CN112155796B - 增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯及制备方法，制备步骤为：以钛合金粉为原料，经3D打印一体成型得到增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的中间产物，经热等静压及深冷，得增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯；该臼杯的结构包括半球面本体，其中部设置有带内螺纹的第一圆孔，半球面本体的外表面设置有分区骨小梁，还设置有带内螺纹的第二圆孔，本发明人工髋关节臼杯的骨组织有限元模型中符合骨生长条件的区域可达40％，实现臼杯与宿主骨的骨整合。本发明骨小梁与实体结合强度高，不易脱落，提升假体寿命。本发明的实体部分释放残余应力，提高其塑性。
Description
技术领域
本发明涉及人工关节技术领域，具体而言，尤其涉及增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯及制备方法。
背景技术
人工髋关节置换手术是治疗股骨头坏死、髋关节发育不良、退行性髋骨关节炎、类风湿性关节炎等疾病终末期病变最重要和最有效的手术之一，随着人口老龄化的加剧，该类患者逐年增加。
目前临床上使用的人工髋关节假体包括骨水泥固定型假体和非骨水泥固定型假体。有研究显示，采用骨水泥固定的臼杯在骨水泥凝固过程中产生的高温会造成部分骨细胞的死亡，影响后期的骨生长。非骨水泥固定型假体由于良好的骨生长性能，因此得到了越来越广泛的应用。非骨水泥固定型假体的骨整合界面通常采用表面喷涂羟基磷灰石涂层或钛涂层，其优点是克服了骨水泥凝固时的高温，有利于骨细胞的生长，缺点是表面涂层容易脱落，影响使用效果，严重时会造成手术失败。随着金属3D打印技术的发展，采用3D打印技术在臼杯与宿主骨组织接触的表面打印多孔结构的金属骨小梁不仅解决了涂层的脱落问题，而且实现了骨组织从骨生长向骨长入的转变。但3D打印产品实体部分易存在显微组织不均匀、内部缺陷等问题，力学性能不佳；骨小梁部分结构中粉末未能得到良好熔结，力学性能差。
研究显示，目前国内外臼杯外表面的骨小梁均采用单一结构，国内也有骨科器材生产企业采用随机骨小梁结构模拟人体骨小梁的特点，目的在于提高骨长入的性能。单一结构骨小梁的优点是制造方便，缺点是没有考虑臼杯与宿主骨受力特点，与臼杯结合的宿主骨的大部分区域不符合骨生长的条件，不利于骨的生长，严重时会因为应变过大或过小造成骨吸收影响了臼杯的长期稳定性。因此，制备力学性能、骨整合性能优异的增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术不足，提供增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯。
本发明的第二个目的是提供增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯，包括半球面本体9，所述半球面本体的中部设置有带内螺纹的第一圆孔1，半球面本体的外表面设置有骨小梁3，所述骨小梁进行分区设置，第一分区线6和第二分区线5相交，交点过带内螺纹的第一圆孔1的中心，第三分区线4呈圆形，位于半球面本体的近边缘处；第一分区线、第二分区线和第三分区线将半球面本体外表面划分为：第一上区71、第一下区72、第二上区73、第二下区74、第三上区75、第三下区76、第四上区77和第四下区78；第一上区71、第二上区73、第三上区75和第四上区77面积相等；
在所述半球面本体的一侧设置有带内螺纹的第二圆孔2，带内螺纹的第二圆孔2为3个，其中2个分别设置在第一上区71和第三上区75内，另1个设置在第一上区71和第三上区75的交界处；
第三上区75和第四上区77设置有第一种骨小梁81，第三下区76和第四下区78设置有第二种骨小梁82，第一上区71设置有第三种骨小梁83，第一下区72设置有第四种骨小梁84，第二上区73设置有第五种骨小梁85，第二下区74设置有第六种骨小梁86；第一种骨小梁的孔径和孔隙率依次小于第二种骨小梁、第三种骨小梁、第四种骨小梁、第五种骨小梁和第六种骨小梁。
所述第一种骨小梁孔径为700μm-740μm，孔隙率为65％-70％；
所述第二种骨小梁孔径为750μm-770μm，孔隙率为71％-75％；
所述第三种骨小梁孔径为780μm-810μm，孔隙率为76％-78％；
所述第四种骨小梁孔径为820μm-850μm，孔隙率为79％-80％；
所述第五种骨小梁孔径为860μm-900μm，孔隙率为81％-83％；
所述第六种骨小梁孔径为910μm-950μm，孔隙率为84％-85％；
所述第一种骨小梁、第二种骨小梁、第三种骨小梁、第四种骨小梁、第五种骨小梁、第六种骨小梁厚度相等，为1.2mm-1.5mm。
上述增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的制备方法，包括如下步骤：
1)以钛合金粉为原料，经3D打印一体成型得到增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的第一中间产物，将所述第一中间产物放入热等静压炉，在氦气或氩气保护下，升温至900℃-950℃，在110MPa-140MPa，恒温放置1h-3h，降至常压，随所述炉冷却至200℃以下，取出，得到第二中间产物：
2)将第二中间产物放置于程序性降温盒中以1℃/min的速度降温至-80℃～-120℃，恒温放置5h-10h，从程序性降温盒中取出；在液氮中再放置16h-36h，调节温度至室温，得到第三中间产物；
3)将第三中间产物放置于程序性降温盒中以1℃/min的速度降温至-80℃～-120℃，恒温放置5h-10h；从程序性降温盒中取出；在液氮中再放置16h-36h，调节温度至室温；得第四中间产物，进行机加工修整，得到增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯；
增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的第一中间产物、第二中间产物、第三中间产物和第四中间产物的结构与增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯结构相同。
钛合金粉化学成分按质量百分比包括88％-90％的Ti，5.5％-6.5％的Al，3.5％-4.5％的V，余量为不可避免的微量杂质；钛合金粉的粒径为45μm-106μm。
步骤2)和3)所述调节温度的步骤为：升温至-120℃～-80℃，恒温保持3h-5h；升温至-40℃～-20℃，恒温保持3h-5h；升温至4℃-8℃，恒温保持1h-3h，升温。
与现有技术方案相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯采用分区骨小梁方式，为骨生长提供适合的环境。根据有限元分析结果，骨组织有限元模型中符合骨生长条件的区域可达40％，实现臼杯与宿主骨的骨整合。本发明采用3D打印一体成型，骨小梁与实体结合强度高，不易脱落，提升假体寿命。本发明增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的实体部分释放残余应力，提高其塑性。
附图说明
图1为增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯轴测图。
图2为增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯(无骨小梁)轴测图。
图3为增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯结构示意图。
图4为增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯俯视图。
图5为对照组1的均匀骨小梁人工髋关节臼杯应变分布云图。
图6为实施例1的增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯应变分布云图。
图7为对照组2的骨小梁SEM图。
图8为实施例1的骨小梁SEM图。
图9为对照组2的人工髋关节臼杯金相显微结构图。
图10为实施例1的增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯金相显微结构图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯，包括半球面本体9，所述半球面本体的中部设置有带内螺纹的第一圆孔1，半球面本体的外表面设置有骨小梁3，所述骨小梁3进行分区设置，第一分区线6和第二分区线相交，交点过带内螺纹的第一圆孔1的中心，
第三分区线4呈圆形，位于半球面本体的近边缘处；第一分区线、第二分区线和第三分区线将半球面本体外表面划分为：第一上区71、第一下区72、第二上区73、第二下区74、第三上区75、第三下区76、第四上区77和第四下区78；第一上区71、第二上区73、第三上区75和第四上区77面积相等；
在所述半球面本体的一侧设置有带内螺纹的第二圆孔2，所述带内螺纹的第二圆孔2为3个，其中2个分别设置在第一上区71和第三上区75内，另1个设置在第一上区71和第三上区75的交界处；第三上区75和第四上区77设置有第一种骨小梁81，第三下区76和第四下区78设置有第二种骨小梁82，第一上区71设置有第三种骨小梁83，第一下区72设置有第四种骨小梁84，第二上区73设置有第五种骨小梁85，第二下区74设置有第六种骨小梁86；
所述第一种骨小梁孔径为700μm，孔隙率为65％；所述第二种骨小梁孔径为750μm，孔隙率为71％；所述第三种骨小梁孔径为780μm，孔隙率为76％；所述第四种骨小梁孔径为820μm，孔隙率为79％；所述第五种骨小梁孔径为860μm，孔隙率为81％；所述第六种骨小梁孔径为910μm，孔隙率为84％；所述第一种骨小梁、第二种骨小梁、第三种骨小梁、第四种骨小梁、第五种骨小梁、第六种骨小梁厚度相等，为1.2mm。
增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的制备方法，包括如下步骤：
1)以钛合金粉为原料，经3D打印一体成型得到增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的第一中间产物，将所述第一中间产物放入热等静压炉，在氦气保护下，升温至900℃，在140MPa，恒温放置3h，降至常压，随所述炉冷却至200℃以下，取出，得到第二中间产物：
2)将第二中间产物放置于程序性降温盒中以1℃/min的速度降温至-80℃，恒温放置10h，从程序性降温盒中取出；在液氮中再放置16h，调节温度至室温，得到第三中间产物；
3)将第三中间产物放置于程序性降温盒中以1℃/min的速度降温至-80℃，恒温放置10h；从程序性降温盒中取出；在液氮中再放置16h，调节温度至室温；得第四中间产物，进行机加工修整，得到增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯；
增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的第一中间产物、第二中间产物、第三中间产物和第四中间产物和增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的结构相同。
所述钛合金粉化学成分按质量百分比包括88％的Ti，6.5％的Al，4.5％的V，余量为不可避免的微量杂质；钛合金粉的粒径为45μm-106μm，购置于瑞典Acram公司。。
步骤2)和3)所述调节温度的步骤为：升温至-120℃，恒温保持5h；升温至-40℃，恒温保持5h；升温至4℃，恒温保持3h，升温。
实施例2
增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯，包括半球面本体9，所述半球面本体的中部设置有带内螺纹的第一圆孔1，半球面本体的外表面设置有骨小梁3，所述骨小梁3进行分区设置，第一分区线6和第二分区线相交，交点过带内螺纹的第一圆孔1的中心，
第三分区线4呈圆形，位于半球面本体的近边缘处；第一分区线、第二分区线和第三分区线将半球面本体外表面划分为：第一上区71、第一下区72、第二上区73、第二下区74、第三上区75、第三下区76、第四上区77和第四下区78；第一上区71、第二上区73、第三上区75和第四上区77面积相等；
在所述半球面本体的一侧设置有带内螺纹的第二圆孔2，所述带内螺纹的第二圆孔2为3个，其中2个分别设置在第一上区71和第三上区75内，另1个设置在第一上区71和第三上区75的交界处；
第三上区75和第四上区77设置有第一种骨小梁81，第三下区76和第四下区78设置有第二种骨小梁82，第一上区71设置有第三种骨小梁83，第一下区72设置有第四种骨小梁84，第二上区73设置有第五种骨小梁85，第二下区74设置有第六种骨小梁86；
所述第一种骨小梁孔径为720μm，孔隙率为67％；所述第二种骨小梁孔径为760μm，孔隙率为73％；所述第三种骨小梁孔径为800μm，孔隙率为77％；所述第四种骨小梁孔径为840m，孔隙率为79.5％；所述第五种骨小梁孔径为880μm，孔隙率为82％；所述第六种骨小梁孔径为930μm，孔隙率为84.5％；所述第一种骨小梁、第二种骨小梁、第三种骨小梁、第四种骨小梁、第五种骨小梁、第六种骨小梁厚度相等，为1.3mm。
增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的制备方法，包括如下步骤：
1)以钛合金粉为原料，经3D打印一体成型得到增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的第一中间产物，将所述第一中间产物放入热等静压炉，在氦气保护下，升温至930℃，在125MPa，恒温放置2h，降至常压，随所述炉冷却至200℃以下，取出，得到第二中间产物：
2)将第二中间产物放置于程序性降温盒中以1℃/min的速度降温至-100℃，恒温放置7h，从程序性降温盒中取出；在液氮中再放置24h，调节温度至室温，得到第三中间产物；
3)将第三中间产物放置于程序性降温盒中以1℃/min的速度降温至-100℃，恒温放置7h；从程序性降温盒中取出；在液氮中再放置24h，调节温度至室温；得第四中间产物，进行机加工修整，得到增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯；
增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的第一中间产物、第二中间产物、第三中间产物和第四中间产物和增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的结构相同。
所述钛合金粉化学成分按质量百分比包括89％的Ti，6％的Al，4％的V，余量为不可避免的微量杂质；钛合金粉的粒径为45μm-106μm，购置于瑞典Acram公司。
步骤2)和3)所述调节温度的步骤为：升温至-100℃，恒温保持4h；升温至-30℃，恒温保持4h；升温至6℃，恒温保持2h，升温。
实施例3
增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的结构，包括半球面本体9，所述半球面本体的中部设置有带内螺纹的第一圆孔1，半球面本体的外表面设置有骨小梁3，所述骨小梁3进行分区设置，第一分区线6和第二分区线相交，交点过带内螺纹的第一圆孔1的中心，第三分区线4呈圆形，位于半球面本体的近边缘处；第一分区线、第二分区线和第三分区线将半球面本体外表面划分为：第一上区71、第一下区72、第二上区73、第二下区74、第三上区75、第三下区76、第四上区77和第四下区78；第一上区71、第二上区73、第三上区75和第四上区77面积相等；
在所述半球面本体的一侧设置有带内螺纹的第二圆孔2，所述带内螺纹的第二圆孔2为3个，其中2个分别设置在第一上区71和第三上区75内，另1个设置在第一上区71和第三上区75的交界处；第三上区75和第四上区77设置有第一种骨小梁81，第三下区76和第四下区78设置有第二种骨小梁82，第一上区71设置有第三种骨小梁83，第一下区72设置有第四种骨小梁84，第二上区73设置有第五种骨小梁85，第二下区74设置有第六种骨小梁86；
所述第一种骨小梁孔径为740μm，孔隙率为70％；所述第二种骨小梁孔径为770μm，孔隙率为75％；所述第三种骨小梁孔径为810μm，孔隙率为78％；所述第四种骨小梁孔径为850μm，孔隙率为80％；所述第五种骨小梁孔径为900μm，孔隙率为83％；所述第六种骨小梁孔径为950μm，孔隙率为85％；所述第一种骨小梁、第二种骨小梁、第三种骨小梁、第四种骨小梁、第五种骨小梁、第六种骨小梁厚度相等，为1.5mm。
增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的制备方法，包括如下步骤：
1)以钛合金粉为原料，经3D打印一体成型得到增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的第一中间产物，将所述第一中间产物放入热等静压炉，在氩气保护下，升温至950℃，在110MPa，恒温放置1h，降至常压，随所述炉冷却至200℃以下，取出，得到第二中间产物：
2)将第二中间产物放置于程序性降温盒中以1℃/min的速度降温至-120℃，恒温放置5h，从程序性降温盒中取出；在液氮中再放置36h，调节温度至室温，得到第三中间产物；
3)将第三中间产物放置于程序性降温盒中以1℃/min的速度降温至-120℃，恒温放置5h；从程序性降温盒中取出；在液氮中再放置36h，调节温度至室温；得第四中间产物，进行机加工修整，得到增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯；
增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的第一中间产物、第二中间产物、第三中间产物和第四中间产物和增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的结构相同。
所述钛合金粉化学成分按质量百分比包括90％的Ti，5.5％的Al，3.5％的V，余量为不可避免的微量杂质；钛合金粉的粒径为45μm-106μm，购置于瑞典Acram公司。
步骤2)和3)所述调节温度的步骤为：升温至-80℃，恒温保持3h；升温至-20℃，恒温保持3h；升温至8℃，恒温保持1h，升温。
对照组1
均匀骨小梁人工髋关节臼杯的制备方法和结构与实施例1不同的是，
第一种骨小梁、第二种骨小梁、第三种骨小梁、第四种骨小梁、第五种骨小梁和第六种骨小梁为同一种骨小梁，其孔径为780μm，孔隙率为76％，骨小梁的厚度为1.2mm。
对照组2
以钛合金粉(同实施例1)为原料，经3D打印一体成型和机加工修整，得到结构同实施例1的钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯。
实验验证：
将实施例1的有限元模型与对照组1的有限元模型进行有限元分析，得到的有限元分析应变云图只显示范围为1000-3000的微应变(阴影部分)，实施例1在骨组织有限元模型上1000-3000微应变区域在整个骨组织有限元模型的占比为40％(图6)，大于对照组1(图5，1000-3000微应变区域占比为15％)，提示本发明所述增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯可实现骨组织大部分区域微应变适合骨生长，利于骨长入。
有限元分析结果证明，实施例2、3的增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯应变分布云图与实施例1的增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯相似。
扫描电子显微镜(Crossbeam340/550，蔡司，德国)对对照组2和实施例1的骨小梁部分进行观察分析。结果如图7-8所示，与对照组2相比，实施例1的骨小梁结构中钛合金粉发生进一步熔结，提示本发明增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的骨小梁部分综合性能提高。
对对照组2和实施例1的实体部分进行金相显微组织观察。结果如图9-10所示，与对照组2相比，实施例1的α相变短，α束域尺寸较小，原始β晶粒被破坏，提示本发明增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的实体部分塑性增强。
依据标准GB/T228.1-2010，电子万能试验机(UTM5105，深圳三思纵横科技股份有限公司，中国)对实施例1和对照组2的拉伸试件进行拉伸性能测试，实施例1和对照组2的实体拉伸试件各5个。结果如表1所示，实施例1的抗拉强度为1006.73MPa，与对照组2的抗拉强度接近(P＞0.05)；实施例1的断后伸长率为18.83％，高于对照组2(P＜0.01)，提示本发明增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯实体部分塑性优异。
表1对照组2和实施例1的实体拉伸试件的拉伸实验结果(**P＜0.01，与对照组2比较)
依据标准YY/T0988.12-2015，电子万能试验机(UTM5105，深圳三思纵横科技股份有限公司，中国)对对照组2和实施例1的孔径为780μm，孔隙率为76％的骨小梁剪切试件进行剪切性能测试，对照组2和实施例1的骨小梁剪切试件各5个。结果如表2所示，对照组2的剪切强度平均值为38.93MPa，实施例1的剪切强度平均值为51.96MPa，显著高于对照组2，为对照组2的1.33倍，有统计学差异(P＜0.01)，提示实施例1的骨小梁剪切强度增强，为YY0502-2016中涂层剪切强度要求(剪切强度20MPa)的2.60倍，本发明增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯骨小梁部分的剪切强度高。
表2对照组2和实施例1的骨小梁剪切试件的剪切实验结果(**P＜0.01，与对照组2比较)
实验证明，实施例2、3制备的增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯，骨小梁部分的钛合金粉熔结程度、剪切性能，实体部分金相组织、拉伸性能，与实施例1制备的增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯相似。
Claims (1)
1.一种增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯，包括半球面本体（9），所述半球面本体的中部设置有带内螺纹的第一圆孔（1），半球面本体的外表面设置有骨小梁（3），所述骨小梁（3）进行分区设置，第一分区线（6）和第二分区线相交，交点过带内螺纹的第一圆孔（1）的中心；
第三分区线（4）呈圆形，位于半球面本体的近边缘处；第一分区线、第二分区线和第三分区线将半球面本体外表面划分为：第一上区（71）、第一下区（72）、第二上区（73）、第二下区（74）、第三上区（75）、第三下区（76）、第四上区（77）和第四下区（78）；第一上区（71）、第二上区（73）、第三上区（75）和第四上区（77）面积相等；
在所述半球面本体的一侧设置有带内螺纹的第二圆孔（2），所述带内螺纹的第二圆孔（2）为3个，其中2个分别设置在第一上区（71）和第三上区（75）内，另1个设置在第一上区（71）和第三上区（75）的交界处；第三上区（75）和第四上区（77）设置有第一种骨小梁（81），第三下区（76）和第四下区（78）设置有第二种骨小梁（82），第一上区（71）设置有第三种骨小梁（83），第一下区（72设置有第四种骨小梁（84），第二上区（73）设置有第五种骨小梁（85），第二下区（74）设置有第六种骨小梁（86）；
所述第一种骨小梁孔径为700μm，孔隙率为65%；所述第二种骨小梁孔径为750μm，孔隙率为71%；所述第三种骨小梁孔径为780μm，孔隙率为76%；所述第四种骨小梁孔径为820μm，孔隙率为79%；所述第五种骨小梁孔径为860μm，孔隙率为81%；所述第六种骨小梁孔径为910μm，孔隙率为84%；所述第一种骨小梁、第二种骨小梁、第三种骨小梁、第四种骨小梁、第五种骨小梁、第六种骨小梁厚度相等，为1.2mm；
所述钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的制备方法，包括如下步骤：
1）以钛合金粉为原料，经3D打印一体成型得到增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯的第一中间产物，将所述第一中间产物放入热等静压炉，在氦气保护下，升温至900℃，在140MPa，恒温放置3h，降至常压，随所述炉冷却至200℃以下，取出，得到第二中间产物：
2）将第二中间产物放置于程序性降温盒中以1℃/min的速度降温至-80℃，恒温放置10h，从程序性降温盒中取出；在液氮中再放置16h，调节温度至室温，得到第三中间产物；
3）将第三中间产物放置于程序性降温盒中以1℃/min的速度降温至-80℃，恒温放置10h；从程序性降温盒中取出；在液氮中再放置16h，调节温度至室温；得第四中间产物，进行机加工修整，得到增材制造钛合金分区骨小梁人工髋关节臼杯；
所述钛合金粉化学成分按质量百分比包括88%的Ti，6.5%的Al，4.5%的V，余量为不可避免的微量杂质；钛合金粉的粒径为45μm-106μm；
步骤2）和3）所述调节温度的步骤为：升温至-120℃，恒温保持5h；升温至-40℃，恒温保持5h；升温至4℃，恒温保持3h，升温。
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