CN112151353B - 原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置。所述电喷雾质谱装置是集激光器、电喷雾装置、位移平台和质谱仪于一体的分析装置。所述电喷雾装置由微型两通、微型接头、微型套筒、熔融石英发射器和熔融石英传输线组成。所述熔融石英发射器出口处尖端的内径为5‑30μm，其内部溶剂的流速100～800nLmin‑1。所述激光器产生的脉冲激光在质谱仪进样口下方3～10mm处形成小于0.5mm的光斑；所述脉冲激光的能量大于200mJ/cm2。所述的位移平板上设置的琼脂平板与质谱仪的进样口的垂直距离为3～10mm。本发明实现了平板上微生物单菌落中代谢物的原位、快速、灵敏的分析，解决了现有技术中选择性低、质谱图复杂难解的技术问题。

Description

原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置
技术领域
本发明属于微生物质谱技术领域，尤其涉及一种原位分析微生物单菌落的质谱装置。
背景技术
目前，基于质谱的微生物代谢分析方法主要包括气相质谱方法和液相质谱方法。这两种方法皆需要对微生物菌株进行扩大培养，以获得足量的生物量；此外，还需要对微生物样品进行细胞破壁、分析物提取、纯化、衍生化等预处理，以及液相/气相色谱的分离过程；才能最终实现质谱分析。综上可知，这两种方法虽然比较成熟，但微生物样本量大、步骤繁琐、耗时耗力且效率低下，而且可能会丢失细胞代谢物的原始信号或产生假阳性信号。因此，在面对成千上万的微生物样本时，液相质谱方法和气相质谱方法均无法满足快速和高通量的分析需求。
为了解决上述技术问题，研究人员提出了激光电喷雾质谱的分析方法。激光电喷雾质谱利用激光的热效应将样品中待测分子解吸(气化)，再通过电喷雾技术使待测分子电离，最终实现质谱检测。通常情况下，激光作用于样品解吸得到的大部分气相分子是中性的，只有少数分子带有电荷；但这些少量带电荷的分子往往无法满足质谱检测的灵敏度。因此，激光技术与电喷雾技术的结合实现了样品中待测分子相继解吸和电离。但现有的激光电喷雾质谱技术往往通过外载气体将激光解吸的气相分子无差别地引入质谱，导致质谱图复杂难解，抑制了目标分子的质谱检测，增加了结果分析的困难。
发明内容
针对现有质谱技术中所存在的问题，本发明提供了原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置。所述装置在进行微生物单菌落分析时，不仅无需复杂的预处理步骤和色谱分离过程，而且样品用量少、选择性高，实现了快速原位分析，大大提升了现有技术中激光电喷雾质谱的性能。
本发明的技术方案：
原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置，包括激光器、电喷雾装置、位移平台和质谱仪，所述激光器位于位移平台的正上方，所述电喷雾装置位于位移平台的前上方，所述质谱仪位于位移平台的后上方，所述电喷雾装置位于质谱仪的正前方。
其中，所述电喷雾装置由微型两通、微型接头、微型套筒、熔融石英发射器和熔融石英传输线组成。两个所述微型接头设置在所述微型两通的两侧，并与之相连；每个所述微型接头均连接一个所述微型套筒。所述的微型套筒靠近质谱仪的一侧设置石英发射器；所述熔融石英发射器的内径为50～75μm，所述石英发射器出口处尖端的内径为5～30μm。所述的发射器尖端与质谱仪的进样口的水平距离为5～10mm。所述的微型套筒远离质谱仪的一侧设置熔融石英传输线；所述的熔融石英传输线的内径为50～75μm。所述的熔融石英传输线远离电喷雾装置的一端与进样针相连；所述进样针的针头施加1～10kV的高电压。所述的进样针载入适合的溶剂，该溶剂在高压电的作用下带上电荷，以100～800nL/min的流速相继进入熔融石英传输线、微型两通和熔融石英发射器，最终在发射器的出口处尖端形成稳定的泰勒锥，并产生纳升级带电雾滴。与现有技术中往往使用载气形成泰勒锥相比，避免了载气将激光解吸的样品分子无差别的带入质谱，导致质谱图谱峰多且复杂，抑制了目标分子的检测的技术问题。
其中，所述激光器产生的脉冲激光在质谱仪的进样口下方3～10mm处形成小于0.5mm的光斑；所述脉冲激光的能量大于200mJ/cm2。所述激光器固定在光学平台上，与质谱仪的进样口之间的垂直距离为20～30cm。所述激光器的激光光路由入射角45°的平面反射镜和平凸透镜组成。所述平面反射镜设置在平面反射镜架上，所述平凸透镜设置在平凸透镜架上。所述平面反射镜与激光器、平凸透镜之间的激光光路均设置套管。所述套管的外侧设有支杆，用于支撑和固定套管。通过调节激光能量和频率等参数，所述激光器的脉冲激光形成聚焦光斑作用于平板上的微生物单菌落，高能量的脉冲激光能够瞬间烧蚀细胞壁、细胞膜和各种细胞器膜，同时解吸细胞内大量代谢物分子，形成气相分子羽流。所述的气相分子羽流在泰勒锥区域与纳升级带电雾滴发生相互作用，适合的试剂将使代谢物分子选择性电离，提高目标分子质谱分析的灵敏度。
其中，所述的位移平板上设置用于培养目标菌株的琼脂平板；所述琼脂平板的琼脂表面与质谱仪的进样口的垂直距离为3～10mm。
优选的是，所述脉冲激光的激光能量为200～600mJ/cm2，频率为1～50Hz。
优选的是，所述的电喷雾装置固定在圆孔支架上；所述的圆孔支架固定在三维微调节底座上，所述的三维微调节底座上设置前后微调节旋钮、左右微调节旋钮和上下微调节旋钮。
优选的是，所述的位移平台固定在水平平板上，所述的水平平板与质谱仪固定相连；所述的位移平台上设置左右微调节旋钮、前后微调节旋钮和上下微调节旋钮。
优选的是，所述的质谱仪的进样口外接金属管，所述金属管的内径为0.5～1.0mm，长度为30～100mm。
利用所述的激光电喷雾质谱装置原位分析微生物单菌落的方法，包括以下步骤：
步骤一：将微生物单菌落的琼脂平板固定在位移平台3上。调节位移平台3的三个微调节旋钮24、25和26，使目标单菌落位于质谱仪4的进样口5的正下方3～10mm处。
步骤二：向所述的电喷雾装置2的进样针中加入液体试剂，在进样针针头处施加1～10kV高电压，设置进样速度为100～800nLmin-1。所述的液体试剂经过电喷雾装置2在熔融石英发射器16的出口处尖端形成泰勒锥，产生纳升级带电雾滴，并在电场作用下进入质谱仪4的进样口5。
步骤三：调整激光器1中的激光光路，使水平激光光源在平面反射镜7作用下形成垂直激光，并在平凸透镜8作用下形成聚焦激光光束，在平凸透镜8正下方约100mm处形成小于0.5mm光斑。调整平凸透镜8与琼脂平板27中单菌落的距离约为100mm，使激光产生的光斑作用在目标单菌落上。脉冲激光能量为200～600mJ/cm2，频率为1～50Hz。
步骤四：优化质谱仪4相关参数，使质谱仪4的信号最佳。
步骤五：在执行步骤一至步骤四的过程中，首先使电喷雾装置2产生稳定的纳升级带电雾滴，质谱仪4进行谱图采集。待质谱仪4采集一段时间的背景谱，将激光1作用在琼脂平板27中的目标单菌落上，使激光烧蚀目标单菌落的细胞壁、细胞膜和各种细胞器膜，并解吸细胞中的代谢物分子形成气相分子羽流。所述的气相分子羽流进入上方泰勒锥区域与所述的电喷雾装置2中产生的纳升级带电雾滴发生相互作用，使细胞代谢产物电离，并通过进样口5进入质谱仪4进行数据采集。
与现有技术相比，本发明的具有以下优点及效果：
(1)本发明所述的激光电喷雾质谱装置是集激光器、电喷雾装置、位移平台和质谱仪于一体的分析装置，实现了平板上微生物单菌落中代谢物的原位、快速、灵敏的分析，解决了现有技术中选择性低、质谱图复杂难解的技术问题。
(2)采用本发明所述的激光电喷雾质谱装置，无需传统质谱的扩大培养、复杂预处理和色谱分离等流程，大大提高了检测效率，对平板上每个单菌落分析时间均小于0.1min，从而实现了批量单菌落的高通量质谱数据采集。
(3)与现有激光电喷雾质谱技术相比，本发明所述的激光电喷雾质谱装置的电喷雾发射器的尖端内径为5～30μm，溶剂在流速100～800nLmin-1，使得发射器尖端和质谱进样口的金属管前端形成稳定的泰勒锥，并产生纳升级带电雾滴，无需常规电喷雾质谱中所必须的载气，从而避免了载气将激光解吸的样品分子无差别的带入质谱，导致质谱图谱峰多且复杂，抑制了目标分子的检测的技术问题。
附图说明
图1为本发明所述的原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置的结构示意图之一。
图2为本发明电喷雾装置的结构示意图。
图3为本发明所述的原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置的结构示意图之二。
图4为实施例5质谱仪采集的背景和菌落细胞代谢物的总离子流图。
图5为实施例5平板上裂殖壶菌单菌落代谢物的质谱指纹图(已除背景图)。
图6为实施例5中野生型裂殖壶菌和突变型裂殖壶菌的单菌落代谢物质谱指纹谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
为了进一步清楚了解本发明，下面结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚和完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置，包括激光器1、电喷雾装置2、位移平台3和质谱仪4，所述激光器1位于位移平台3的正上方，所述电喷雾装置2位于位移平台3的前上方，所述质谱仪4位于位移平台3的后上方，所述电喷雾装置2位于质谱仪4的正前方。
所述电喷雾装置2由微型两通13、微型接头14、微型套筒15、熔融石英发射器16和熔融石英传输线17组成。两个所述微型接头14设置在所述微型两通13的两侧，并与之相连；每个所述微型接头14均连接一个所述微型套筒15。微型套筒15靠近质谱仪4的一侧设置石英发射器16；所述熔融石英发射器16的内径为55μm，所述石英发射器16出口处尖端的内径为15μm。所述的发射器16尖端与质谱仪4的进样口5的距离为6mm。微型套筒15远离质谱仪4的一侧设置熔融石英传输线17；所述的熔融石英传输线17的内径为55μm。所述的熔融石英传输线17远离电喷雾装置2的一端与进样针相连。所述进样针的针头施加5.0kV的高电压；所述进样针中加入溶剂试剂，进样流速为300nL/min。
所述激光器1固定在光学平台6上，与质谱仪4的进样口5之间的垂直距离为25cm。所述激光器1为Nd:YAG固体脉冲激光器，所述脉冲激光的波长为1064nm，所述脉冲激光的激光能量为300mJ/cm2，频率为10Hz。所述激光器1产生的脉冲激光在质谱仪4的进样口5下方8mm处形成小于0.5mm的光斑。所述激光器1的激光光路由入射角45°的平面反射镜7和平凸透镜8组成，所述平面反射镜7设置在平面反射镜架9上，所述平凸透镜8设置在平凸透镜架10上，所述平面反射镜7与激光器1、平凸透镜8之间的激光光路均设置套管11。所述套管11的外侧设有支杆12，用于支撑和固定套管11。
所述的位移平板3上设置用于培养目标菌株的琼脂平板27；所述琼脂平板27的琼脂表面与质谱仪4的进样口5的垂直距离为8mm。
实施例2：与实施例1不同的是，
所述的电喷雾装置2固定在圆孔支架18上；所述的圆孔支架18固定在三维微调节底座19上，所述的三维微调节底座19上设置前后微调节旋钮20、左右微调节旋钮21和上下微调节旋钮22。
所述的位移平台3固定在水平平板23上，所述的水平平板23与质谱仪4固定相连；所述的位移平台3上设置左右微调节旋钮24、前后微调节旋钮25和上下微调节旋钮26。
所述的质谱仪4的进样口5外接金属管28，所述金属管28的内径为0.55mm，长度为50mm。
实施例3：与实施例2不同的是，
所述熔融石英发射器16的内径为75μm，所述石英发射器16出口处尖端的内径为30μm。所述的发射器16尖端与质谱仪4的进样口5的距离为10mm。所述的熔融石英传输线17的内径为75μm。所述进样针的针头施加8.0kV的高电压；所述进样针中加入溶剂试剂，进样流速为800nL/min。所述的金属管28的内径为1.0mm，长度为30mm。
所述激光器为Er：YAG固体激光器，所述脉冲激光的波长为2940nm，所述脉冲激光的激光能量500mJ/cm2，频率5Hz。所述激光器1与质谱仪4的进样口5之间的垂直距离为20cm。所述激光器1产生的脉冲激光在质谱仪4的进样口5下方3mm处形成小于0.5mm的光斑。
所述琼脂平板27的琼脂表面与质谱仪4的进样口5的垂直距离为3mm。
实施例4：与实施例2不同的是，
所述熔融石英发射器16的内径为50μm，所述石英发射器16出口处尖端的内径为5μm。所述的发射器16尖端与质谱仪4的进样口5的距离为5mm。所述的熔融石英传输线17的内径为50μm。所述进样针的针头施加2.0kV的高电压；所述进样针中加入溶剂试剂，进样流速为150nL/min。所述的金属管28的内径为0.8mm，长度为100mm。
所述激光器1与质谱仪4的进样口5之间的垂直距离为30cm。所述脉冲激光的激光能量为600mJ/cm2，频率为1Hz。所述激光器1产生的脉冲激光在质谱仪4的进样口5下方10mm处形成小于0.5mm的光斑。
所述琼脂平板27的琼脂表面与质谱仪4的进样口5的垂直距离为10mm。
实施例5：原位分析微生物单菌落
采用实施例2所述的原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置，原位分析裂殖壶菌单菌落。
所述激光器1中的激光光源分别通过平面反射镜7和平凸透镜8在质谱仪4的进样口的下方8mm处形成0.3mm左右光斑，激光器1采用波长为1064nm，能量为300mJ/cm2和频率为10Hz；所述的电喷雾装置2的进样针中载有300mL的甲醇-0.1％甲酸溶液，样品流速为300nL/min。当在进样针的针头处施加5.0kV的正高压电，甲醇-0.1％甲酸溶液会在熔融石英发射器16的尖端形成带正电纳升级喷雾，并在电场作用下进入质谱仪4的进样口。同时，质谱仪4对带正电荷的离子进行数据采集，得到如图4所示的质谱采集的背景信号。
将培育成熟的野生型裂殖壶菌的琼脂平板放置并固定于位移平台3上，通过调节上下、前后和左右微调节旋钮，使平板上目标单菌落位于质谱仪4的进样口5下方8mm处。激光器1产生的聚焦光斑作用在目标单菌落上，烧蚀解吸目标单菌落细胞中的代谢产物，这些代谢产物与电喷雾装置2中产生的纳升级带电雾滴在质谱仪4进样口前端发生碰撞和电荷转移，使细胞中代谢产物电离并进入质谱仪4中进行分析，分别得到如图4和图5所示的代谢物的离子流图和质谱指纹图。
同理，利用本发明装置对琼脂平板上突变型裂殖壶菌的单菌落进行原位分析。图5中分别展示出野生型和突变型裂殖壶菌在m/z700-1100范围内代谢物的质谱指纹谱，明显观察到代谢物丰度的变化。
采用实施例1、实施例3和实施例4所述的原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置，原位分析裂殖壶菌单菌落，同样得到了相应的质谱指纹图。这充分说明，本发明所述的激光电喷雾质谱装置，实现了微生物单菌落的原位分析，并且进一步可用于微生物菌种的鉴定和区分。

Claims (8)

1.原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置，包括激光器（1）、电喷雾装置（2）、位移平台（3）和质谱仪（4），所述激光器（1）位于位移平台（3）的正上方，所述电喷雾装置（2）位于位移平台（3）的前上方，所述质谱仪（4）位于位移平台（3）的后上方，所述电喷雾装置（2）位于质谱仪（4）的正前方，其特征在于：所述电喷雾装置（2）由微型两通（13）、微型接头（14）、微型套筒（15）、熔融石英发射器（16）和熔融石英传输线（17）组成；两个所述微型接头（14）设置在所述微型两通（13）的两侧，并与之相连；每个所述微型接头（14）均连接一个所述微型套筒（15）；微型套筒（15）靠近质谱仪（4）的一侧设置熔融石英发射器（16）；所述熔融石英发射器（16）的内径为50～75µm，出口处尖端的内径为5～30µm，所述的熔融石英发射器（16）的尖端与质谱仪（4）的进样口（5）的水平距离为5～10mm；微型套筒（15）远离质谱仪（4）的一侧设置熔融石英传输线（17），所述的熔融石英传输线（17）的内径为50～75µm；所述熔融石英传输线（17）远离电喷雾装置（2）的一端与进样针相连；所述进样针的针头施加1～10kV的高电压；所述进样针中加入溶剂试剂，进样流速为100～800 nL/min；所述激光器（1）产生的脉冲激光在质谱仪（4）的进样口（5）下方3～10mm处形成小于0.5mm的光斑；所述脉冲激光的能量大于200mJ/cm2。
2.根据权利要求1所述的原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置，其特征在于所述脉冲激光的激光能量为200～600mJ/cm2，频率为1～50Hz。
3.根据权利要求2所述的原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置，其特征在于：所述激光器（1）的激光光路由入射角45°的平面反射镜（7）和平凸透镜（8）组成，所述平面反射镜（7）设置在平面反射镜架（9）上，所述平凸透镜（8）设置在平凸透镜架（10）上，所述平面反射镜（7）与激光器（1）、平凸透镜（8）之间的激光光路均设置套管（11）。
4.根据权利要求3所述的原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置，其特征在于：所述激光器（1）固定在光学平台（6）上，与质谱仪（4）的进样口（5）之间的垂直距离为20～30cm；所述套管（11）的外侧设有支杆（12），用于支撑和固定套管（11）。
5.根据权利要求2所述的原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置，其特征在于：所述的电喷雾装置（2）固定在圆孔支架（18）上；所述的圆孔支架（18）固定在三维微调节底座（19）上，所述的三维微调节底座（19）上设置前后微调节旋钮（20）、左右微调节旋钮（21）和上下微调节旋钮（22）。
6.根据权利要求2所述的原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置，其特征在于：所述的位移平台（3）上设置用于培养目标菌株的琼脂平板（27）；所述琼脂平板（27）的琼脂表面与质谱仪（4）的进样口（5）的垂直距离为3～10mm。
7.根据权利要求6所述的原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置，其特征在于：所述的位移平台（3）固定在水平平板（23）上，所述的水平平板（23）与质谱仪（4）固定相连；所述的位移平台（3）上设置左右微调节旋钮（24）、前后微调节旋钮（25）和上下微调节旋钮（26）。
8.根据权利要求2所述的原位分析微生物单菌落的激光电喷雾质谱装置，其特征在于：所述的质谱仪（4）的进样口（5）外接金属管（28），所述金属管（28）的内径为0.5～1.0mm，长度为30～100mm。
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