哺乳动物选自人、牛、猪、马、羊、猴、狗、猫、大鼠、小鼠和豚鼠。

在一些实施方案中，本发明所述的受损肝脏选自脂肪肝、肝纤维化、肝硬化、药物或毒物造成的肝损伤、胆管堵塞造成的胆损伤、和蛋氨酸及胆碱缺乏饮食缺乏造成的肝损伤；优选地，所述药物或毒物造成的肝损伤包括四氯化碳和/或DDC造成的肝损伤。

在另一方面，本发明提供了一种体外获得肝脏前体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1)获得受损肝脏，

2)将所述受损肝脏分离为单细胞，

3)以CD133和EpCAM为表面标记物进行流式细胞仪分选，获得肝脏前体细胞，和

4)在适当的培养基和适当的培养条件下，培养所述肝脏前体细胞。

在一些实施方案中，所述培养基是包含胎牛血清占、肝生长因子、表皮生长因子、尼克酰胺、胰岛素、β-巯基乙醇、庆大霉素、GlutaMax、青霉素和链霉素的DMEM/F12高糖培养基；优选地，所述DMEM/F12 高糖培养基约占总体积87％，胎牛血清占总体积10％，肝生长因子40 ng/mL，表皮生长因子40ng/mL，尼克酰胺1mg/mL，胰岛素10μg/mL，β-巯基乙醇0.1mmol/L，庆大霉素50mg/mL，GlutaMax占总体积1％，青霉素和链霉素占总体积1％。

在一些实施方案中，所述适当的培养条件是在37℃，5％二氧化碳下培养。

在一些是实施方案中，本发明提供了一种体外获得肝脏前体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1)向哺乳动物口服施用DDC，所述哺乳动物包括但不限于牛、猪、马、羊、猴、狗、猫、大鼠、小鼠和豚鼠，

2)获得受损肝脏，

3)将所述受损肝脏分离为单细胞，

4)以CD133和EpCAM为表面标记物进行流式细胞仪分选，获得肝脏前体细胞，和

5)在适当的培养基和适当的培养条件下，培养所述肝脏前体细胞。

根据本发明的方法获得的肝脏前体细胞在制备用于治疗患有抑郁症的患者的药物中的用途。

术语

术语“非酒精性脂肪性肝病(NAFLD，non-alcoholic fatty liver disease)”，是指除过量饮酒和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。

如本文中使用的术语，“肝脏前体细胞HPCs(hepatic progenitor cells)”是肝脏中的成体干细胞，成体干细胞是存在于已经分化的组织器官中的未分化细胞，具有自我更新的能力，并在一定条件下可以分化为各种特异的细胞类型。在肝脏受到持续慢性损伤时(如四氯化碳腹腔注射、胆管结扎、蛋氨酸及胆碱缺乏饮食等)，会大量激活并增殖的细胞。HPCs可以分化为肝实质细胞或胆管上皮细胞，参与肝脏再生。

造血干细胞(HSCs，hematopoietic stem cells)，是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。

如本文中使用的术语，“绿色荧光蛋白(GFP，green fluorescent protein)”，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色萤光。虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白，但传统上，绿色荧光蛋白(GFP)指首先从维多利亚多管发光水母中分离的蛋白质。

DDC(3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydrocollidine)3，5-二乙氧羰基-1，4-二氢可立丁，一种肝毒性化合物。

如本文使用的术语“慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mildstress，CUMS)”，是一种经典的抑郁模型，每天用2-3种不同方式刺激小鼠，如冷水游泳，断水，断食，倾斜鼠笼，昼夜颠倒，气味刺激，噪音刺激，热板刺激等连续应激30天左右建立而成，用来模仿人的慢性抑郁形成过程。

如本文使用的术语“磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer saline)”，是一种常用的用于生物学研究的缓冲溶液，是一种水基盐溶液，含磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，氯化钠和氯化钾，主要用于保持恒定的pH值以及等渗。

如本文使用的术语“间充质干细胞(MSC，mesenchymal stem cell)”，是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)。

如本文使用的术语“AML12“，是一种肝细胞系。

如本文使用的术语“开放空间强迫游泳模型(Open-Space Forced Swim Model ofDepression)”，是指新近的一种小鼠抑郁模型，每天在热水中(32-34℃)强迫游泳15分钟，连续游泳4天，第4天游泳的同时，记录游泳时间。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且无论是体外还是原位，是指可适用于本文所述的方法的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人。

术语“治疗”或“处理”包括在受试者如人中治疗本文所述的疾病或病症，并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发生；(ii)缓解疾病或病症，即引起病症消退；(iii)减缓疾病的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。

术语“施用”或“给予”治疗剂如肝脏前体细胞的试剂包括引入或递送治疗剂以执行预期功能的任何途径。可以通过适合于递送药剂的任何途径进行施用。因此，递送途径可包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下递送。

以下将结合附图以及具体实施例进一步说明本发明的实施方案，但是，不应理解为将本发明的范围限于这些具体实施例。

附图说明

图1显示DDC饮食小鼠与对照小鼠相比的肉眼可见的肝脏病变。

图2显示以CD133-PE和EpCAM-APC作为表面标记物进行的流式细胞仪分选。

图3显示HPCs的体外培养情况。

图4显示传代培养后的细胞的形态以及GFP表达。

图5A显示建立抑郁模型后的小鼠体重；

图5B显示建立抑郁模型后、开始治疗之前小鼠的新奇抑制摄食检测的结果；

图5C显示建立抑郁模型后、开始治疗之前小鼠的强迫游泳检测的结果；

图5D显示建立抑郁模型后、开始治疗之前小鼠的悬尾检测的结果。

图6A显示HPC治疗之后小鼠的强迫游泳检测的结果；

图6B显示HPC治疗之后小鼠的悬尾检测的结果；

图6C显示HPC治疗之后小鼠的新奇抑制摄食检测的结果。

图7A显示在开放空间强迫游泳建立抑郁模型后、开始治疗之前小鼠的游泳试验结果；

图7B显示治疗之后小鼠的游泳试验结果。

具体实施方式

本发明人开展了HPCs和抑郁症方面的研究，考虑到HPCs对肝脏的修复与治疗效果，同时肝脏对健康的重要性，我们建立了可全身表达绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)的C57BL/6雄性小鼠，该小鼠由南京模式动物中心提供，后经过饲喂3，5-二乙氧羰基 -1，4-二氢可立丁(3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydrocollidine，DDC) 饮食获得肝损伤模型，分离获得HPCs后，在体外大量扩增培养，后经尾静脉回体注射入患有抑郁症的C57BL/6雄性小鼠体内(该小鼠购于北京维通利华公司)，发现HPCs对抑郁症具有明显的治疗效果。具体实施方式如下详述。

实施例1 HPCs的分离获得以及体外克隆培养

我们建立了可全身表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein， GFP)的C57BL/6雄性小鼠，该小鼠由南京模式动物中心提供。经饲喂3，5-二乙氧羰基-1，4-二氢可立丁(3，5-diethoxycarbonyl-1， 4-dihydrocollidine，DDC)饮食获得肝损伤模型。

从图1中可见，DDC饮食饲喂一段时间后，小鼠的肝脏出现严重病变，与对照组相比，DDC饮食组小鼠的肝脏颜色明显变暗，且肝脏硬化，已发生明显的损伤。

将DDC和对照小鼠的肝脏摘除后，经胶原酶完全消化为单细胞。以CD133-PE和EpCAM-APC为表面标记物进行流式细胞仪分选。从图2中可以看出，HPCs的得率在8-13％，其中CD133和EpCAM 是DDC肝损伤模型下HPCs的特异标记物。

将收集到的HPCs离心后培养，每隔一天更换一半培养基，培养基配方：DMEM/F12高糖培养基约占总体积87％，胎牛血清占总体积 10％，肝生长因子40ng/mL，表皮生长因子40ng/mL，尼克酰胺1mg/mL，胰岛素10μg/mL，β-巯基乙醇0.1mmol/L，庆大霉素50mg/mL，GlutaMax占总体积1％，青霉素和链霉素占总体积1％。培养条件：在恒温培养箱中保持37℃，5％二氧化碳水平。具体步骤：每隔一天吸掉一半培养皿中原有的培养基，并添加等体积新的培养基；在第3天时，有极个别细胞开始贴壁；在第6天时出现个别较小克隆；在第18天时，有较大的克隆出现，并且这些获得的HPCs也表达CK19，所述CK19 是胆管上皮标记物，证明了其胆管来源。

将获得的较大克隆消化后传代培养，可以看到细胞的形态呈多边形，且细胞间排列紧密，并且表达GFP，方便以后对HPCs的追踪(参见图4)。

实施例2小鼠抑郁模型的建立

慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS) 的小鼠抑郁模型是国际上通用的经典抑郁模型之一，参见Willner P. Chronic Mild Stress(CMS)Revisited:Consistency and Behavioural-Neurobiological Concordance in theEffects of CMS. Neuropsychobiology,2005,2:90-110；Willner P,Muscat R,Papp M.Chronic Mild Stress-Induced Anhedonia:A Realistic Animal Model ofDepression.Neurosci Biobehav Rev,1992,4:525-534；Willner P,Moreau J L,NielsenC K et al.Decreased Hedonic Responsiveness Following Chronic Mild Stress isNot Secondary to Loss of Body Weight；Physiol Behav,1996,1:129-134；WillnerP.Validity,Reliability and Utility of the Chronic Mild Stress Model ofDepression:A 10-Year Review and Evaluation.Psychopharmacology(Berl),1997,4:319-329)。简言之，根据以下步骤建立CUMS小鼠模型：在30-35天的时间内，每天施加2-3 种温和压力应激，包括冷水游泳、倾斜鼠笼、撤空垫料、断食、断水、气味刺激、噪音刺激、足底热板、足底电击、和昼夜颠倒等。

实施例3行为学测试验证小鼠抑郁模型的建立以及HPCs的治疗效果

我们采用新奇抑制摄食检测、强迫游泳检测、悬尾检测来验证小鼠抑郁模型的建立以及HPCs对抑郁小鼠症状的恢复作用。

在建模后，将小鼠分为以下四组，每组20只小鼠：对照组并注射 PBS(Control+PBS)；对照组并注射HPCs(Control+HPCs)，其中 HPCs悬于PBS中，每只鼠注射体积200μL，细胞数不少于10⁶；CUMS 并注射PBS(CUMS+PBS)；CUMS并注射HPCs(CUMS+HPC)，每只鼠注射体积200μL，细胞数不少于10⁶。其中，对照组是与CUMS 组小鼠周龄、性别、体重分别对应的健康小鼠。

分组之后，在开始注射PBS和HPCs之前，检测各组小鼠的体重，以及在新奇抑制摄食检测、强迫游泳检测、悬尾检测中的行为学结果，以验证是否成功建立抑郁的小鼠模型。结果见图5A-图5D。

从图5A的结果可见，与对照组相比，CUMS组小鼠体重显著降低 (使用SPSS软件，t检验与对照组相比，CUMS组的***p＜0.001)；在新奇抑制摄食检测中显示CUMS小鼠找到食物需要花费的时间更长 (图5B，使用SPSS软件，t检验***p＜0.001)；强迫游泳检测显示CUMS小鼠的游泳时间显著减少(图5C，使用SPSS软件，t检验 **p＜0.01)；悬尾检测显示CUMS小鼠的不动时间显著增加(图5D， ***p＜0.001；使用SPSS软件，t检验)；这些数据表明，CUMS的模型建立是成功的。

CUMS模型成功建立后，通过尾静脉注射向小鼠体内注射培养的 HPCs(溶解在PBS中)或仅含PBS，模型建立后仅注射一次细胞，每只鼠注射体积为200μL，细胞数不少于10⁶，7天后开始行为学检测。通过上述行为学试验观察HPCs对小鼠抑郁的缓解效果。

从图6A至图6C的结果可见，在分别注射PBS和HPCs后，在强迫游泳检测中(图6A)，经HPCs治疗后的CUMS小鼠(CUMS+HPC) 的游泳时间相对于CUMS+PBS组显著增加(SPSS软件，t检验， ***p＜0.001)，而CUMS+PBS相对于Cont+PBS游泳时间依然显著减少，说明PBS对抑郁没有治疗效果，起作用的是HPCs，在对照组中注射HPCs与注射PBS相比没有显著差异。

在悬尾检测中(图6B)，相对于CUMS+PBS组，注射HPCs(CUMS +HPC)可以显著减少CUMS小鼠的不动时间(**p＜0.01)，注射PBS 没有治疗效果。

在新奇抑制摄食检测中(图6C)，CUMS+HPC组的小鼠找到食物所花费的时间有了明显的减少(*p＜0.05)。上述行为学检测说明，注射HPCs对抑郁症有显著的治疗效果。

另外，在CUMS模型成功的基础上，我们使用了另外一种开放空间强迫游泳模型(Open-Space Forced Swim Model of Depression)来重复验证HPCs对抑郁症的治疗效果，该抑郁模型是在大鼠笼中添加足够深度的热水(32-34℃)，使用正常的C57 BL/6雄性小鼠(购自北京维通利华)，每天强迫游泳15分钟，连续4天，构建抑郁模型，仅通过游泳时间观察效果。

在建模后，将小鼠分为以下五组，每组20只小鼠：对照组并注射 PBS(Control+PBS)；模型组并注射PBS(Swim+PBS)；模型组并注射MSC(Swim+MSC)；模型组并注射HPC(Swim+HPC)；模型组并注射AML12(Swim+AML12)。其中，对照组是与CUMS组小鼠周龄、性别、体重分别对应的健康小鼠。

在建模后、开始注射之前，通过水泳试验确认成功建立抑郁模型后(参见图7A)，我们使用间充质干细胞(MSC)、肝细胞(AML12) 作为对比，相同的细胞数(10⁶)的HPCs治疗一周后，观察到只有HPCs 对模型小鼠具有显著的治疗效果(图7B)。

我们的结果表明，HPCs进入体内后只会进入肝脏当中，HPCs通过修复和改善肝脏功能来达到治疗抑郁症的效果，明显有别于过去传统对抑郁症治疗的认识。

Claims (10)

1.肝脏前体细胞在制备用于治疗患有抑郁症的患者的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述肝脏前体细胞表达表面标志物CD133、EpCAM和CK19。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述肝脏前体细胞通过修复和改善肝脏功能来实现治疗抑郁症的效果。

4.一组药物组合物在制备用于治疗患有抑郁症的患者的药物中的用途，其中所述药物组合物包含1×10⁴至1×10¹⁰之间的肝脏前体细胞，以及药学上可接受的载体、赋性剂和/或佐剂。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述肝脏前体细胞是一种成体干细胞，其来源于哺乳动物的受损肝脏。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述哺乳动物选自人、牛、猪、马、羊、猴、狗、猫、大鼠、小鼠和豚鼠。

7.根据权利要求5或6所述的用途，其中所述受损肝脏选自脂肪肝、肝纤维化、肝硬化、药物或毒物造成的肝损伤、胆管堵塞造成的胆损伤、和蛋氨酸及胆碱缺乏饮食缺乏造成的肝损伤；优选地，所述药物或毒物造成的肝损伤包括四氯化碳和/或DDC造成的肝损伤。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述患者是哺乳动物，优选为人、牛、猪、马、羊、猴、狗、猫、大鼠、小鼠和豚鼠。

9.一种体外获得肝脏前体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1)获得受损肝脏，

2)将所述受损肝脏分离为单细胞，

3)以CD133和EpCAM为表面标记物进行流式细胞仪分选，获得肝脏前体细胞，和

4)在适当的培养基和适当的培养条件下，培养所述肝脏前体细胞。

10.根据权利要求9所述的方法获得的肝脏前体细胞在制备用于治疗患有抑郁症的患者的药物中的用途。

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