CN113866252A - 质谱单细胞分析装置及方法 - Google Patents

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张涛
闻路红
丁昆
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    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
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Abstract

本发明提供了一种质谱单细胞分析装置及方法，所述质谱单细胞分析装置包括反电极，所述反电极用于获取激光物理参数；激光单元，所述激光单元包括激光器和控制单元；检测单元，所述检测单元用于检测激光物理参数；记录单元，所述记录单元用于记录激光物理参数；光束控制单元，所述光束控制单元用于控制激光灼蚀指定的细胞；移动单元，所述移动单元用于移动电喷雾毛细管选择性地移动到任一细胞的上侧，或移动到质谱进样口。本发明具有精度高、效率高等优点。

Description

质谱单细胞分析装置及方法
技术领域
本发明涉及细胞分析，特别涉及质谱单细胞分析装置及方法。
背景技术
代谢组学是继基因组学，转录组学和蛋白质组学之后,系统生物学的重要领域.代谢组学技术可使基因和蛋白表达的微小变化在代谢物水平得到放大,并将代谢信息与病理生理过程中生物学事件关联起来，从而了解机体生命活动的代谢过程。代谢物是具有不同理化特性的小分子，丰度水平差异很大，这使得它们的鉴定和分析具有挑战性。同时，近年来，科学家发现细胞间存在异质性，不同功能表型的混合细胞群体以一种动态平衡的方式存在,然后在不同状态下经历表型的转变，呈现的形态各异、高等生物存在的细胞极性分化、细胞离体培养常有的表型差异、生长差异和周期差异等。因此，单细胞水平的代谢分析今年来取得了快速的发展，但方法还不够完善，未像单细胞测序如此成熟。
通常，光谱分析法，如傅里叶变换红外光谱法、核磁共振(NMR)和质谱技术与分离技术如气相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳相结合，已被用于代谢组学。质谱(MS)是一种多功能技术，与色谱分离相结合，可以提供具有高选择性和灵敏度以及宽动态范围的复杂样品的定性和定量分析。然而，传统的质谱方法耗时且涉及大量的样品制备。直接采样方法的应用，如流动注射电喷雾电离(ESI)，可以避免色谱分离，但不能避免可能影响样品完整性的大量样品制备，在某些情况下，可能会导致代谢物降解。因此，这些技术通常会限制样品的选择并阻碍其原位分析。
这些问题中的一些可以通过使用大气压离子源来缓解。大气压离子源的最新进展，例如实时直接分析(DART)、解吸电喷雾电离(DESI)、大气压红外基质辅助激光解吸电离(AP IR-MALDI)和激光烧蚀电喷雾电离(LAESI)可以直接分析细胞和组织样品，而无需进行大量样品制备。使用DART、DESI和MALDI技术分析细胞、细胞培养物和细胞提取物可能有其自身的局限性，例如分析物的覆盖范围、仅表面取样和定量限制。根据某些实施方案，LAESI-MS可以提供原位细胞和组织分析，
目前的激光解吸离子化，特别适用于难挥发的合成聚合物和热不稳定的有机分子、生物分子的分析。但必须具有能较好吸收激光的物质才能产生解析，检测上限低于3000。且获得分子离子和有结构信息的碎片，适于结构复杂、不易气化的大分子。而电喷雾电离源是一种软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适合于分析极性强的大分子有机化合物。因此两者结合形成了激光解析电喷雾电离技术，增加了化合物检测、分析的范围。
目前存在的问题：
1、激光解吸电喷雾技术目前为激光照射、电喷雾同时进行，未对激光解析、电喷雾电离的顺序、时间进行优化。
2、仅表面取样，定量限制、分析物的翻盖范围有限。
3、电喷雾试剂使用量较大，无法满足哺乳动物单细胞(体积仅约为一皮升)常规分析方法的检测要求。
发明内容
为解决上述现有技术方案中的不足，本发明提供了一种高效率、高精度的单细胞分析装置。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
质谱单细胞分析装置，所述质谱单细胞分析装置包括显微镜、质谱、电喷雾毛细管、高压电源、培养皿；其特征在于，所述质谱单细胞分析装置还包括：
反电极，所述反电极用于获取激光物理参数；
激光单元，所述激光单元包括激光器和控制单元；
检测单元，所述检测单元用于检测激光物理参数；
记录单元，所述记录单元用于记录激光物理参数；
光束控制单元，所述光束控制单元用于控制激光灼蚀指定的细胞；
移动单元，所述移动单元用于移动电喷雾毛细管选择性地移动到任一细胞的上侧，或移动到质谱进样口。
所述激光器用于灼蚀细胞。
所述检测单元可以是示波器。
所述光束控制单元包括二向透镜、准直镜、锐化光纤。
所述移动单元包括三维移动平台和样品架。
所述激光器可以是Er:YAG激光或Nd:YAG激光。
所述激光器波长为2600nm至3450nm。
质谱单细胞分析方法，所述质谱单细胞分析方法为：
细胞接种至培养皿；
用0.9％的甲酸铵溶液清洗细胞2～3遍；
将细胞放入真空干燥箱内负压干燥；
将处理后的培养皿置于显微镜载物台；
激光照射至细胞表面，同时甲醇萃取细胞，获得萃取液；
移动单元移动电喷雾毛细管选择性地移动到细胞上侧，并吸取萃取液；
移动单元移动电喷雾毛细管到质谱进样口；
电喷雾毛细管施加电压，质谱检测样品。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
1.检测范围广；
通过微量液滴萃取、激光解析及电喷雾电离的结合，最大限度地减少解吸分子离子的损失，扩大了分析物的覆盖范围。
2.检测效率高；
萃取、激光灼蚀同时进行，显著地提高了整个分析的效率；
全自动的检测方法，不再依赖人工操作，为单细胞的自动化检测奠定了基础。
附图说明
参照附图，本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是：这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。图中：
图1是根据本发明实施例的质谱单细胞分析装置的结构示意图；
图2是根据本发明实施例的质谱单细胞分析方法的流程示意图；
图3是根据本发明实施例的质谱单细胞分析应用的示意图。
具体实施方式
附图和以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域技术人员如何实施和再现本发明。为了教导本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。本领域技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替换将在本发明的范围内。本领域技术人员应该理解下述特征能够以各种方式组合以形成本发明的多个变型。由此，本发明并不局限于下述可选实施方式，而仅由权利要求和它们的等同物限定。
实施例1：
图1示意性地给出了本发明实施例1的质谱单细胞分析装置的结构图，如图1所示，所述质谱单细胞分析装置包括：
质谱单细胞分析装置，所述质谱单细胞分析装置包括显微镜、质谱、电喷雾毛细管、高压电源、培养皿；其特征在于，所述质谱单细胞分析装置还包括：
反电极8，所述反电极用于获取激光物理参数；
激光单元14，所述激光单元包括激光器和控制单元；
检测单元10，所述检测单元用于检测激光物理参数；
记录单元12，所述记录单元用于记录激光物理参数；
光束控制单元16，所述光束控制单元用于控制激光灼蚀指定的细胞；
移动单元20，所述移动单元用于移动电喷雾毛细管选择性地移动到任一细胞的上侧，或移动到质谱进样口。
所述激光器用于灼蚀细胞。
所述检测单元10可以是示波器。
所述光束控制单元14包括二向透镜、准直镜、锐化光纤。
所述移动单元20包括三维移动平台和样品架。
所述激光器可以是Er:YAG激光或Nd:YAG激光。
所述激光器波长为2600nm至3450nm。
实施例2：
根据某些实施例，用于激光烧蚀微滴萃取电喷雾电离质谱的质谱仪通常可以包括激光系统、电喷雾设备和质谱仪。激光系统可以包括激光器和聚焦系统，聚焦系统包括光纤、耦合透镜和/或聚焦透镜，以及具有样品安装座的xyz平移台。电喷雾设备可以包括具有电源和注射泵的电喷雾电离发射器。质谱离子源可以包括固态照相机。质谱离子源可以包括用于包围样品、样品架和/或电喷雾发射器的护罩。平移台和样品环境可以是温度控制的和/或气氛控制的。这是为了保持样品的完整性并避免环境中的水分凝结。温度可以在-10℃到60℃的范围内。相对湿度可以在10％到90％的范围内。萃取溶剂包括但不限于甲醇、乙腈、二氯甲烷、、二甲基亚砜、四氢呋喃等。
在某些实施例中，反应气体的实例包括但不限于N2、SO2和NO2。
在某些实施例中，包括LAESI离子源的质谱仪通常可以包括电喷雾毛细管2、高压电源6、反电极8、示波器10、记录装置12、例如，个人计算机，激光器14，光束控制装置16，例如镜，聚焦装置18，例如透镜或锐化光纤，具有xyz定位台20的样品架、质谱仪22。
在某些实施例中，包含LAESI离子源的质谱仪通常可包含电喷雾毛细管(E)、可选的带泵的液体供应(SP)、高压电源(HV)、激光器，例如Er:YAG激光或Nd:YAG激光驱动的光学参量振荡器、光束转向装置，例如镜子(M)、聚焦装置，例如透镜或锐化光纤、带有xyz定位台(TS)的样品架、长-距离视频显微镜(FMM)、第二个视频显微镜(CSM)和质谱仪(MS)。在某些实施例中，包括LAESI离子源的质谱仪可以包括蚀刻的光纤尖端(F)以产生中红外烧灼产物，该产物可以被电喷雾羽流拦截并被后电离以形成由质谱仪采样的离子。多发性硬化症)，一个长距离视频显微镜(光纤监视器，FMM)，以保持光纤尖端和样品表面(S)之间的恒定距离，放置在三轴平移台(TS)上的样品，以及第二个视频显微镜(细胞定点显微镜(CSM)以瞄准样品。可以通过向毛细管发射器(E)施加高压(HV)并通过注射泵(SP)保持恒定的溶液流速来产生电喷雾。来自激光器的脉冲可以耦合到光纤，通过光纤卡盘(C)和五轴光纤支架(FM)进行调整，使用两个镀金反射镜(M)和一个CaF可以通过向毛细管发射器(E)施加高压(HV)并通过注射泵(SP)保持恒定的溶液流速来产生电喷雾。来自激光器的脉冲可以耦合到光纤，通过光纤卡盘(C)和五轴光纤支架(FM)进行调整，使用两个镀金反射镜(M)和一个CaF可以通过向毛细管发射器(E)施加高压(HV)并通过注射泵(SP)保持恒定的溶液流速来产生电喷雾。来自激光器的脉冲可以耦合到光纤，通过光纤卡盘(C)和五轴光纤支架(FM)进行调整，使用两个镀金反射镜(M)和一个CaF2镜头(L)。LAESI-MS设备可以包括记录设备，例如个人计算机。包括LAESI离子源的质谱仪可以被配置用于单细胞分析。用于单个细胞的LAESI-MS方法可包括使用显微操作器并将激光光斑尺寸从5μm减小到200μm。
在某些实施例中，烧灼羽流(LA)可以与电喷雾羽流(ES)相交。电喷雾液滴从发射器向下游移动(从左到右)。电喷雾液滴被从烧灼羽流向上移动的颗粒拦截。烧灼羽流可包括1μm至3μm的颗粒。在两个羽流的交叉处，一些烧蚀的颗粒可能与电喷雾液滴融合以形成包含一些烧蚀材料的带电液滴，并最终在ESI过程中产生离子。电喷雾发射器可以在脉动喷雾方式和/或锥形喷射方式中操作脉动喷雾方式可能提供较低的占空比并产生较大的电喷雾液滴，从而导致较低的电离效率和LAESI信号。锥形喷射机制可能会产生较小的电喷雾液滴，从而导致更高的电离效率和LAESI信号。
在某些实施例中，激光器可以包括红外激光器。红外激光器可以在2600nm至3450nm的波长下工作，例如2800nm至3200nm，以及2930nm至2950nm。激光器可以包括在2600nm至3450nm的波长、1Hz至100Hz的重复频率和0.5ns至50ns的脉冲宽度下操作的中红外脉冲激光器。在至少一个实施例中，激光器可以包括二极管泵浦的Nd:YAG激光驱动光学参量振荡器(OPO)工作在2940nm、100Hz重复率和5ns脉冲宽度。光纤可以包括氧化锗(GeO2)基光纤，其尖端蚀刻到1μm到50μm的曲率半径，例如5μm到25μm和10μm至15μm。在至少一个实施例中，曲率半径可以是15μm。光纤可以将激光脉冲传送到样品。激光脉冲在耦合到光纤之前的能量可以从0.1mJ到6mJ，因此脉冲到脉冲的能量稳定性一般对应于2％到10％。在至少一个实施例中，激光脉冲在耦合到光纤之前的能量可以为554±26μJ，因此脉冲到脉冲的能量稳定性通常对应于5％。激光系统可以在100Hz下工作0.01秒至20秒以烧蚀样品。在至少一个实施例中，激光系统可以在100Hz下运行1秒以烧蚀样品。在某些实施例中，可将1至100个激光脉冲传送至样品以供分析。
实施例3：
将人类常规膀胱癌细胞(TCCSUP)培养在含PDMS的培养皿中，其中PDMS为10:1的液态PDMS(Sylgard 184，道康宁)与固化剂混合后经真空负压30min将气泡排出，60℃烘烤4小时使其固化在培养皿中。细胞培养过程中所用的培养基为DMEM1640并向其加入10％的胎牛血清。将培养皿放入含95％的空气和5％的CO2以及温度为37℃的培养箱内培养细胞。培养2-3天后，丢弃培养液并用0.9％的甲酸铵溶液(4℃)清洗细胞2～3遍。然后将细胞放入真空干燥箱内30min进行真空负压干燥。
根据某些实施例，质谱法通过红外激光系统进行。光学参量振荡器(OPO)将100Hz重复频率Nd:YAG激光器的输出转换为2940nm波长下持续时间为5ns的中红外脉冲。光束转向和聚焦由镀金反射镜和150mm焦距CaF 2完成镜头。在喷雾毛细管尖端下游5-6mm处，使用平均输出能量为0.3mJ/脉冲的激光束以直角(90°)烧蚀组织样本。激光光斑尺寸通过在相纸上产生的燃烧图案的光学显微镜来确定。激光光斑尺寸具有300μm的直径。
根据某些实施方案，电喷雾系统包括低噪声注射泵，高压为2000V，针尖直径约3μm，注射压力800mbar，针尖抬升速度1000μm/s。稳压电源直接加到发射器上。50％甲醇作为萃取液，毛细针以79°产生约300PL液滴，萃取7s后，自动抬升至采样锥的孔口(电喷雾发射器同轴)，距离其尖端12mm，喷雾2s后，能量为0.3mJ/脉冲的激光束以直角(90°)烧蚀组织样本，5s后结束实验。
采用ddMS模式进行数据采集，从单细胞样品中获得MS和MS2质谱数据。将MS扫描的覆盖范围设置为m/z 50～1000。
一级质谱结果结果如图3所示，3A为常规激光电喷雾质谱所得结果，3B为激光微滴萃取电喷雾质谱所得结果，两者的电离性能显现出了显著的差异，后者额外获得了包括m/z80、m/z 104、m/z 203等在内的多个目标离子，证明了其在离子化性能上的优势，更有利于暴露低丰度的物质，具有更高的灵敏度和监测能力。

Claims (8)

1.质谱单细胞分析装置，所述质谱单细胞分析装置包括显微镜、质谱、电喷雾毛细管、高压电源、培养皿；其特征在于，所述质谱单细胞分析装置还包括：
反电极，所述反电极用于获取激光物理参数；
激光单元，所述激光单元包括激光器和控制单元；
检测单元，所述检测单元用于检测激光物理参数；
记录单元，所述记录单元用于记录激光物理参数；
光束控制单元，所述光束控制单元用于控制激光灼蚀指定的细胞；
移动单元，所述移动单元用于移动电喷雾毛细管选择性地移动到任一细胞的上侧，或移动到质谱进样口。
2.根据权利要求1所述的质谱单细胞分析装置，其特征在于，所述激光器用于灼蚀细胞。
3.根据权利要求1所述的质谱单细胞分析装置，其特征在于，所述检测单元可以是示波器。
4.根据权利要求1所述的质谱单细胞分析装置，其特征在于，所述光束控制单元包括二向透镜、准直镜、锐化光纤。
5.根据权利要求1所述的质谱单细胞分析装置，其特征在于，所述移动单元包括三维移动平台和样品架。
6.根据权利要求2所述的质谱单细胞分析装置，其特征在于，所述激光器可以是Er:YAG激光或Nd:YAG激光。
7.根据权利要求6所述的质谱单细胞分析装置，其特征在于，所述激光器波长为2600nm至3450nm。
8.质谱单细胞分析方法，所述质谱单细胞分析方法为：
细胞接种至培养皿；
用0.9％的甲酸铵溶液清洗细胞2～3遍；
将细胞放入真空干燥箱内负压干燥；
将处理后的培养皿置于显微镜载物台；
激光照射至细胞表面，同时甲醇萃取细胞，获得萃取液；
移动单元移动电喷雾毛细管选择性地移动到细胞上侧，并吸取萃取液；
移动单元移动电喷雾毛细管到质谱进样口；
电喷雾毛细管施加电压，质谱检测样品。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114678253A (zh) * 2022-03-16 2022-06-28 中国科学技术大学 用于多细胞或单细胞样本在线快速预处理质谱分析的装置及其应用
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