JP2012510062A - 赤外レーザアブレーションによる三次元の分子画像のエレクトロスプレーイオン化質量分析 - Google Patents
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Abstract
Description
[001]この一部継続出願は米国特許法第120条に基づく優先権を主張し、2008年7月18日に出願された米国出願第12/176,324号の出願日の利益を受ける権利を有し、その内容は全体として参照により本願に組み込まれる。
連邦政府による支援を受けた研究に関する陳述
[002]米国政府は国立科学財団からの補助金(交付#0719232)及びエネルギー省からの補助金(交付#DEFG02−01ER15129)及びW.M.Keck財団によるもの(交付#041904)に基づいて本発明に利益を有する。
[0018]別の好ましい実施例において、各パルスのアブレーションの深さを記録しながら、レーザのエネルギー及び/又はレーザの波長を連続的に調整することによって、試料の水分量及び引張強度の分散を補正する、自動化されたフィードバック機構をさらに備えた装置が本明細書において提供される。
結果及び考察
[0027]三次元分子画像化
[0028]最初に、LAESIの3D分子画像化能力が原理実験の実証で評価された。S. Lyniseの向軸及び背軸の表面は、それぞれ、ベーシックブルー7及びローダミン6G染色で、約1mm幅の直角線及び直径4mmのスポットによってマークされた。波長2.94μmのレーザパルスがこのモックサンプルの向軸(上部)表面に集束され、10.5×12.5mm2の面積に渡る22×26グリッドにおける各点に対して、組織の6つの段階の深さ(奥行き)プロフィールが得られた。結果として得られる直径350nm、高さ40nm、すなわち分析容量約4nLの3432個の円柱ボクセルの各々は、高分解能の質量スペクトルを生じさせた。顕微鏡検査により、S. Lynise表皮細胞の露出した表面は、約20μm及び約60μmの軸を備えた楕円形状であることが明らかとなった。細胞の平均の高さは15μmであった。したがって、各約4nLの画像化ボクセルが分析のために約300の細胞をサンプリングした。
[0040]三次元における内因性代謝物の位置特定についての詳細な情報が、横方向画像化技術によってアクセス可能でないかもしれない器官の代謝特性を明らかにする可能性がある。LAESI 3D IMSによって得られる情報は、生体レベルで植物の斑入りについて把握することに役に立つかもしれない。実験において、A. Squarrosaの斑入りの葉をモデル器官として選択した。薄黄色と葉縁素斑入りの部分にある細胞は異なる遺伝子型のものである。LAESIを備えた二次元(2D)のIMSによって、2つの組織部分間での代謝の相違が明らかにされた。例えば、斑入り部分がケンぺロール及びルテオリンベースの二次代謝物を蓄積することが発見された。しかし、横方向画像化は、変化された代謝物組成の原因を、斑入りパターン又は脈管系における細胞に帰することができなかった。葉脈における合成された代謝物は、周囲に蓄積して、斑入りの細胞内に分泌された二次代謝物のアレイを残し得る。LAESI IMSを備える3Dの分子分析はこれらの状態を区別できる可能性がある。
結論
[0050] LAESIは、従来の生物医学画像化技術において一般に要求される適合されたレポーター分子の必要性を排除しつつ、多様な生体分子を同時に調査できる、大気イオン化源である。検出の下限が低い生体内分析、定量化の能力、及び分子スケールでの横方向及び深さ方向分析は、ライフ・サイエンスにおける大きな可能性を予測する本方法の更なる長所である。例えば、本明細書に記載される二次代謝物の分布を使用して、植物内の組織又は細胞の特異性に対する酵素を指摘することができる。植物、動物及び人間の組織又は細胞の水を含有する器官又は全身の部分は、MSによって提供されるイオンの全景により自然条件下で初めて3D分析を施すことができる。
方法及び材料
[0052]レーザアブレーションエレクトロスプレーイオン化
[0053]エレクトロスプレー源は最近説明したものと同じである。低雑音シリンジポンプ(Physio 22、Harvard Apparatus、Holiston, MA)は、0.1%(v/v)の酢酸を含有する50%メタノール溶液を先細の(テーパー形状の)チップ金属エミッター(tapered tip metal emitter)(100μm i.d.及び320μm o.d.、New Objective、Woburn、MA)を介して供給した。エレクトロスプレーは、安定した高電圧を調整された電源(PS350, Stanford Research System, Inc., Sunnyvale, CA)を介して直接に適用することによって開始された。コーンジェットモード(cone-jet mode)を確立するように流速及びスプレー電圧が調整された。この軸方向スプレーモードがイオン生成に対してもっとも効率的であると報告されている。
[0058]LAESI構成のすべての構成要素を所定位置に保持しつつ、試料表面を走査するように、三軸トランスレーションステージ(translation stage)は精度モーターアクチュエータ(LTA-HS,Newport corp、Irvine、CA)により位置決めされた。アクチュエータの移動距離は50mmであり、最小の移動の増分は0.1μmであった。したがって、分解能は、入射レーザビームの集束とアブレーションクレーターの寸法(直径約350μm)によって決定される。調査された領域の重複を回避するために、試料表面はX及びY方向に500μmのステップサイズで走査された。各座標において、生体組織の断面は6つのレーザパルスによって分析される一方、生成されるイオンは質量分析計で30秒間記録された。この設定のもと、12.5×10.5mm2の領域の三次元画像化は、約5時間の全分析時間を要した。将来の応用においては、レーザアブレーションのより高い繰り返し率と低減されたイオン収集時間とがこの分析時間を大きく短縮できる。トランスレーションステージを位置決めし、分析時間を対応するX−Y座標とレーザパルスに対して与えるために、ソフトウェア(LabView 8.0)が社内で書かれた。質量を選択されたイオンの出力されたデータセットは三次元分布に変換され、科学技術可視化パッケージ(Origin 7.0,、OriginLab Co.、Northampton、MA)により等高線図の画像において提示された。
[0060]氷酢酸(TraceSelect grade)、グラジエントグレード水(gradient grade water)及びメタノールがSigma Aldrichから得られ、そのままで使用された。テッポウユリ(Spathiphyllum Lynise)及びゼブラプラント(Aphelandra Squarrosa)は、約1年半の年齢で近くの花屋で購入された。植物は触ると適度に濡れる状態を維持するために、2日毎に約300mLの水道水で水をやっていた。肥料は実験で何も使用されなかった。温度と光条件は20〜25°Cで直射日光から守るよう日の当らないところに置かれた。
Claims (10)
- 例えば質量分析法によりサンプリングされた生体組織又は細胞の試料の三次元画像化のための方法であって、
前記生体組織の試料又は細胞に赤外LAESI質量分析法を行うステップを含み、
LAESI-MSは前記生体組織又は細胞の試料に対してLAESI-MS装置を直接的に使用して実行され、前記試料は従来の化学的/物理的な前処理を必要とせず、前記LAESI-MS装置は、グリッド上の複数点の横方向走査及び深さ方向走査のための又は前記生体組織もしくは細胞の試料上に規定される細胞パターンもしくは関心のある領域を追跡するための、及び、前記グリッド上の各点で複数のアブレーションを行うことによって各点の深さ方向分析をし又は前記細胞パターンもしくは関心のある領域を追跡するための、3D走査装置を備えており、前記アブレーションの各レーザパルスは前記生体組織又は細胞の試料について前のパルスより深い層を除去し、横方向走査と深さ方向分析の組み合わせによって三次元の分子分布画像化データが得られることを特徴とする方法。 - 試料の三次元画像化を生成する大気イオン化方法であって、
i)試料を除去するために赤外レーザで前記試料を照射するステップと、
ii)前記試料の気相イオンを形成するためにこのアブレーションプルームをエレクトロスプレーで遮断するステップと、
iii)生成されたイオンを質量分析法を使用して分析するステップと
を含み、LAESI-MSは生体組織又は細胞の試料にLAESI-MS装置を直接使用して行われ、前記試料は、従来のMS前処理を必要とせず、大気圧下で行われ、前記LAESI-MS装置は、グリッド上の複数点の横方向走査及び深さ方向走査のための又は前記生体組織もしくは細胞の試料上に規定される細胞パターンもしくは関心のある領域を追跡するための、及び、前記グリッド上の各点で複数のアブレーションを行うことによって各点の深さ方向分析をし又は前記細胞パターンもしくは関心のある領域を追跡するための、走査装置を備えており、前記アブレーションの各レーザパルスは前記生体組織又は細胞の試料について前のパルスより深い層を除去し、横方向走査と深さ方向分析の組み合わせによって三次元の分子分布画像化データが得られることを特徴とする方法。 - LAESI-MSは前記試料内の目標分子からイオンを検出し、前記イオンは、薬剤、染料、爆薬もしくは爆薬残留物、麻薬、重合体、生体分子、化学兵器及びその特性、ペプチド、代謝物、脂質、オリゴ糖類、蛋白質及び他の生体分子、合成有機物、薬物、並びに有毒化学物質からなる群から選択されることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- イオン生成を促進するため又は分析されたイオンにおいて反応を引き起こすために、ガス相における反応物質、試料の存在下又はエレクトロスプレーされた溶液中で、LAESI-MSが行われることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 異なるイオンの間の代謝関係を識別するべく前記異なるイオンの強度分布間の共分散の程度を測定するために、LAESI三次元画像化質量分析法によって生成される分子分布が空間において相互相関し、LAESI三次元画像化質量分析によって識別された組織内の代謝物の共局在性が、代謝経路内及び代謝経路間の関連の発見を助け得ることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 試料の三次元画像化のためのLAESI-MS装置であって、
i)アブレーションのために試料においてエネルギーを放射するパルス赤外レーザと、
ii)レンズ、ミラー又は先細の光ファイバに基づく集束光学素子と、
iii)荷電液滴のスプレーを生成するエレクトロスプレー装置と、
iv)生成されたイオンを捕獲するイオン移動吸気口を有する質量分析計と、
v)グリッド上の複数点の横方向走査及び深さ方向走査のための又は前記試料上に規定される細胞パターンもしくは関心のある領域を追跡するための、及び、前記グリッド上の各点での複数のアブレーションの実行を制御することによって各点の深さ方向分析をし又は前記細胞パターンもしくは関心のある領域を追跡するための、走査装置及びソフトウェアと
を備え、前記アブレーションの各レーザパルスは前記試料について前のパルスより深い層を除去し、横方向走査と深さ方向分析の組み合わせによって三次元の分子分布画像化データが得られ、前記ソフトウェアによりレンダリングされることを特徴とするLAESI-MS装置。 - さらにLAESI-MSが大気圧下で行われることを特徴とする請求項4に記載の装置。
- 前記集束光学素子の作動距離を維持し各パルスのアブレーションの深さを記録しながら、レーザのエネルギー及び/又はレーザの波長を連続的に調整することによって、前記試料の水分量、引張強度及び表面上昇の分散を補正する、自動化されたフィードバック機構をさらに備えることを特徴とする請求項4又は5に記載の装置。
- LAESI-MSが前記試料内の目標分子からイオンを検出し、前記イオンは、薬剤、染料、爆薬又は爆薬残留物、麻薬、重合体、化学兵器及びその特性、ペプチド、代謝物、脂質、オリゴ糖類、蛋白質及び他の生体分子、合成有機物、薬物、並びに有毒化学物質を含むがこれらに限定されない群から選択されることを特徴とする請求項4又は5に記載の装置。
- 質量分析法による試料の直接的な化学分析のための方法であって、
試料に赤外LAESI質量分析法を受けさせるステップを含み、
前記試料は、薬剤、染料、爆薬、麻薬、重合体、組織試料及び生体分子からなる群から選択され、LAESI-MSはLAESI-MS装置を試料に対して直接使用して行われ、前記試料は従来のMS前処理を必要とせず、大気圧下で行われることを特徴とする方法。
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